细胞培养的应用和培养细胞的特性及条件
《细胞培养培训》课件
结
1 细胞培养中的安全问题
在进行细胞培养操作时需要注意一些安全问题，如在安全柜操作，穿戴实验外套和化、功能化和量化方向发展，国内企业正加紧提升技术水 平和产业化水平。
细胞培养培训
细胞培养是生物技术和医学研究中不可或缺的重要技术之一。在本次培训中， 我们将全面介绍细胞培养的基本概念、操作流程和常见问题解决方法。欢迎 大家踊跃参与！
介绍
1 定义
2 重要性
细胞培养是指通过在无菌 环境下加入合适的营养液， 使人类或动物细胞在体外 的人工环境中生长和繁殖 的技术。
细胞培养是研究生命科学 和药物研发不可缺少的技 术。它能够帮助我们理解 细胞的生长、分化、凋亡 和信号传导等基本生理过 程。
2
殖，以获得足够的细胞数量用于实验。 细胞传代技术可以使细胞连续繁殖多代
细胞凋亡是指由一系列信号调控的正常
并保持生物学特性。
细胞死亡程序。在细胞培养中凋亡的部
分或全部细胞可能会影响实验结果。因
此，细胞凋亡检测技术成为了细胞培养
3
细胞培养蛋白表达技术
的重要技术方法。
细胞培养蛋白表达技术是指通过转染外
源性质粒或病毒载体进入细胞，使细胞
3 应用场景
细胞培养技术广泛应用于 基础研究、药物筛选、生 物材料研究、环境毒理学 等领域。
细胞培养的基本概念
细胞种类
主要包括原代细胞、细胞株、酶处理细胞等。不 同种类的细胞具有不同的生长要求，因此对于细 胞的选择要根据科学研究的需要作出选择。
细胞培养的条件
温度、CO2浓度和通气等条件对于细胞培养的影 响非常大。合理的培养条件是保证细胞生长和繁 殖的前提。
细胞培养技术总结
细胞的生长特点
体外培养的细胞，按其生长方式可分为贴壁型和 悬浮型。 贴壁细胞的主要代表是成纤维细胞，一般在接种 后24h内贴壁，刚开始时细胞多呈圆形，随贴 壁时间延长，逐渐伸展成梭形或多边形。传代 后的成纤维细胞12h开始贴壁，24h内完全贴壁。 上皮细胞型、游走细胞型和多形型都属于贴壁 型细胞。 悬浮型细胞包括血液白细胞和癌肿瘤细胞，不需 要附着于底物而于悬浮状态下生长良好。
四、细胞的冻存与复苏
• 细胞冻存和复苏的基本原则：慢冻快融， 可以最大限度的保存细胞活力。 • 目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作 保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的 通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分 渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从 而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。 • 冻存的细胞浓度：正常人的成纤维细胞浓 度： 5×106~1×107细胞/ml
细胞生长的三个阶段
• 潜伏期 ：细胞接种后先悬浮在培养液中，此时细胞 质回缩，胞体呈圆球形，继续培养便开始贴壁， 24h内便可长满瓶壁。 • 对数生长期 ：细胞增殖最旺盛的时期，随细胞数量 不断增多，生长空间逐渐减少，最后细胞互相接触 汇成一片。 • 停滞期：细胞数量达到饱和密度之后，停止增殖， 细胞数量不再增加，但仍有代谢活动，因而培养液 中的营养逐渐耗尽，代谢产物积累，此时需要分离 培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变或者 脱落死亡，故传代应在细胞长满瓶壁80%的时候传 代最好。
注：细胞培养液要贮存在4℃冰箱，避免光照， 试验前放入37℃水浴中温热。
加血清的高糖培养液存放期为六个月，期间 谷氨酰胺会分解，若细胞生长不佳，可以 再添加适量谷氨酰胺。 环境条件：95%空气和5%CO2 的气体； 温度：37℃
三、细胞的消化传代
成纤维细胞生长至高密度时，须分殖至新的培养瓶中， 一般稀释比例为1:3 至1:6。 1.PBS缓冲液、0.25%的胰蛋白酶和含10%的DMEM预先 放入37℃水浴中温热； 2.倒掉培养瓶内旧的培养液，加入4~6ml PBS缓冲液洗 涤残留培养液； 3.加入2~3ml胰蛋白酶，放入37℃ CO2孵箱中消化2~3 分钟，镜检观察，如有细胞间隙变大，细胞质回缩 现象，加入培养液终止消化。 4.用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落制成悬液，加入 离心管中，800rpm离心5min； 5.倾去上清液，加少量培养液重悬细胞，计数后调整 细胞浓度为1×107 /ml，在新的或者灭菌好的培养瓶 加入6ml左右新鲜培养液，将调整好浓度的细胞液 滴入培养瓶中，混匀，做好标记，放入37℃ CO2孵 箱培养。隔天换液。
细胞培养技术在生物医学中的应用
细胞培养技术在生物医学中的应用随着生物医学研究的不断深入，细胞培养技术逐渐成为一个应用广泛且必不可少的技术。
细胞培养技术是指将活体细胞通过合适的营养基、温度、气体和pH等环境条件，进行体外培养和增殖的一种技术。
在生物医学领域，细胞培养技术被广泛应用于药物研究、基因工程、疾病预防和治疗等方面。
一、细胞培养技术在药物研究中的应用药物的研发过程需要大量的药物筛选和临床试验。
细胞培养技术可以通过体外培养肿瘤细胞、细菌或病毒等，进行药物的筛选和毒性评价。
通过细胞培养技术可以模拟人体的生理环境，将待测的药物加入培养基，观察细胞对药物的反应，进而评估药物的安全性和疗效。
此外，利用细胞培养技术还可以研究药物在细胞内的作用机制，从而更好地发现新药物和优化已有药物。
二、细胞培养技术在基因工程中的应用基因工程技术可用于研究生物的基本遗传机制、改良和增加生物的特性。
而细胞培养技术则是基因工程技术最常用的手段。
利用细胞培养技术可以将异种基因导入细胞中，通过改变细胞的生理过程，实现基因转录、翻译、调节等一系列的生物学活动。
例如，利用细胞培养技术可以合成人类蛋白质，用于药物研发或提高生物产量，同时也可以用于研究肿瘤等人类疾病的基因重组和基因治疗。
三、细胞培养技术在疾病预防和治疗中的应用细胞培养技术可以为医学实践提供有用的工具，例如利用细胞培养技术可以制备细胞疫苗。
将一些生长健康的细胞培养起来，使其特异性地转移给免疫系统或直接用于疫苗生产。
该疫苗可诱导机体免疫系统对特定病原体产生免疫保护，从而达到疾病防治的目的。
此外，利用细胞培养技术和基因工程技术可制备重组疫苗、基因疫苗和肿瘤疫苗等，有助于人类预防和治疗各种疾病。
细胞培养技术有着广泛的应用前景，但是在实际操作中存在某些技术难点。
例如，细胞培养环境的优化、细胞品种的选择、培养基和添加剂的优化等都可能影响到细胞培养实验结果的准确性。
因此，在细胞培养技术的应用中，技术人员要严格遵守试验标准，保证实验结果的准确性。
细胞培养技术的应用
细胞培养技术的应用细胞培养是一种研究细胞生长、分化和代谢的重要技术，也是生物学、医学和药学领域的必备技术之一。
随着科学技术的不断发展和进步，细胞培养技术也得到了广泛的应用和推广，其在基础研究、新药研发、临床治疗等方面都发挥着重要的作用。
一、基础研究中的细胞培养技术应用在基础研究中，细胞培养技术既可以作为研究对象，也可以作为研究手段。
人类细胞、动物细胞和植物细胞等都可以通过细胞培养技术进行研究，从而探究细胞的特性、结构、功能等方面的问题。
通过细胞培养技术，科学家们可以对各种细胞进行改造和重组，使其表达或失去某些特定基因，从而研究它们对生命活动和疾病形成的影响。
例如，在研究某种疾病的发生机理时，可以使用细胞培养技术建立人工细胞模型，模拟疾病的发生过程，以便深入研究疾病的发生机制和治疗方法。
此外，细胞培养技术还可以用于增殖和维持特定细胞株，方便进行后续实验研究。
细胞培养技术还可以应用于生物药物的研发和生产过程中。
在生物药物的研究和生产中，细胞培养技术不仅可以用于检测分子结构和表达的功能等信息，还可以用于评估其安全性和有效性等方面的问题。
二、细胞培养技术在新药研发中的应用在新药研发中，细胞培养技术可以用于筛选药物和评估其药效、毒性和安全性等方面。
药物的研发过程中需要大量的体内实验和临床试验，但这些过程时间长、成本高、灵敏度低等问题，而利用细胞培养技术可以在体外模拟体内环境，通过快速、可重复的实验验证药物作用。
此外，细胞培养技术可以用于开发新的药物运载系统和控制释放药物的技术。
例如，通过细胞培养技术研究和开发长效、定向、可控释放等药物运载系统，可以提高药物的治疗效果和减少不良反应等问题。
三、细胞培养技术在临床治疗中的应用细胞培养技术在临床治疗中应用较为广泛的是细胞治疗。
细胞治疗是通过培养患者本体细胞或体外培养的干细胞，经处理后再移植到患者体内进行疾病治疗的一种治疗方法。
例如，通过细胞培养技术对干细胞进行体外培养、分化和扩增等处理后，可以制备出适合患者的干细胞，并在移植回体内后发挥治疗作用，从而实现组织修复、再生或替代治疗等目的。
细胞培养技术与应用
细胞培养技术与应用细胞培养技术是生物科技领域的重要组成部分，其应用范围广泛，涉及医学、农业、食品工业、环境保护等多个领域。
本文将简单介绍细胞培养技术的基本原理、分类、常见技术及应用。
一、细胞培养技术的基本原理细胞是生物体内组成单位，是生物学研究的基本对象。
细胞培养技术是指将生物体内的细胞从组织或器官中分离出来，放入含有必需营养物质和适当环境的培养基中，进行生长、增殖和分化的一种技术。
培养基是一种液态或固态的生物学培养用基质，其中含有细胞生长所需的各种营养物质、维生素、微量元素和生长因子等，而无菌的操作条件、适当的pH值和氧气浓度以及温度和湿度的控制，也是细胞培养过程中必须关心的问题。
细胞培养技术的基本原理就是通过对培养基中培养的细胞进行试验和分析，研究细胞生长、增殖、分化和功能等方面的问题。
二、细胞培养技术的分类细胞培养技术的分类主要依据种类、来源、形态等特性，可分为以下几类：1.原代细胞培养（Primary cell culture）此类培养为第一次从组织或器官中分离的细胞，具有原代细胞特征，具有细胞衰老限制，常能增殖到35-60倍，适于生物学仿真实验的研究；2.细胞株培养（Cell line culture）细胞株是长期经连续传代而获得的细胞世代，可分为稳定细胞株和不稳定细胞株。
稳定细胞株经多次传代后，还能保持原始形态和功能，代表性细胞株有HeLa、CHO、Vero等，常用于药理学、生物学及生物工程等领域中进行研究；3.二次扩增或转染细胞培养（Secondary cell culture）此类培养为从原代细胞或细胞株中分离后通过扩增或转染处理的细胞。
常用于细胞毒性实验、用于表达蛋白质、病毒、植物和昆虫细胞的重组蛋白等；4.三维细胞培养（3D Cell culture）此类培养方式为采用特殊的培养基和培养方法，使细胞形成三维组织结构。
其应用领域涉及人体组织再生医学、肝内药代动力学等。
5.定量检测型细胞培养（qPCR and ELISA）此类培养突出利用优化的细胞培养条件，量化检测细胞中与特定指标相关的分子量、酶活性、基因表达等，是常用于诊断、监测疾病和药效评估的技术。
细胞培养-原代培养-传代培养
鼠胎组织细胞原代培养
换液：
全量换液和半量换液
换液时机的选择：
培养液pH值：细胞生长旺盛，代谢产生酸性物质积累增多， pH值下降，营养液酸化变黄，。 细胞状态
细胞换液
细胞传代
细胞传代方法
根据细胞生长的恃点，传代方法有3种。 1.悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。 2 半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。
红色表示中性pH 黄色代表酸性pH 紫色表示碱性pH
在一些特殊培养液中不含酚红
酚红
水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml
01
细胞原代培养
02
细胞换液与传代
03
细胞冻存与复苏
三、细胞培养基本技术
取材：用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。把整个孕鼠浸入盛有75％乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒的剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒的剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污
01
碳酸氢钠 2.0 g
02
03
加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌。
04
调节pH值至7.2
细胞培养技术的应用与发展
细胞培养技术的应用与发展细胞培养技术已经成为了现代生命科学研究的重要工具之一，随着技术的不断发展与创新，其在医学、工业、农业等领域中的应用越来越广泛。
本文将从细胞培养技术的基本原理、应用及未来发展趋势等方面进行论述。
一、细胞培养技术的基本原理细胞培养技术是指通过体外培养的方式，使细胞在相对理想的营养、温度、氧气、二氧化碳、水分等条件下生长、繁殖和分化，并保持其生物学的特性。
具体而言，细胞培养技术包括以下几个方面。
1. 细胞的来源细胞培养的第一步是选择合适的细胞来源，包括原代细胞、细胞系和细胞株。
其中原代细胞是从组织或器官中分离出的未经连续培养的细胞；细胞系是一组经连续次传代和分离的细胞，具有特定的生物学特性；细胞株则是从细胞系中特定的细胞分离而来，保留了一定程度的细胞特性。
2. 细胞的培养条件对于不同的细胞类型，其生长繁殖的最适温度、培养基成分、营养物质、生长因子等条件也不尽相同。
因此，在细胞培养过程中，需要根据具体的需求设计出最适合细胞生长的培养条件，保证其能够正常生长繁殖，并保持特定的生物学特性。
3. 细胞的分离和传代在细胞培养中，细胞的分离和传代也是非常重要的环节。
细胞分离的目的是把细胞从组织或器官中分离出来，单独培养；而细胞的传代则是指将已经培养的细胞分割成两个或多个部分，继续培养，保持其生长繁殖的能力。
二、细胞培养技术的应用1. 医学领域细胞培养技术在医学领域中的应用广泛，例如用于研究人类生理、病理以及药物毒性等方面。
此外，细胞培养技术还可以用于制备干细胞和肿瘤细胞等细胞种，以供疾病治疗或药物研发之用。
在肿瘤治疗方面，细胞培养技术可以用于研究肿瘤细胞的特性以及药物对肿瘤细胞的作用机制，为临床治疗提供参考。
2. 工业领域在工业领域中，细胞培养技术也被广泛应用于生物制品的生产过程中。
例如，在生物药品的制备过程中，细胞培养技术可以用来制造细胞培养物，这是制备生物制品的重要步骤。
3. 农业领域在农业领域中，细胞培养技术可以被用作繁殖和改良农业作物。
细胞培养的特点
细胞培养的特点细胞培养是指将活体细胞从体内或体外取出并放入适宜的培养基中，提供合适的营养物质和生长条件，使细胞在体外继续生长、分裂和繁殖的一种技术。
细胞培养是现代生物医学研究中不可或缺的重要手段，具有以下几个特点。
细胞培养具有无限的增殖能力。
在适宜的培养条件下，细胞可以持续增殖，形成细胞群落。
这种无限增殖的特性使得细胞培养成为大规模细胞产量的有效手段，可以满足人们对大量活细胞的需求。
细胞培养具有较高的细胞纯度。
通过选择性培养基和适当的培养条件，可以使特定类型的细胞优势生长，而抑制其他类型的细胞生长。
这样可以得到相对纯净的细胞种群，方便后续的实验研究和应用。
细胞培养具有较高的可控性。
在细胞培养过程中，可以根据需要调节培养基的成分、温度、气体浓度等因素，从而控制细胞的生长速度、分裂周期和细胞功能的表达。
这种可控性使得细胞培养成为研究细胞生物学和生物医学的重要工具。
细胞培养还具有较强的稳定性。
在适宜的培养条件下，细胞可以稳定地生长、分裂和繁殖，保持其遗传特性和生物学功能。
这种稳定性使得细胞培养可以长期保存，方便进行长期的实验观察和研究。
细胞培养的特点使得它在多个领域得到广泛应用。
首先，在生物医学研究中，细胞培养可以用于疾病机制的研究、新药筛选和基因治疗等方面。
通过培养病人的细胞或动物模型中的细胞，可以模拟疾病的发生和发展过程，研究疾病的分子机制，为疾病的诊断和治疗提供理论依据。
同时，细胞培养还可以用于筛选和评估新药的毒性和疗效，加快药物研发的速度。
此外，通过将修饰后的基因导入细胞中，还可以研究基因的功能和调控机制，为基因治疗的发展提供理论和实验基础。
在生物工程领域，细胞培养可以用于生物制药的生产。
通过培养工程菌或哺乳动物细胞，可以大规模生产重组蛋白、抗体等生物药物。
细胞培养技术的应用可以提高生物药物的产量和纯度，降低生产成本，满足人们对高质量生物药物的需求。
细胞培养还可以用于组织工程和再生医学研究。
通过细胞培养，可以获得大量的干细胞和多能干细胞，这些细胞具有分化为各种细胞类型的潜力。
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动物细胞的环境敏感性
动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些， 其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。
动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因 素都会影响动物细胞存活。
动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。
1. 动物细胞培养的环境要求
1）无污染环境 2）温度
昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力 强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件 下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时 后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。
5）渗透压
动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题：
培养基的渗透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗 透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细 胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。
细 胞 培 养
主要讲3方面问题：
为什么要做细胞培养？ 培养细胞的特性 细胞在体外生长的基本条件
培养条件下细胞的特性
离体培养的动物细胞可分为：
贴壁依赖型(anchorage-dependent) 非贴壁依赖型(anchorage-independent) 兼性贴壁细胞
1）贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上 皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。
2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需
要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。 当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围 的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加， 这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。Fra bibliotek3）pH
动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8 或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死 亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一 般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强 的忍耐性。
4）气体环境及溶氧
一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生 长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将 导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基 的氧气和CO2的平衡。