内蒙古天然牧草青贮氨态氮、有机酸含量的测定方法(一)
利用HPLC法测定王草青贮饲料中的有机酸
利用HPLC法测定王草青贮饲料中的有机酸张英;周汉林;刘国道;王坚【摘要】A HPLC method was established and optimized to determinate lactic acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid in king grass silage. Qualitative and quantitative analyses of the four organic acids were done by HPLC-UVD using gradient elution program with 20mmol/LNaH2PO4/H3PO4 (pH2.65) and methanol. Results showed there was good linear relationships of the four organic acids. The correlation coefficients were above 0.999 4 in the range of 0.015-2.25 mg/mL, the precision and stability were less than 5%, the sample recovery was ranged in88.44%~114.51%, the detection limit of lactic acid, acetic acid, propionic acid and butyric acid was 1.40, 3.31, 3.57, 5.23 μg/L, respectively. The method was simple, accurate and reproducible, and suitable for the determination of organic acids in king grass silage.%建立并优化了测定王草青贮饲料中乳酸(LA)、乙酸(AA)、丙酸(PA)、丁酸(BA)的高效液相色谱检测方法.采用20 mmol/L NaH2PO4/H3PO4(pH2.65)-甲醇二元梯度洗脱程序在高效液相色谱-紫外检测器上完成4种有机酸的定性定量分析.结果表明,4种有机酸在0.015～2.25 mg/mL范围内的线性关系较好,相关系数R2≥0.999 4,精密度、稳定性的RSD均小于5％,样品回收率在88.44％～114.51％,LA、AA、PA、BA的检出限分别是1.40、3.31、3.57、5.23 μg/L.该方法简单、准确、重复性好,可用于王草青贮饲料中有机酸测定.【期刊名称】《热带作物学报》【年(卷),期】2013(034)002【总页数】5页(P377-381)【关键词】王草;青贮;高效液相色谱法;有机酸【作者】张英;周汉林;刘国道;王坚【作者单位】海南大学农学院,海南儋州 571737【正文语种】中文【中图分类】R927.2王草[Pennisetum purpureum Schumacher×P.glaucum（Linnaeus）R.Brown]是由象草（P.purpureum Schumach.）与美洲狼尾草[P.glaucum（L.）R.Br.]杂交的多年生禾本科（Poaceae）狼尾草属（Pennisetum Richard）牧草，是一种优质的热带牧草品种[1]。
气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸
苜蓿青贮之后， 原料中的可溶性糖等在植物酶或 微 生物 作 用下， 部 分转 化为 乳 酸、乙 酸 、丙 酸 、丁 酸 等 有机酸使青贮料的 ｐＨ 值下降， 从而抑制有害微生物 的繁殖。因此， 准确测定青贮料中有机酸含量对青贮 品 质 的 评 定 有 重 要 意 义 。以 往 测 定 乳 酸 的 方 法 有 蒸 馏 法、液相色谱法、酶法等， 乙酸、丙酸、丁酸的测定方法 有色谱法、比色法、滴定法等， 相比之下气相色谱法分 析挥发性脂肪酸更加快速、准确、简便， 但是却很少有 同时测定苜蓿青贮料中乳酸和挥发性脂肪酸的方法。 本试验探讨了使用气相色谱法一次性测定青贮料中 的挥发性脂肪酸和乳酸的可行性和准确度。 １ 材料与方法 １．１ 样品浸提液的制备
１．３ 试剂 乙酸 、丙酸 、丁 酸、乳 酸 为色 谱 纯 ， 三 甲 基 乙 酸 作
为内标物， 为分析纯； 四甲基氢氧化铵为 ２５％或 １０％ 的分析纯试剂稀释成 ０．１ ｍｏｌ／ｌ 后使用； Ｎ，Ｎ－ 二甲基乙 酰胺为化学纯； 丙酮为分析纯。 １．４ 有机酸标准溶液的配制
根 据 苜 蓿 青 贮 料 中 的 乳 酸 、乙 酸 、丙 酸 、丁 酸 含 量 分别在样品干物质的 ２０％、１０％、２％、４％之内， 所以分 别取乳酸 １．８１５ ４ ｇ、乙酸 ０．８１７ ４ ｇ、丙酸 ０．１７８ ８ ｇ、丁 酸 ０．３２４ ６ ｇ， 用 ３０％丙酮溶液定容于 ２００ ｍｌ 容量瓶 中， 再 分 别稀 释 为 相 应 浓 度 的 标 准 液 ， 放 在 ４ ℃条 件 下冷藏备用。 １．５ 标样及试样的酯化方法
４０
２０
浓度（ ｍｇ／１００ ｍｌ）
０
５００ ０００
１ ０００ ０００
峰面积
图２ 丙酸
２００ ｙ＝７Ｅ－ ０５ｘ－ １．５９２ １
青贮检测流程
青贮检测流程一、引言青贮是将青饲料在一定条件下进行发酵，以提高饲料的储存期和饲料品质的一种常见方法。
然而，在青贮过程中，由于发酵条件的不同或操作不当，可能会导致青贮饲料中产生一些有害物质，对牲畜的健康产生不良影响。
因此，进行青贮饲料的检测是非常必要的。
二、青贮检测的目的青贮检测的目的是为了评估青贮饲料的质量和安全性，确保其对牲畜的健康无害，并为饲养管理提供科学依据。
三、青贮检测的主要内容青贮检测主要包括饲料成分分析、微生物检测、有毒物质检测等方面。
1. 饲料成分分析饲料成分分析是评估青贮饲料营养价值的重要指标。
主要包括干物质含量、粗蛋白质含量、粗脂肪含量、粗纤维含量、粗灰分含量等指标的测定。
干物质含量反映了青贮饲料的水分含量，而粗蛋白质、粗脂肪、粗纤维和粗灰分则反映了其中的营养成分含量。
通过对这些指标的测定，可以评估青贮饲料的营养价值，为合理饲养提供依据。
2. 微生物检测微生物检测主要是为了评估青贮饲料中微生物的种类和数量，以及饲料是否存在霉变等问题。
常用的微生物检测方法包括菌落总数测定、大肠菌群测定、霉菌测定等。
通过对这些指标的测定，可以评估青贮饲料的微生物质量，判断其是否符合安全标准。
3. 有毒物质检测有毒物质检测是为了评估青贮饲料中有毒物质的含量，以及是否超出安全标准。
常见的有毒物质包括昆虫脂肪酸酯、硝酸盐、亚硝酸盐等。
通过对这些有毒物质的测定，可以评估青贮饲料的安全性，以避免对牲畜造成健康风险。
四、青贮检测的方法青贮检测的方法主要包括实验室分析和现场检测两种。
1. 实验室分析实验室分析是指将采集到的青贮样品送往专业实验室进行饲料成分分析、微生物检测和有毒物质检测等。
这种方法的优点是准确性高、可靠性强，但需要一定的时间和费用。
2. 现场检测现场检测是指在青贮饲料的采集和处理过程中，使用一些快速检测方法对饲料进行评估。
这种方法的优点是操作简便、快速方便，可以在农场等现场进行。
常用的现场检测方法包括干物质测定仪、气相色谱仪、荧光光谱仪等。
气相色谱法测定苜蓿青贮料中的有机酸
，
采用此 方 法 测 定苜蓿
青 贮 料 中有 机 酸 是 较 为 理 想 的 方 法
关键 词
中图分类号
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青 贮 苜 蓿 ；气 相 色谱 ；有 机 酸 ；甲 酯 化
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苜蓿青 贮 之 后 原 料 中的可 溶性 糖 等在植 物 酶 或
微生 物作用下 部分转化为乳酸 乙 酸 丙 酸 丁 酸等
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仪 器 与 色谱 条件
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青贮检测流程
青贮检测流程
青贮检测流程是指对青贮进行检测的步骤和方法。
以下是一般的青贮检测流程：
1. 采样：从青贮储存堆中随机采集一定数量的样品。
采样时要确保样品的代表性，即从不同位置和深度采集样品。
2. 干物质含量测定：将采集到的样品放入烘箱中干燥，确定样品中干物质的含量。
干物质含量可以用来评估青贮的贮存和发酵情况。
3. 酸性物质测定：通过酸碱滴定法或质子化滴定法，测定青贮中的酸性物质（如乳酸、醋酸等）的含量。
酸性物质的含量可以反映青贮的质量和发酵程度。
4. 粗蛋白测定：使用常规的Kjeldahl法、Dumas法或紫外光谱法测定青贮中的粗蛋白质含量。
粗蛋白质含量可以评估青贮的饲用价值。
5. 粗脂肪测定：使用具体化学分析方法测定青贮中的粗脂肪含量。
粗脂肪含量可以评估青贮中的能量含量。
6. 粗纤维测定：使用富弗酸浸提法或酶解法测定青贮中的粗纤维含量。
粗纤维含量可以评估青贮的纤维质量。
7. 维生素和无机盐测定：使用色谱分离、光谱分析或化学滴定法测定青贮中的维生素和无机盐的含量。
8. 微生物测定：通过传统的菌落计数法、PCR方法或测定特定指标菌的含量来评估青贮中的微生物质量。
9. 毒素检测：通过色谱法、质谱法或生物检测方法检测青贮中是否含有毒素（如霉菌毒素等）。
10. 数据分析和报告：将以上各项检测结果进行统计和比较分析，并形成检测报告，以评估青贮的品质和饲料价值。
需要注意的是，以上流程可以根据具体的检测要求和实验室条件进行调整和修改。
铵态氮的测试方法
氮的测试方法1.铵态氮采用靛酚蓝比色法测定硝态氮采用联氨铜还原比色法测定，亚硝态氮采用重氮化偶合分光光度法测定。
氨态氮测定:采用氯化钾浸提一氧化镁蒸馏法;亚硝态氮测定:N一(l一蔡基)乙二胺光度法;硝态氮测定:氯化钾浸提一还原蒸馏法;有机态氮测定:凯氏定氮法。
1.有机氮测定采用硫酸消化一蒸馏法(即凯氏定氮法):无菌移液管移取5mL细菌培养液，加入浓硫酸和催化剂(硫酸铜、硫酸钾)，400℃消化1小时后，凯氏定氮仪中加入40%氢氧化钠蒸馏，4%硼酸液吸收后，0.!m。
l/L盐酸滴定。
有机氮的计算公式为:X=(V，一VZ)xCx14.007x1000/5X—为样品中有机氮含量(m创L);v，—样品消耗盐酸标准液的体积(mL);vZ—空白试验消耗盐酸标准液的体积(mL);C一盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度(Inol/L)。
2.按态氮测定采用蒸馏法:用无菌移液管移取5mL细菌培养液培养液，加IOmL40%氢氧化钠溶液凯氏定氮仪蒸馏，4%硼酸吸收后，用0.lmol/L盐酸滴定，计算含量。
钱态氮的计算公式为:A二(V，一VZ)xCx14.007x1000/5A—为样品中钱态氮含量(m叭);Vl—样品消耗盐酸标准液的体积(mL);vZ—空白试验消耗盐酸标准液的体积(mL);C一盐酸标准溶液通过标定后的摩尔浓度(mol/L)。
3.亚硝酸盐氮测定采用a一蔡胺分光光度法:弱酸条件下:对氨基苯磺酸与a一蔡胺偶合生成紫红色染料，其颜色深度与亚硝酸盐氮含量成正比。
可测定亚硝酸盐氮含量范围在0.05m叭之间，若超过该范围可稀释后测定。
取适量培养液稀释后，依次加入氯化按缓冲液、60%冰乙酸、对氨基苯磺酸和a一禁胺等体积混合液和蒸馏水，于550nm波长下进行比色测定，同时绘制标准曲线，计算含量。
4.硝酸盐氮测定采用磺基水杨酸消化法:在浓硫酸存在下，NO3“能与磺基水杨酸反应，生成硝基水杨酸。
所生成的硝基水杨酸在碱性条件(PH>12.0)条件下，于410nm处有最大吸收;并且，在一定范围内与N03’含量成线性关系。
青贮饲料中有机酸的检测BTB柱后衍生法)
本文介绍了使用日立有机酸分析系统（BTB（＊）柱后衍生法）检测青贮饲料的应用实例，BTB 作为 pH 指示剂，衍生后 酸性成分的洗脱可以使吸收光谱发生变化，在 440 nm 处检测不容易受杂质成分影响，选择性较高。
(＊)BTB ：溴百里酚蓝（Bromothymol Blue）
■ 有机酸分析系统（BTB柱后衍生法）
泵
自动进样
柱温箱
UV-VIS
分析柱
保护柱
泵
流动相
反应液
பைடு நூலகம்
废液
＜色谱条件＞
分析柱 ：GL-C610H-S
7.8 mm I.D.×300 mm
保护柱 ：GL-G-C600
4.0 mm I.D. ×10 mm
流动相 流速
：3mmol/L HClO4 (高氯酸) ：0.5mL/min
柱 温 ：60℃
反应液 ：BTB 溶液
■ 青贮饲料中有机酸的检测（Chromaster BTB 柱后衍生法）
所谓青贮饲料，是以饲料作物或牧草为原料，利用以乳酸菌为首的各种各样的微生物通过发酵而成的家畜储藏饲料， 将原料填满青贮窖并密封，通过厌氧菌的发酵来增加有机酸的含量。由此带来 pH 值的降低，可以抑制造成牧草腐烂的 霉菌或好氧菌类的活动，从而长期保存饲料。青贮饲料是在塔式结构的固定型青贮塔，或圆筒状的青贮窖里发酵制作。 青贮饲料的质量好坏，是从外观、微生物菌种、乳酸、醋酸、酪酸等有机酸的比例、pH 值等多个项目综合判断的结果。
反应液流量：0.6mL/min
检测波长 ：UV 440 nm
进样量 ：20μL
【流程图】
■ 有机酸标准样品和青贮饲料的色谱图（BTB柱后衍生法）
(成分名) 1、乳酸 2、醋酸 3、丙酸 4、n-酪酸 5、n-戊酸
铵态氮测量方法（1）
铵态氮测量方法（1）铵态氮测量方法（2mol?L-1KCl浸提—靛酚蓝比色法）1）方法原理2mol?L-1KCl溶液浸提土壤，把吸附在土壤胶体上的NH4+及水溶性NH4+浸提出来。
土壤浸提液中的铵态氮在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚作用，生成水溶性染料靛酚蓝，溶液的颜色很稳定。
在含氮0.05～0.5mol?L-1的范围内，吸光度与铵态氮含量成正比，可用比色法测定。
2）试剂（1）2mol?L-1KCl溶液称取149.1g氯化钾（KCl，化学纯）溶于水中，稀释至1L。
（2）苯酚溶液称取苯酚（C6H5OH，化学纯）10g和硝基铁氰化钠[Na2Fe(CN)5NO2H2O]100mg稀释至1L。
此试剂不稳定，须贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（3）次氯酸钠碱性溶液称取氢氧化钠（化学纯）10g、磷酸氢二钠（Na2HPO4?7H2O, 化学纯）7.06g、磷酸钠（Na3PO4?12H2O, 化学纯）31.8g和52.5g?L-1次氯酸钠(NaOCl，化学纯，即含10%有效氯的漂白粉溶液)5mL溶于水中，稀释至1L，贮于棕色瓶中，在4℃冰箱中保存。
（4）掩蔽剂将400g?L-1的酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O, 化学纯）与100g?L-1的EDTA二钠盐溶液等体积混合。
每100mL 混合液中加入10 mol?L-1氢氧化钠0.5mL。
（5）2.5μg?mL –1铵态氮（NH4+—N）标准溶液称取干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4，分析纯]0.4717g溶于水中，洗入容量瓶后定容至1L，制备成含铵态氮（N）100μg?mL –1的贮存溶液；使用前将其加水稀释40倍，即配制成含铵态氮（N）2.5μg?mL –1的标准溶液备用。
3）仪器与设备：往复式振荡机、分光光度计。
4）分析步骤（1）浸提称取相当于10.00g干土的新鲜土样（若是风干土，过10号筛）准确到0.01g，置于150mL三角瓶中，加入氯化钾溶液100mL，塞紧塞子，在振荡机上振荡1h。
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内蒙古天然牧草青贮氨态氮、有机酸含量的
测定方法(一)
内蒙古天然牧草是畜牧业的重要资源，其中青贮是一种重要的饲料，
能够为牲畜提供丰富的营养物质。
因此，准确测定青贮的氨态氮和有
机酸含量对于畜牧业的发展至关重要。
一、青贮氨态氮的测定方法：
1.硫酸钠-硫酸盐法：将青贮样品与硫酸钠混合进行短暂火热后与硫酸
盐试剂反应。
通过分析反应产物的浓度，可以计算出氨态氮的含量。
2.菲涅耳直接滴定法：将青贮样品浸泡在PH为9.4的介质中，在液体
表面加入菲涅耳指示剂，并滴加盐酸，直到菲涅耳指示液变色为止，
通过计算盐酸消耗量计算出氨态氮的含量。
3.蒸馏滴定法：将青贮样品与蒸馏水混合后进行蒸馏，并在蒸馏液中
加入酚酞指示液。
分析蒸馏液中氨态氮的含量。
二、青贮有机酸含量的测定方法：
1.高效液相色谱法：将青贮样品摇拌后进行离心分离，得到液体样品。
液相色谱仪通过分析样品中的各种有机酸成分，计算有机酸含量。
2.紫外光谱法：将青贮样品提取后分离，通过紫外光谱仪分析样品中
吸收光谱，得到有机酸的含量。
以上是目前常用的青贮氨态氮和有机酸含量的测定方法，在实际测定
中，可以根据需要选择相应的方法。
总的来说，牧草青贮的氨态氮和有机酸含量对于畜牧业的发展至关重要，科学合理的测定方法能够为牲畜提供优质的饲料，促进畜牧业发展。
因此，在青贮饲料的生产过程中，需要科学合理地进行氨态氮和有机酸含量的测定，并随时调整饲料的配比，提高饲料的营养价值和利用效率。