光谱法研究野漆树苷与人血清蛋白的结合作用
光谱法研究根皮苷与人血清白蛋白相互作用
光谱法研究根皮苷与人血清白蛋白相互作用摘要：在模拟生理条件下，采用荧光光谱、紫外光谱和同步荧光光谱法研究了根皮苷(Phlorizin) 与人血清白蛋白（HSA）的相互作用。
结果表明：根皮苷能使HSA发生内源荧光猝灭，属静态猝灭机理。
在293K、303K和313K下，根皮苷与HSA的结合常数分别为3.163 5×105、1.774 8×105、1.193 5×105 L∙mol-1∙s-1，结合位点数n近似为1；热力学分析表明根皮苷与HSA间的结合力为氢键及范德华力；根据Förster非辐射能量转移理论求得二者结合距离为3.97 nm；同步荧光光谱表明根皮苷主要与HSA中的色氨酸残基发生相互作用，改变色氨酸周围的局部构象；金属离子的介入会影响根皮苷与HSA的结合能力。
关键词：根皮苷；人血清白蛋白；荧光猝灭；热力学参数Study on Interaction between Phlorizin and Human SerumAlbumin by Spectroscopic MethodsAbstract: The interaction of Phlorizin with human serum albumin (HSA) was studied by fluorescence spectrometry, UV-Visible absorption spectrometry and synchronous fluorescence spectrometry. The results showed that Phlorizin could induced an endogenous fluorescence quenching of HSA under a mechanism of static quenching. The binding constants were determined to be 3.163 5×105(293K), 1.774 8×105 (303K) and 1.193 5×105(313K), respectively. The binding site (n) was about 1. The thermodynamic parameters suggested that the interaction forces between Phlorizin and HSA were mainly hydrogen and vander waals force., The binding distance was estimated to be 3.97 nm according to Förster nonradiation energy transfer mechanism. The results synchronous fluorescence spectra of Phlorizin-HAS system showed that Phlorizin mainly interacted with tryptophan in HSA, leading to a local change in protein conformation. In addition, the addition of the common ions could affected the binding constant of Phlorizin-HSA complex.Key words: phlorizin; human serum albumin; fluorescence quenching; thermodynamic parameter根皮苷(Phlorizin)是一种具有明显生物活性的天然化合物，其化学成分是1-(2-(β-D-吡喃葡萄糖氧基)-4,6-二羟基苯基)-3-(4-羟基苯基)-丙酮，主要从苹果、苹果树皮及叶中提取而得。
近红外光谱法快速测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷的含量
近红外光谱法快速测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷的含量刘佳明;陈洁;张恩蓓;麦荣阳;周颖
【期刊名称】《中南农业科技》
【年(卷),期】2023(44)2
【摘要】为了建立近红外光谱分别测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷的定量模型快速检测方法,采用高效液相色谱法测定31批化橘红样品中柚皮苷和野漆树苷的含量并作为参考值,利用近红外光谱技术采集化橘红样品光谱图,2种成分的原始谱图分别经多元散射校正和一阶导数加矢量归一化预处理,结合偏最小二乘法和交叉验证法分析,将近红外光谱图与含量参考值进行关联,建立快速测定化橘红中柚皮苷和野漆树苷的定量模型。
结果表明,建立的柚皮苷和野漆树苷含量校正模型的决定系数(R^(2))分别为92.08%和91.02%,校正集的内部交叉均方差(RMSECV)分别为0.247和0.050,建模谱段分别为6101.9~5446.2 cm^(-1)和6101.9~4597.6 cm^(-1),Rank均为10。
该方法建立的定量分析模型测定速度快、预测精度高,操作简单、环保,可作为化橘红中柚皮苷和野漆树苷的快速检测方法。
【总页数】6页(P58-62)
【作者】刘佳明;陈洁;张恩蓓;麦荣阳;周颖
【作者单位】玉林市食品药品检验检测中心/玉林中药材(含香辛料)质量检测与评价工程技术研究中心
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1;O657.33
【相关文献】
1.化橘红中柚皮苷与野漆树苷的化学成分鉴别
2.近红外光谱法快速测定化橘红中柚皮苷的含量
3.化橘红中柚皮苷、柚皮芸香苷、野漆树苷和柚皮素的HPLC测定
4.化橘红中野漆树苷的含量测定
5.反相高效液相色谱法测定化橘红中野漆树苷的含量
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
荧光光谱法研究木犀草素及其苷与牛血清白蛋白的相互作用
Ｗ ＡＮＧ Ｙｏ ｎ ｇ ，ＱＩ ＮＧ Ｗｅ ｉ ｘ ｉ ａ ，ＺＨＵ Ｊ ｉ ｎ ｈ ｕ ａ ，Ｌ Ｉ Ｕ Ｘｉ ｕ ｈ ｕ ａ
（ １ ． Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ｏ ｆ Ｅ ｎ ｖ ｉ ｒ ｏ ｎ ｍｅ ｎ ｔ ａ ｌ ａ ｎ ｄ Ａｎ ａ ｌ ｙ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ，Ｃ ｏ ｌ ｌ ｅ ｇ ｅ ｏ ｆ Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ａ ｎ ｄ Ｃ ｈ ｅ ｍｉ ｃ ａ ｌ Ｅ ｎ ｇ ｉ ｎ ｅ ｅ ｒ ｉ ｎ ｇ ，
ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｌ ｕ ｔ ｅ ｏ ｌ ｉ ｎ ａ ｎ ｄ ｌ ｕ ｔ ｅ ｏ ｌ ｉ ｎ － ７ — — Ｏ－ ｐ — — Ｄ— — ｇ ｌ ｕ ｃ ｏ ｓ ｉ ｄ ｅ ｗｉ ｔ ｈ Ｂ Ｓ Ａ ｗｅ ｒ ｅ ｓ ｔ ｒ ｏ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｉ ｒ ｆ ｌ ｕ ｏ ・ ・
Ｈｅ ｎ ａ ｎ Ｕｎｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｋａ ｎ ｇ ４ ７５ ０ ０ ４，Ｈ ｅ ｎ ａ ｎ ，Ｃｈｉ ｎ ａ；２． Ｍｅ ｄｉ ｃ ａｌ Ｃｏ ｌ ｌ ｅ ｇｅ ，Ｈ ｅ ｎ ａ ｎ Ｕｎ ｉ ｖ ｅ ｒ ｓ ｉ ｔ ｙ，Ｋａ ｎ ｇ ４７ ５ ０ ０ ４，Ｈｅ ｎ ａ ｎ，Ｃｈ ｉ ｎ ａ）
近 年来 ， 药 物小 分 子 与血 清 白蛋 白分 子 之 间 的 相 互作 用 的研 究 引起 人 们 的 广 泛 关 注¨ １ ］ ， 通 过 研 究， 可 以从分 子水 平 了解 药 物 小 分 子 在 血 浆 中的贮 存、 运输 等 重 要信 息 ．目前 ， 荧 光光 谱 法 是研 究 血 清 白蛋 白与药 物 小 分 子 相互 作 用 的 重要 手 段 ］ ． 通 过研 究 血清 白蛋 白内源 性荧 光光 谱 的变化 情 况可 以 快速、 直 观地 了解血 清 白蛋 白与 药 物 小 分 子 相 互 作
《连翘化学成分的提取分离及连翘苷及其苷元和人血清白蛋白的相互作用研究》
《连翘化学成分的提取分离及连翘苷及其苷元和人血清白蛋白的相互作用研究》连翘化学成分的提取分离及连翘苷及其苷元与人血清白蛋白的相互作用研究一、引言连翘，作为一种传统的中药材，具有广泛的药理作用和重要的医疗价值。
其主要有效成分连翘苷及其苷元是多种化学物质中的重要代表，在多种药理学效应中起到关键作用。
本篇论文主要就如何有效地从连翘中提取分离这些重要化学成分以及其与人血清白蛋白（HSA）之间的相互作用进行研究，为深入研究连翘的药理机制和临床应用提供基础理论支持。
二、连翘化学成分的提取与分离（一）提取方法在提取连翘中的化学成分时，主要采用溶剂提取法。
溶剂的选择应考虑到其对目标成分的溶解性以及在后续处理中的稳定性等因素。
常见的溶剂包括水、醇类、酮类等。
在实验中，我们采用乙醇作为提取溶剂，通过浸泡、搅拌和过滤等步骤进行提取。
（二）分离方法在提取得到连翘提取物后，需要进行分离纯化以得到连翘苷及其苷元等目标成分。
常用的分离方法包括薄层色谱法、高效液相色谱法、柱层析法等。
其中，柱层析法具有较好的分离效果和重复性，我们主要采用该方法进行分离纯化。
三、连翘苷及其苷元与人血清白蛋白的相互作用研究（一）实验原理人血清白蛋白（HSA）是血浆中最主要的蛋白质，对药物等物质的运输和代谢起到重要作用。
因此，研究连翘苷及其苷元与HSA的相互作用对于理解其药理机制具有重要意义。
我们通过荧光光谱法、紫外光谱法等方法研究其相互作用。
（二）实验方法与结果1. 荧光光谱法：通过测定HSA的荧光强度变化，了解其与连翘苷及苷元的结合情况。
结果显示，HSA与连翘苷及苷元结合后荧光强度明显变化，说明其有相互作用。
2. 紫外光谱法：通过测定不同浓度的连翘苷及苷元与HSA的混合物紫外光谱的变化，研究其结合情况。
实验发现，随着连翘苷及苷元浓度的增加，HSA的紫外吸收峰发生明显变化，进一步证实了其相互作用的存在。
3. 计算分析：通过计算机模拟计算连翘苷及苷元与HSA的结合位点、结合模式等信息，为进一步研究其相互作用提供理论支持。
光谱法研究山柰酚与牛血清白蛋白的相互作用
光谱法研究山柰酚与牛血清白蛋白的相互作用裘兰兰;李悦;林锐;何华;朱鸣阳【摘要】目的利用荧光光谱研究了山柰酚与BSA之间的相互作用.方法利用Stern-Volmer方程,计算山柰酚分子与牛血清白蛋白的出双分子碰撞猝灭常数Kq 和静态猝灭结合常数Ka.结果双分子碰撞猝灭常数Kq分别为15.20×1012L/(mol·s)(298K),13.41×1012L/(mol·s)(310K),10.70×1012L/(mol·s)(318 K),静态猝灭结合常数Ka分别为3.491×105L/mol(298 K),8.183×105 L/mol(310 K),11.35×105 L/mol(318 K),并能形成一个结合位点.结论中药小分子山柰酚分子确实与牛血清白蛋白结合,且通过静态猝灭的方式对BSA的内源荧光进行猝灭.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】3页(P175-177)【关键词】光谱法;山柰酚;牛血清白蛋白;相互作用【作者】裘兰兰;李悦;林锐;何华;朱鸣阳【作者单位】盐城卫生职业技术学院盐城,224005;中国药科大学分析化学教研室,南京210009;盐城卫生职业技术学院盐城,224005;中国药科大学分析化学教研室,南京210009;中国药科大学天然药物国家重点实验室,南京210009;中国药科大学分析化学教研室,南京210009【正文语种】中文【中图分类】R631山柰酚(kaempferol),化学名为3,4',5,7-四羟基黄酮,来源于姜科植物山柰、小檗科植物窝儿七等多种植物的根茎、全草及干燥成熟果实中(见图1)［1-2］。
近年来,山柰酚因其显著的药理作用及良好的生物利用度了广大医药工作者的关注,在临床上表现为具有抗菌、止咳、支气管炎、糖尿病、白内障、抗癌、抗癫痫、抗氧化剂、解痉、抗溃疡、利胆利尿等［3-5］。
光谱法研究刺芒柄花素与牛血清白蛋白的相互作用
分 布 、 除 以及通 过 改 变血 液 组 织 或组 织 中游 离 药 清 物浓 度来 影 响药 效 。 因此 ， 究 药 物 与血 清 白蛋 白 研 的结合 作 用 对 理 解 药 物 的 作 用 机 制 具 有 重 要 意 义 Ｊ 。本 文采 用 荧 光 光 谱 法 和 紫 外 吸 收 光 谱 法 研
恒温 槽装 置 ） Ｓ 合 肥博 美 生 物 科 技 有 限公 司 ， 。Ｂ Ａ（ 纯度 ９ ％ ， 子量 ６ ０ ） ９ 分 ８００ 用二 次 水 配 制 成 １７ ．６×
１ ｏｏ ・ 和 ５ ０×１ ｍ ｌ Ｌ ０～ｔ ｌ Ｌ ． ０～ ｏ ・ 储 备液 ， （ 于 １
～
４）℃ 冰 箱 中保 存 。刺 芒 柄 花 素 用 乙 醇 配 制 成
及 苯丙 氨酸 残基 的荧 光猝 灭 ， 以在 很多 情 况下 ， 所 蛋
白质 的荧 光 光谱 似 乎 只 显 示 色 氨 酸 的 荧 光 ， 峰 值 其
在 ３ ０ ｎ 左 右 。 实 验 研 究 了 ２ ８ ３ ２ ３ ６ Ｋ ３ ５ ｍ ９ 、０ 、０
个 不 同温度 下 ， 芒柄 花 素对 Ｂ Ａ荧 光 的猝 灭 作 用 刺 Ｓ （ 实验 方法 部分 ） 图 ２为 ２ ８Ｋ时 的荧 光 光谱 ， 见 。 ９ 从 图 中可 以看 出在 固定 Ｂ Ａ 浓度 条 件 下 ， Ｓ 随着 刺 芒 柄 花素浓 度 的增 加 ， Ｓ 的最 大 荧 光 发 射 峰 逐 渐 降 ＢＡ
以及 刺芒 柄花 素对 牛血清 白蛋 白构 象 的影响 。
ｎ 人射 和发 射 狭 缝 宽 均 为 １ ｍ， 录 ２ ０～６ ０ ｍ， ０ａ 记 ５ ０ ａ 的发射荧 光 光 谱 。分 别 在 ３ ２ ３ ６ Ｋ 温度 条 件 ｍ ０ 、０
荧光光谱法研究雷公藤总生物碱与牛血清蛋白的相互作用
荧光光谱法研究雷公藤总生物碱与牛血清蛋白的相互作用陶慧林;朱仕毅
【期刊名称】《分析化学》
【年(卷),期】2009(037)0z1
【摘要】@@ 大多数药物在血浆中都或多或少地与血清蛋白结合,这对药物在体内的代谢、分布及药理作用的发挥产生重要影响~([1]).雷公藤中的倍半萜类生物碱,具有明显的免疫抑制作用,也是治疗类风湿性关节炎的有效成分~([2]).本实验采用荧光光谱法,研究牛血清白蛋白(BSA)与雷公藤总生物碱(TAT)之间的相互作用.【总页数】1页(P156)
【作者】陶慧林;朱仕毅
【作者单位】桂林理工大学化学与生物工程学院,桂林,541004;桂林理工大学化学与生物工程学院,桂林,541004
【正文语种】中文
【相关文献】
1.荧光光谱法研究雷公藤总生物碱与牛血清蛋白的相互作用 [J], 陶慧林;朱仕毅
2.异戊烯根皮苷与牛血清蛋白相互作用的荧光光谱法研究 [J], 董华强;张英慧;黄剑波;刘富来;林凯
3.荧光光谱法研究6-姜酚与牛血清蛋白的相互作用 [J], 向云亚;徐晶晶
4.质谱法和荧光光谱法研究多库酯钠与牛血清蛋白相互作用 [J], 杜超;林荣坤;杭纬
5.荧光法研究两面针总生物碱与牛血清蛋白的相互作用 [J], 陶慧林;刘帅涛;黎舒怀;徐铭泽;梁胜斌
因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
光谱法结合分子模拟表征脱氧土大黄苷与血清白蛋白的分子作用机制
光谱法结合分子模拟表征脱氧土大黄苷与血清白蛋白的分子作用机制目的：研究中药活性成分脱氧土大黄苷（desoxyrhaponticin，DES）与人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）的分子作用机制。
方法：模拟生理条件下，计算机模拟技术结合荧光光谱法和紫外光谱研究药物与蛋白质的结合机制。
结果：分子模拟建立DES与HSA的结合模型，表明维持药物与蛋白质的相互作用力主要是疏水作用力，兼有氢键作用。
光谱实验表明DES与HSA的相互作用表现为动态结合过程，结合强度较强，DES与HSA分子的结合距离r值较小，说明发生了能量转移现象。
DES对HSA的结构域微区构象产生影响，使结合位域的疏水性发生改变。
荧光相图技术解析出DES与HSA反应构象型态的变迁为“二态”模型。
HSA与DES互作的热力学参数表明DES与HSA之间是以疏水作用为主的分子间作用。
荧光偏振定量证明了HSA与DES相互作用过程中生成了非共价复合物。
结论：光谱实验与计算机模拟结果一致，可为研究DES与HSA 相互作用本质提供一定参考。
标签：脱氧土大黄苷；人血清白蛋白；光谱实验；分子模拟血清白蛋白具有贮运内源代谢产物和外源药物分子等重要生理功能[1]。
血清白蛋白相对分子质量较小，溶解性较大、稳定性较好、与配体具有较好的亲和性，易于分离、提纯且其三级结构已知，是理想的模型蛋白质分子。
人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）[2]为585个氨基酸残基组成的单肽链蛋白质，其氨基酸全序列含有35个半胱氨酸残基，形成17对二硫键和一个自由的半胱氨酸残基，二硫键中有8对组成交叉二硫键，只有接近N端的是单个二硫键。
HSA 含有18个酪氨酸残基，在214位上含有一个色氨酸残基，N端为天冬氨酸残基，C端为亮氨酸残基。
分析生理条件下药物与HSA的相互作用可以获得药物的药效学信息，深入阐明药物输送机制，也有助于为药物分析提供理论参考，此是具有意义的工作。
光谱法研究几种中药小分子与牛血清蛋白相互作用的开题报告
光谱法研究几种中药小分子与牛血清蛋白相互作用的开题报告一、研究背景随着中药学的发展，越来越多的中药被用于治疗不同种类的疾病。
中草药中的小分子化合物是其起作用的重要成分，这些化合物能够与蛋白质相互作用，从而影响生物体内相关的生物过程。
因此，研究小分子与蛋白质之间的相互作用对于深入了解中草药的作用机理具有重要意义。
牛血清蛋白是一种具有免疫调节和免疫调控功能的重要蛋白质，其在免疫学、药学等领域得到广泛应用。
研究小分子与牛血清蛋白的相互作用可以为新药物的研发提供有价值的信息。
光谱法是一种常用的研究小分子与蛋白质相互作用的方法。
光谱法既包括吸收光谱、荧光光谱，还包括紫外光谱、红外光谱等。
因此，通过光谱法研究几种中药小分子与牛血清蛋白相互作用，可以为深入研究中草药的作用机理和新药物的研发提供有价值的信息。
二、研究目的本研究旨在通过光谱法研究几种中药小分子与牛血清蛋白相互作用，探究其相互作用机理。
三、研究内容及方法1. 研究内容本研究将选择几种中药中的小分子化合物，通过光谱法研究其与牛血清蛋白的相互作用，包括吸收光谱、荧光光谱、紫外光谱、红外光谱等。
2. 研究方法（1）实验药物的制备和检测：选择几种中药中的小分子化合物作为实验药物，制备不同浓度的药物溶液，并经过不同的检测方法鉴定纯度。
（2）蛋白质的制备和检测：采用牛血清蛋白作为研究对象，制备不同浓度的蛋白质溶液，并经过不同的检测方法鉴定纯度。
（3）光谱法研究：将实验药物和蛋白质混合后进行光谱法研究，包括吸收光谱、荧光光谱、紫外光谱、红外光谱等。
通过比较药物与蛋白质混合后的光谱和单独的药物和蛋白质的光谱，探究其相互作用机理。
四、研究意义本研究可以从光谱学的角度，对几种中草药中的小分子化合物与牛血清蛋白的相互作用进行研究，为深入了解中草药作用机理及新药物的研发提供有益的参考。
此外，本研究的结果也有助于推动中草药的现代化、产业化及国际化发展。
野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用及机制探究
野漆树苷对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用及机制探究宋小欣;韩凌;李宇邦;陈家兰;林励;李海波;肖凤霞【期刊名称】《河南师范大学学报：自然科学版》【年(卷),期】2018(46)2【摘要】目的:探究野漆树苷(Rhoifolin,RHO)对细菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞炎症模型释放炎性因子的影响,并探讨其作用机制.方法:用脂多糖(0.5μg·mL^(-1))刺激体外生长良好的RAW264.7细胞24h建立体外细胞炎症模型,以MTT法测定不同浓度RHO对RAW264.7细胞的毒性作用,用Griess试剂法检测一氧化氮(Nitric Oxide NO)的含量,RT-PCR法检测细胞中肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor,TNF-α),白介素1β(Interleukin-1β,IL^(-1)β),白介素6(Interleukin,IL-6)的含量,采用Western Blot法检测MAPK信号通路中相关蛋白的含量.结果:与空白对照组相比,在LPS诱导下,RAW264.7细胞分泌致炎因子NO,TNF-α,IL^(-1)β,IL-6(P<0.01);与模型组相比,25~100μmol·L^(-1)的RHO可明显下调LPS诱导的RAW264.7细胞释放炎症因子NO,TNF-α,IL^(-1)β和IL-6(P<0.05,P<0.01),并呈现良好的剂量依赖关系;野漆树苷还不同程度的抑制了Erk和JNK激酶的磷酸化.结论:RHO可以抑制LPS所致的RAW264.7细胞炎症反应,减少炎症因子NO分泌,抑制TNF-α,IL^(-1)β和IL-6mRNA的合成,抑制JNK/SAPK及Erk信号通路可能是其抗炎作用机制之一.【总页数】6页(P84-88)【关键词】野漆树苷;脂多糖;肿瘤坏死因子α;白介素1β;白介素6【作者】宋小欣;韩凌;李宇邦;陈家兰;林励;李海波;肖凤霞【作者单位】广州中医药大学中药学院;广东省中医院;化州市正源堂化橘红实业有限公司【正文语种】中文【中图分类】R285.5【相关文献】1.阿江榄仁酸对LPS诱导的小鼠RAW264.7巨噬细胞的抗炎作用初步研究 [J], 权洪峰;闫欣;彭晓东2.栀子苷干预LPS诱导RAW264.7巨噬细胞炎性反应递质的研究 [J], 纪雯婷;尹湘君;刘姝伶;张海霞;王雪茜;魏玮3.圆齿野鸦椿果实总黄酮对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应的抑制作用 [J], 陈路遥; 邹小兴; 丁卉; 苏超茹; 梁婷婷; 黄维4.草乌甲素对LPS诱导的RAW264.7细胞抗炎作用及相关机制研究 [J], 孙甜; 吕业超; 唐小牛; 湛孝东; 姜玉新5.靛玉红、色胺酮对LPS诱导RAW264.7炎症细胞模型的抗炎作用研究 [J], 刘丽娟;王允亮;许树青;魏仕兵;李军祥因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
网络出版时间：2012－10－2916：58网络出版地址：http ：//www．cnki．net /kcms /detail /34．1086．R．20121029．1658．033．html◇实验方法学◇光谱法研究野漆树苷与人血清蛋白的结合作用邓少东，帅欧，林励，肖凤霞，卓嘉琳（广州中医药大学中药学院，广东广州510006）收稿日期：2012－06－29修回日期：2012－08－07基金项目：国家科技支撑计划项目（No 2011BAI01B02）作者简介：邓少东（1986－），男，博士生，研究方向：中药资源开发利用与新药研究，E-mail ：59543177@qq．com ；林励（1954－），男，研究员，博士生导师，研究方向：中药资源开发利用与新药研究，通讯作者，Tel ：020-********，E-mail ：LL76611@yahoo．com．cndoi ：10．3969/j．issn．1001－1978．2012．11．033文献标志码：A 文章编号：1001－1978（2012）11－1620－04中国图书分类号：R284.1；R341.21；R977.6摘要：目的研究野漆树苷与人血清蛋白（HSA ）的结合作用及机制。
方法通过光谱法研究野漆树苷与HSA 的作用机制。
以能量传递原理及Lineweaver-Burk 双倒数方程计算野漆树苷与HSA 反应的结合常数和结合距离；以热力学参数判断其与HSA 间的作用力类型；以同步荧光光谱考察野漆树苷对HSA 构象的影响。
结果野漆树苷与HSA 反应的结合常数随温度的升高而降低；野漆树苷与HSA 之间的结合距离为4.16nm ；野漆树苷与HSA 的互相作用以氢键和范德华力结合为主；酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰随野漆树苷浓度的增加而产生猝灭。
结论野漆树苷能与HSA 结合，其荧光猝灭以静态猝灭为主。
关键词：野漆树苷；人血清白蛋白；结合作用；荧光猝灭；热力学参数；同步荧光光谱血清蛋白（SA ）是血液中重要的运输蛋白，药物进入机体后首先与血清蛋白结合，通过血浆的存储和运输，到达受体部位产生药理作用，是药物发挥药效的重要载体和靶分子。
SA 在紫外光激发下，分子具有较强的内源荧光发射，也可与多种内源和外源性物质结合而使其荧光光谱有所变化［1］。
探讨具有药理活性的小分子与SA 的作用机制，对阐明药物在体内的分布与代谢过程以及了解药物发挥药效的作用机制有重要意义［2－3］。
野漆树苷为化橘红、山香圆叶等中药中的黄酮类活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗登革热及促进胰岛素受体磷酸化等作用［4－6］。
近年，关于野漆树苷的研究越来越多，已被收录为2010年版中国药典一部山香圆叶及其制剂山香圆片的含量测定用对照品［7］，但迄今未见野漆树苷与人血清蛋白（HSA ）之间相互作用的报道，为此作者开展了本项研究，以期为野漆树苷在临床上合理应用提供理论参考。
1材料1．1仪器F-2500型荧光分光光度计（日本HITACHI ）；CARY-50型紫外－可见分光光度计（美国VARIAN ）；BP211D 型电子天平（德国Sartorius 公司）；DKB-501A 型超级恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；Genpure 超纯水系统（德国TKA 公司）；PHB-3型PH 计（上海三信仪表厂）。
1．2试药野漆树苷（自制，纯度99.32%），精密称取适量溶于50%甲醇/水中，配制成浓度为2.576mmol ·L －1的溶液；Tris-盐酸缓冲液（上海双螺旋生物科技，批号K0810A ），精密量取适量加入超纯水，稀释成50mmol ·L－1（pH 7.4）的缓冲液；HSA （广州威佳科技，纯度95%，批号70024-90-7），精密称取适量用上述缓冲液配制成0．01036mmol ·L －1的溶液；实验用水均为超纯水。
2方法2．1光谱扫描在220 800nm 范围内，测定HSA 溶液的激发光谱和发射光谱，得Ex =280nm ，Em =336nm 。
在5ml 具塞试管中，各加入1．9ml HSA 溶液，分别加入0.0、8.0、16.0、24.0、32.0、40.0、48.0、56.0、64.0、72.0、80.0、88.0、96.0μl 的野漆树苷溶液，用移液枪加Tris-盐酸缓冲液至2.00ml ，将温度分别调至25ħ、37ħ，激发和发射光谱狭缝宽度均为5.0nm ，进行荧光光谱扫描，记录野漆树苷对HSA 的荧光猝灭光谱图，同时记录Δλ=15nm 与Δλ=60nm 的同步荧光光谱；紫外－可见分光光度计测定与HSA 相同浓度的野漆树苷在290 500nm 范围内的紫外吸收光谱。
2．2猝灭机制确定及猝灭常数的计算根据Stern-Volmer 方程和Lineweaver-Burk 双倒数方程判断野漆树苷的荧光猝灭机制［8］。
Stern-Volmer 方程：F 0/F =1+K q τ0［Q ］=1+K SV ［Q ］（1）Lineweaver-Burk 双倒数方程：lg ［（F 0－F ）/F ］=lg K a +n lg ［Q ］（2）式中F 0、F 分别为未加和加入猝灭剂时HSA 的荧光强度。
K q 为双分子猝灭速率常数，［Q ］为猝灭剂的浓度，τ0为不存在猝灭剂时荧光分子平均寿命（约为10－8s ），K SV 为动态猝灭常数，K a 为静态猝灭常数，n 为结合位点数。
2．3结合距离的测定根据Foster 能量转移原理［9］，当化合物满足以下条件时会发生非辐射能量转移：供能体发射荧光；供能体荧光发射光谱与受能体吸收光谱有足够的重叠；供能体与受能体之间的结合距离不超过7nm 。
能量转移效率E 与结合距离r 之间的关系：·0261·中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin 2012Nov ；28（11）：1620 3E=R60/（R6+r6）=1－F/F（3）R6=8.8ˑ10－25K2N－4ΦJ（4）E为能量转移效率，R为能量转移效率为50%时的临界距离，r为供能体与受能体之间的距离，F为HSA浓度与药物浓度为1ʒ1时HSA的荧光强度，K2为供能体－受能体偶极空间取向因子，N为介质的折射指数，Φ为HSA的荧光量子产率，J为供能体的发射光谱与受能体的吸收光谱的重叠积分。
J=（∑Fλελλ4Δλ）/∑FλΔλ（5）其中，Fλ是供能体在波长λ处的荧光强度，ελ是受能体在波长λ处的摩尔吸光系数，Δλ为计算时分割的波长跨度。
根据HSA荧光发射光谱与野漆树苷吸收光谱的叠加图，把光谱重叠部分分割成很小的矩形，依据式（5）求得野漆树苷与HSA的重叠积分，将J值及K2、n、Ф值代入式（4），即可求出临界距离R，计算中K2、n、Ф分别取2/3、1.336、0.118。
能量转移效率E可由E=1－F/F求出，最后得出HSA与野漆树苷之间的结合距离。
2．4作用力类型的确定有机小分子和HSA之间的结合力主要包括氢键、范德华力、静电引力、疏水作用力等［10］。
根据反应前后热力学参数焓变（ΔH）和熵变（ΔS）的相对大小，可以判断小分子与蛋白质间的主要作用力类型，ΔH＞0、ΔS＞0为典型的疏水作用力；ΔH＜0、ΔS＜0为氢键和范德华力；ΔH＜0、ΔS＞0为静电作用力。
根据热力学关系式，计算野漆树苷与HSA相互作用的热力学参数，从而判断作用力类型。
K1、K2分别为在T1、T2温度下野漆树苷与HSA的结合常数，R为气体常数约等于8.314。
lnK2/K1=（1/T1－1/T2）ΔH/R（6）ΔG=ΔH－TΔS（7）ΔG=－RT lnK（8）2．5同步荧光光谱的测定固定HSA浓度为1ˑ10－5mol ·L－1，改变野漆树苷浓度测定△λ分别为15nm和60nm 的同步荧光光谱。
3结果3．1野漆树苷对HSA荧光光谱的影响HSA的荧光光谱能反映HSA分子中氨基酸残基所处微环境及其分布情况、蛋白质高级结构［11］。
Fig1显示：随着加入野漆树苷浓度的增加，336nm处HSA的最大荧光发射峰逐渐降低。
野漆树苷仅引起HSA内在荧光有规律的猝灭，并未出现明显的发射波长红移、蓝移或峰形改变。
3．2野漆树苷对HSA内在荧光猝灭的机制探讨以F/F对［Q］作图（Fig2）得KSV 与Kq，以lg［（F－F）/F］对lg［Q］作图（Fig3），得出药物与HSA的结合常数Ka和结合位点数n。
根据KSV 与Ka随温度的变化可以对猝灭机制进行判断［12］。
对于动态猝灭，温度升高有利于猝灭过程进行，K SV随温度的升高而增大；而静态猝灭，温度升高形成的复合物稳定性降低，Ka随温度的升高而减小。
由Tab1发现，野漆树苷的Ka都随温度升高而降低，Kq值均远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大动态猝灭速率常数2.0ˑ1010L·mol－1·s－1［13］，表明野漆树苷对HSA的荧光猝灭作用主要是其分子与HSA的Trp残基结合形成了某种特定结构的超分子复合物所引起的静态猝灭。
Fig1Effect of rhoifolin on fluorescence spectraof HSA at37ħC HSA≈1ˑ10－5mol·L－1in all cases．Peak from up to downC rhoifolin≈（0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，12.0）ˑ10－5mol·L－13．3野漆树苷与HSA的结合距离根据HSA荧光发射光谱与野漆树苷吸收光谱的叠加图（Fig4），计算得出HSA与野漆树苷之间的结合距离为4.16nm，小于7nm。
说明HSA（供能体）与野漆树苷（受能体）之间发生非辐射能量转移，推测其对HSA内在荧光的猝灭可能是通过分子间的能量转移而引起的。
3．4野漆树苷与HSA的作用力类型根据热力学公式，计算野漆树苷与HSA相互作用的热力学参数，见Tab2。
由Tab2可知，野漆树苷与HSA的互相作用是氢键和范德华力结合为主的自发过程。
3．5野漆树苷对HSA同步荧光光谱的影响△λ=15nm和△λ=60nm的同步荧光光谱分别显示酪氨酸残基和色氨酸残基特征［14］。
芳香氨基酸残基的最大发射波长与其所处环境极性有关，由发射波长的改变可判断HSA中芳香氨基酸残基所处微环境的变化。
最大发射波长红移，表明芳香氨基酸残基所处微环境的疏水性降低，极性增强；蓝移则表明微环境的疏水性增强，极性降低。
Tab1Fitting parameters of the interaction between HSA and rhoifolin at different temperatureT/ħStern-VolmerK q/（L·mol－1·s－1）K sv/（L·mol－1）RLineweaver-BurkK a/（L·mol－1）R nrhoifolin 256．14ˑ10116．14ˑ1030．99041．31ˑ1050．98861．33 374．44ˑ10114．44ˑ1030．98827．41ˑ1040．99000．52·1261·中国药理学通报Chinese Pharmacological Bulletin2012Nov；28（11）同步荧光光谱（Fig 5）测定结果表明酪氨酸残基和色氨酸残基的特征荧光光谱峰均随野漆树苷浓度的增加而产生猝灭，野漆树苷的色氨酸残基和酪氨酸残基光谱最大发射波长基本没变，表明对应的HSA 中色氨酸残基和酪氨酸残基附近的微环境并未改变。