核酸非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
电泳技术-聚丙烯酰胺凝胶电泳
.电泳技术.第一节第二节电泳技术概述常见电泳技术.常见电泳技术第二节纸电泳和醋酸纤维薄膜电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳梯度凝胶电泳等电聚焦电泳二维聚丙烯酰胺凝胶电泳印迹电泳毛细管电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺(m ethylene-bisacrylamide,简称Bis)在加速剂和催化剂的作用下聚合并联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳。
polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE.PAGE应用围广，可用于蛋白质、酶、核酸等的分离、定性、定量及少量的制备，测定相对分子质量、等电点等。
.1、聚丙烯酰胺凝胶的特点①可用于分离不同分子量的生物大分子聚丙烯酰胺凝胶的特点②更高的灵敏度：10－9～10－12 mol/L③化学惰性好，电泳时不会产生“电渗”④电泳分离的重复性好⑤透明度好，便于照相和复印⑥机械强度好，有弹性，便于操作和保存.⑦无紫外吸收⑧可用作固定化酶的惰性载体2、凝胶聚合的原理及有关特性（1）聚合反应凝胶单体丙烯酰胺加速剂四甲基乙二胺AcrTEMED交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺Bis催化剂过硫酸铵(AP) 或核黄素.（2）凝胶孔径的可调性及其有关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系T(Acr和Bis总浓度)（%）= C(交联剂百分比)（%）= abmbab100100其中a=Acr克数，b=Bis克数，m=缓冲液体积(mL)a/b(W/W)与凝胶的机械性能密切相关a/b＞100 a/b=30 凝胶脆易碎，坚硬呈乳白色凝胶呈糊状，易于断裂完全透明而又有弹性C=6.5−0.3T不同浓度的单体对凝胶性能影响很大，Davis的实验发现Acr＜2%，Bis＜0.5%，凝胶就不能聚合。
当增加Acr浓度时要适当降低Bis的浓度。
药典聚丙烯酰胺凝胶电泳
药典聚丙烯酰胺凝胶电泳（Pharmaceutical Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称Pharm PGAE）是一种用于药学和生物制剂分析的电泳技术。
这种电泳方法主要用于分离和检测药品和生物制剂中的蛋白质、多肽、核酸和其他生物大分子。
Pharm PGAE在药物研发、质量控制和生物制剂生产等领域起到了至关重要的作用。
下面将详细探讨Pharm PGAE的原理、步骤、应用和优势。
### 原理：Pharm PGAE的原理基于凝胶电泳的基本原理，即在凝胶介质中通过电场作用，根据生物大分子的大小、形状和电荷进行迁移分离。
这种技术采用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过改变凝胶的浓度和电场的强度来实现对不同生物大分子的高效分离。
### 步骤：1. **制备凝胶：** 使用聚丙烯酰胺（Polyacrylamide）和交联剂（crosslinker）制备凝胶。
凝胶的浓度和孔隙度会影响分离效果，通常根据样品的性质进行优化选择。
2. **样品处理：** 样品通常需要在电泳前进行处理，如加入蛋白负载缓冲剂、热变性处理等，以确保最佳的电泳效果。
3. **加载样品：** 将处理好的样品加载到凝胶孔中。
加载的位置和数量取决于需要分离的生物大分子种类和数量。
4. **电泳分离：** 将凝胶浸泡在缓冲液中，然后施加电场。
生物大分子根据其大小和电荷在凝胶中迁移，最终形成带状图案。
分离的速度与电场的强度、凝胶浓度以及生物大分子的电荷和大小有关。
5. **染色与检测：** 完成电泳后，需要将凝胶染色以可视化分离的生物大分子。
染色剂的选择取决于要检测的生物大分子类型。
例如，蛋白质通常使用银染或共染色，核酸则使用荧光染料如乙溴铵溴化物（Ethidium Bromide）等。
6. **图像分析：** 利用成像设备（如凝胶文献仪）获取凝胶图像，然后使用专业软件进行带状图案的分析和生物大分子的定量。
### 应用：Pharm PGAE在药学和生物制剂领域有广泛的应用：1. **药物质量控制：** 用于分析药品中的蛋白质、多肽和其他生物大分子成分，确保药物的质量符合规定标准。
聚丙烯酰胺凝胶电泳的用途
聚丙烯酰胺凝胶电泳的用途
聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的技术，包括蛋白质、DNA、RNA等。
其主要用途如下：
1. 分离和分析蛋白质：聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于分离和定量蛋白质。
在电泳过程中，蛋白质由于不同的电荷、大小和形状在凝胶中运动速度不同，可通过染色或免疫染色等方法进行分析和鉴定。
2. 分离和分析DNA和RNA：聚丙烯酰胺凝胶电泳也可用于分离和分析DNA 和RNA。
在电泳过程中，核酸分子由于大小、电荷、结构等因素的差异对电场响应不同，从而可以分离出不同大小的DNA和RNA分子，也可通过染色或杂交探针等方法进行分析和鉴定。
3. 检测基因突变和基因多态性：聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于检测基因突变和基因多态性。
例如，单核苷酸多态性（SNP）分析常用的方法之一就是聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过分析DNA中的不同基因型类型，可以确定是否存在某种基因突变或多态性。
4. 用于药物研发和疾病诊断：聚丙烯酰胺凝胶电泳可用于药物研发和疾病诊断。
例如，可通过分析各种蛋白质的表达差异来识别新型蛋白质标记物，辅助药物开发和疾病早期诊断。
聚丙烯酰胺凝胶电泳实验
聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
核酸凝胶电泳.终
二· 聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为 1~1000kb）
三· 脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bp的 DNA大分子）
前言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于 分离· 鉴定和纯化DNA或 RNA片段。
核酸凝胶电泳的基本原理
凝胶电泳的原理比较简单。当一种带电分子放在电场 当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。带点 分子在电场作用下的移动速度，称之为电泳迁移率，它 同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比。 也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的静电荷越 多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使 用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质， 从而将电泳分子的对流运动降低到极低，使电泳分子的 移动速度与其分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是 分子大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小 的不同、构型或形状的差异，以及所带净电荷的多寡， 便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成 分彼此分离开来。
2.限制酶消化
（1）25ul 10x反应缓冲液，30U 限制酶，加 双蒸馏水至250ul混匀。
（2）取一个凝胶块置其中，合适温度下过夜 后，用TE缓冲液洗涤并贮存。
3.应用PFGE对样品DNA进行分析
（1）用0.5xTBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂 糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用 Wide Mini-Sub Cell进行电泳的话，50ml该溶液即 可。
2.非变性聚丙烯酰胺凝胶（native-PAGE）
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为 活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件 下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。使生物大分子 在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，尤其是在电 泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活 性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，用于双链DNA 片段的分离于纯化。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis,PAGE)聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acrylamide,Acr)单体相互聚合成多条长链，再与N,N-甲叉双丙烯酰胺(methylene-bisacrylamide,Bis)在引发剂和加速剂的作用下交联而成的凝聚胶多孔聚合物。
凝胶孔径的大小可通过控制单体和交联剂的浓度来调节，从而满足不同分子量物质的分离要求。
不同浓度的聚丙烯酰胺非变性凝胶的有效分离范围如表所示：表1 DNA在聚丙烯酰胺凝胶中的有效分离范围丙稀酰胺[%(w/v)]a有效分离范围（bp）二甲苯青FF b溴酚蓝b3.51000－2000 460 1005.080－500 260 658.060－400 160 4512.040－200 70 2015.025－150 60 1520.0 6－100 45 12a．N,N′-亚甲双丙稀酰胺占丙稀酰胺浓度的1/30b．给出的数字是迁移率与染料相同的双链DNA片段的粗略大小（核苷酸对）。
聚丙烯酰胺凝胶的制备和电泳都比琼脂糖凝胶更为费事。
聚丙烯酰胺凝胶几乎总是铺于两块玻璃板之间，两块玻璃板由间隔片隔开冰封以绝缘胶布。
在这种配置形式下，大多数丙烯酰胺溶液不会与空气接触，所以氧对聚合的抑制仅限于凝胶顶部的一个窄层里。
聚丙烯酰胺凝胶一律是进行垂直电泳，根据分离的需要，其长度可以在10-100cm之间。
聚丙烯酰胺凝胶与琼脂糖凝胶相比有3个主要优点：（1）分辨力强，长度仅仅相差０.2%（即500bp中的1bp）的DNA分子即可分开;(2)所能装载的DNA分子量远远琼脂糖凝胶：多达10μg的DNA可以加样于聚丙烯酰胺凝胶的一个标准样品槽（1cm×1mm）而不致显著影响分辨力；(3)从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高，可适用于要求最高的实验（如鼠胚胎微注射）。
常用的是两种聚丙烯酰胺凝胶：（1）用于分离和纯化双链DNA片段非变性聚丙烯酰胺凝胶（2）用于分离、纯化单链DNA的变性聚丙烯酰胺凝胶非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳【原理】非变性聚丙烯酰胺凝胶用于分离和纯化小分子双链DNA片段（<1 000bp），多数双链DNA在此胶中的迁移率大略与其大小的对数值成反比，但迁移率也受碱基组成和序列的影响，同等大小的DNA分子可能由于空间结构的不同而使迁移率相差10％，故不能用它来确定双链DNA 的大小。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）技术是一种常用的生物分子电泳分
离技术，它可以用来分离、鉴定、分析不同分子量的碱基链，以及抗
原和抗体。
PAGE是通过聚丙烯酰胺凝胶作为分离层来分离和分析物质
的一种电泳技术，具有灵活性好、精密度高等优点，一直被应用于生
物学研究中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）作为生物分子电泳的基础技术，用
于分离纯化各种类型的微缩生物，包括蛋白质，核酸和糖苷。
由于这
种技术具有灵活性强、精密度高，一直广泛应用于多学科领域。
分离Pakage包括多个步骤，包括以下几种步骤:样品制备、电泳、高压灌注、凝胶固定等。
PAGE技术的工作原理是利用水相中分子在凝胶中受到质子交换效应、静电力场和电迁移矢量力的影响，使不同分子类型在空间上形成
不同分布，进而可以检测出不同分子类型的特征。
聚丙烯酰胺凝胶的
特点是可以用来分离和分析多种组分，而且可以快速、灵活、有效地
分离出不同的分子，可以用来分析多种环境和生物样本中的物质。
PAGE技术在生物研究中具有重要现实价值，使用PAGE可以快速、精准地检测出各种生物体中不同类型的碱基链和抗原抗体。
另外，PAGE的质量控制指标相当严格，可以保证对检测结果的精准度。
由此
可见，这种PAGE技术在分离物质方面有无可比拟的优势，受到了生物
学研究的广泛应用。
核酸电泳方法
核酸电泳是一种分离核酸的方法，主要包括琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
以下是两种核酸电泳方法的介绍：
1.琼脂糖凝胶电泳：
（1）将琼脂糖在所需缓冲液中加热熔化成清澈、透明的溶胶，然后倒入胶模中，凝固后将形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。
（2）将凝胶置电场中，在中性pH值下带电荷的核酸通过凝胶网孔向阳极迁移，迁移速率受到核酸的分子大小、构象、琼脂糖浓度、所加电压、电场、电泳缓冲液、嵌入染料的量等因素影响。
（3）在不同条件下电泳适当时间后，大小、构象不同的核酸片段将处在凝胶不同位置上，从而达到分离的目的。
（4）凝胶的制备和电泳操作方法包括以下步骤：选择琼脂糖、配制缓冲液、加热熔化琼脂糖、灌制凝胶、电泳、染色和观察。
2.聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：
（1）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和交联剂聚乙烯吡咯烷酮（PVP）在催化剂作用下形成的三维网状结构。
该凝胶具有孔径大小适合核酸分离，且与样品间无反应的特点。
可通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的核酸。
（2）凝胶电泳常用于分离蛋白质，例如SDS-PAGE技术是常用的蛋白表达分析技术之一。
它根据检体中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
在大肠杆菌表达纯化外源蛋白的实验中，SDS-PAGE 是必不可少的操作步骤。
（3）聚丙烯酰胺凝胶电泳适用于分离同工酶及其亚型、大分子核酸等。
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试剂等
电泳仪、电泳槽、电泳玻璃板（数套）、鲨鱼齿（67空，数条）、边条（数对）、加样枪（1ml、5ml、10μl、100μl、200μl）、脱色摇床、合适大小的托盘数个95%乙醇、冰醋酸、纱布、医用胶布、剥离硅烷和亲和硅烷（鼎国）、10% APS （过硫酸铵）（液体状试剂一周内有效）、TEMED、40%丙烯酰胺（19:1，上海生工）、尿素（进口，amresco），未注明的均为国产分析纯试剂
试剂配制
亲和硅烷：加10μl Bind-Silane（亲和硅烷）于1ml含10μl醋酸的95%乙醇中，混匀后备用。
（涂玻璃板用）
固定/脱色液：10%乙醇，蒸馏水配置（可重复用）
硝化液：15ml硝酸/L蒸馏水
染色液：1g AgNO3/L蒸馏水
显色液：30 g Na2CO3/L蒸馏水（温度不可高，否则显色背景深；可预冷，预冷后可延长显色时间，有助于减轻显色背景，一般情况时室温即可，显色约需3～5min）
终止显色液：10%冰醋酸
电泳用的TAE用蒸馏水配制，制胶用的所有试剂均用双蒸水配制。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳
制胶及电泳
（1）胶板的准备：首先确定两块玻璃板是否平整，用去污剂和清水将玻璃板洗涤干净，并用蒸馏水冲洗，晾干后用95%乙醇擦拭。
1 用1～
2 ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭干净、均匀；（以平整、光滑的一面为正面）（第一次用的玻璃板最好擦2～3次）
2 用加样枪取1ml配置好的亲和硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（第一次用的玻璃板最好用亲和硅烷擦2～3次）
3 用加样枪取0.5～1ml配置好的剥离硅烷均匀分布于长玻璃的正面，用纱布涂抹均匀；（擦至感觉特别光滑为止）
4 用1ml 95%的乙醇依次将长玻璃和短玻璃的正面擦拭均匀；（可使亲和硅烷和剥离硅烷分布更未均匀，也可擦去多余部分）
5 检查玻璃板正面有误纱布绒毛之类的异物，若有，可吹走；取0.4mm的边条，用纱布擦净，置于长玻璃板的左右两侧，靠边放置，将短玻璃板压于长玻璃板上，调整边条和短玻璃板的位置，使边条刚好处于边缘位置，但不突出，且长短玻璃板刚好对其，用夹子固定住玻璃板的两侧；以1×TAE配制1%琼脂糖凝胶并封住玻璃板底部，待凝胶凝固后用医用胶带密封；将玻璃板凹槽向上小角度倾斜放置，准备灌胶。
（2）制胶：称取尿素21g，加入17ml双蒸水加热约二三十秒溶解，待冷却后加入10ml 5×TBE，冰浴至冰手时加入7.5ml 40%丙烯酰胺（19:1），然后加入225μl 10%过硫酸铵和50μl TEMED，快速混匀，准备灌胶。
（3）灌胶：用5ml加样枪将制备好的胶液沿玻璃板中部缓慢加入到胶板玻璃板之间的空隙，注意不能在胶中形成气泡（要多次实验以掌握技巧、控制加样速度、调节玻璃板倾斜度、手按、竖起玻璃板、便轻敲变加样等）。
胶灌满后，将鲨鱼齿的平端插入胶液下5mm左右（不可过深，以免后面不能加样；也不可过浅，以免上样量过小），同时防止梳齿平端下方出现气泡，于室温下静置2h，使胶完全聚合后使用。
（4）预电泳：撕去胶布，两端平行用力拔出梳齿，将玻璃板和梳齿上的多余凝胶擦洗干净，用蒸馏水漂洗玻璃板、梳子。
将玻璃板装到电泳槽上，在下方电泳槽中加入1×TBE至没过玻璃板下端约1cm，装好电泳槽，加入1×TBE至没过玻璃板上端约1.5cm处，用梳齿刮去玻璃板间隙间的碎胶，再用5ml加样枪将其吹干净，反转梳齿，将鲨鱼齿插入凝胶胶面下约0.5mm，并用夹子夹紧，梳齿间空隙即为加样孔。
120w恒功率，预电泳30min。
（5）点样：点样前用加样枪吹吸每个上样槽，将梳齿间隙间油状液体吸干净，以利于样品更好的沉降。
把DNA样品与上样缓冲液混合，每个加样孔加5~7μl
的扩增产物。
（6）电泳：140-160w恒功率电泳，待溴酚蓝至胶的四分之三处时（大约需要1.5~2h），终止电泳，回收电泳液（可重复用一段时间，当发现电压下降很多时要更换电泳液，或者补加蒸馏水可继续用一段时间），取下胶板，将两块玻璃板轻轻分开，凝胶留在长玻璃板上。
银染
（1）固定（脱色）：在托盘1中加入1L固定/脱色液，将有胶的玻璃板胶面向上放入托盘中，置于脱色摇床上低速摇6～10min。
（2）洗胶：在托盘2中用1L蒸馏水漂洗凝胶约10s。
（3）硝化：在托盘3中用1L硝化液硝化凝胶5min。
（4）洗胶：继续在托盘2中漂洗凝胶10s。
（5）染色：在托盘4内加入1L染色液，将胶板放入托盘中低速摇15min。
（6）显影：从染色液中取出胶板，立即将胶板置于显色液中低速摇至显色，直至胶上所有的条带都出现。
（7）定影（终止显色）：从显影液中取出胶板放入终止液中约1min以终止显色。
（8）洗胶：将胶板置于自来水下冲洗正反面直至干净。
（9）干胶：室温下自然干燥，记录实验结果，并用扫描仪或相机记录结果。