DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理,步骤和结果分析
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。
在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。
二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。
2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。
3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。
4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。
5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。
三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。
在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。
根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。
综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。
通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方PAGE步骤1、清洗：1）戴上胶手套，将事先用NaOH溶液浸泡2—4h后的亲水板取出，用热水及洗涤剂刷洗需要使用的一面。
用试管刷轻刷，一般洗三次左右，直至干净，洗净后，置于通风橱风干。
取疏水板洗净后，置于通风橱风干。
（注意：洗的时候亲水板和疏水板要分开，所用刷子也要分开。
）2）用无尘纸沾取少量无水乙醇，擦净亲水版和疏水板，分别2次，风干。
2、硅化：倒亲水硅烷与亲水版上，轻涂，使其均匀涂抹（可先画圈然后上下刮擦），倒疏水硅烷与疏水板上，轻涂，使其均匀涂抹。
将两板置于通风橱中硅化15min以上。
3、装板：将疏水板置于下方，两边置隔离带，亲水版扣上，使端部齐平，立放；卡好两边卡子，固定好，取底座，上好板子，旋紧，平放。
手动调节水平。
4、制胶：1）准备好梳子、针筒、枪和枪头，在量筒中加入适量PAG，加入适量TEMED和APS。
立即混匀，迅速吸入针筒，注射器垂直注入胶板，倒插梳子，排除气泡，等待其凝固，大约需时20—30min。
（期间可向PCR产物中加入SGB）2）取出倒插的梳子，刮去废胶，用热水冲洗，前后上好电泳槽。
3）1×TBE缓冲液于电泳槽中预热半个小时，排除气泡。
插梳子，点样3.5ul。
5、电泳：45℃,75W，1h左右。
电泳完后取板，取胶，取梳子。
6、染色：1）固定：3L蒸馏水，20ml冰乙酸，400ml乙醇，在摇床上震荡5min。
2）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
3）染色：2L蒸馏水，5gAgNO3(可反复利用)，在摇床上震荡12min。
4）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
5）显色：2L蒸馏水，60gNaOH，8ml甲醛，在摇床上震荡直至显色，但是显色时间最好在15min以内。
6）用弱水冲洗3—5min，晾干观察，最后统计记录。
6﹪ PAGESGB 10ml (棕色瓶存放)去离子甲酰胺10ml二甲苯氰（FF）10mg溴酚蓝（含蔗糖）10mgEDTA（0.5mol/L，PH=8.0）200ulAPS(2.5﹪)2.5gAPS(过硫酸铵)，100ml水（一周之内用完）亲水硅烷（100ml 0.5﹪Bind-Silane）500ul Bind-Silane+500ul冰乙酸+99.5ml无水乙醇剥离硅烷（50ml 2﹪Repel-Silane）49ml氯仿+1mlRepel-Silane,混合后室温保存PAGE上样Loading Buffer(3×SGB)98﹪甲酰胺、0.025﹪二甲苯氰、0.025﹪溴酚蓝、10mmoL/L EDTA0.5mol/L EDTA29.225gEDTA溶于200mlddH2O中。
DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染方法的探讨_李其松
H e ilong jiang A ni m a l Sc ience an d V e te r in a ry M ed ic in e
10 2006
要远, 同样有利于基因型的判断。 目前 , 许多实验室 PCR 扩增的片段主要采用琼 脂糖电泳、 EB 染色。在琼脂糖中用 EB 染色可检测 出少于 10 ng 的 DNA, 但琼脂糖电泳的分辨率较低 , 对有些试验不太适用。聚丙烯酰胺的分离效果较好 , 但如果用 EB 染色 , 聚丙烯酰胺淬灭 EB 的 荧光, 使 EB 染色的 灵敏 度降 低, 不能 检测 出少 于 10 ng 的 DNA。另外, EB 染色容易产生污染。用 EB 染色后 , 只能用照片记录试验结果, 而不能把试验结果及时保 存下来为以后的试验做参考和指导。试验采取了银 染的方法 , 同时在试验中我们将染色 的方法作了改 进。这种方法可提 高灵敏度 5 ~ 10 倍 , 而且避免了 EB 的污染及紫外光对人眼睛和皮肤的损伤 , 并缩短 了银染的时间。同时改进的染色方法与其他方法相 比具有操作时间短、 背景颜色浅、 操作程序简单、 灵敏 度高、 染色液容易保存等优点。 高浓度、 高交联度的凝胶中不同的 DNA 分子条 带更易分开, 条带清晰, 利于判型; 低浓度、 低交联度 的凝胶中 , 同一电泳道中的多个条带之间的绝对距离 更远, 同样利于不同基因型的判断, 每位试验者应该 根据自己的试验适时调整试验方法, 同时选择简单方 便的染色方法 , 可以收到事半功倍的效果。 ( 009)
收稿日期 : 2005 09 19 作者简介 : 李其松 ( 1981 ) , 男 , 硕士研究生 . 通讯作者 : 王金玉 ( 1952 ) , 男 , 教授 , 硕士 , 博士生导师 .
图 3 14% 的胶
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)的分类有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native （CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。
在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。
然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。
随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。
蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。
这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。
1. Blue Native PAGEBlue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。
是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。
这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。
Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。
在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在pH7.5条件下也会向阴极迁移。
但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。
并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。
1.2 Clear Native PAGEClear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
DNA的银染
（下列加液量以刚好覆盖凝胶为宜）
电泳完毕后，撬开玻璃板，将粘有凝胶的玻璃板置于塑料盘（ 不要碰凝胶表面！）
用蒸馏水漂洗两次，并取出玻璃板 去水后，用10%乙醇进行凝胶固定 10 min，轻摇 去乙醇，水洗、加入1%硝酸，轻摇5min 吸出硝酸，用蒸馏水漂洗2次
加入0.2%硝酸银溶液，轻摇20min 蒸馏水漂洗3次 去水后，加入显色液，在非直射光线下观察显色 观察区带出现，效果最佳时移除显色液 加入3%乙酸，轻摇5min 移除3%的乙酸溶液，10%乙醇洗涤1次 观察结果
聚丙烯酰胺凝胶中DNA的银染
原理
在弱酸环境下银离子可以与DNA结合，碱性甲
醛溶液可以将结合的银离子还原成金属银，显影成
DNA非变性PAGE胶 试剂及其功能：
10%乙醇 1%硝酸 0.2%硝酸银 显色液（3% Na2CO3，1%甲醛，新鲜配制）
3%乙酸
实验操作及注意事项
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步骤
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DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：
1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺
过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克，硼酸克， EDTA(pH 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、% NaOH：NaOH 克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；TEMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、% NaOH 100ml，加37％甲醛，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴！！！
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，厚。
同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。
银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。
需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。
下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验
测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。
因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。
在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。
保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。
从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。
注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。
浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。
若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。
停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。
在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
经验分享：
（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。
可提前配制，室温放置。
（2）染色液：我们用的是％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。
硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。
（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。
这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。
因此在固定前就要把显影液配好。
（4）在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。
原理忘记了，但是一般都是这样做的。
甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。
甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。
当时我是把甲醛调整为，硫代硫酸钠改为420μl，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。
具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。
（5）也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩下的显影液中。
显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。
显色后马上放入终止液（10％的冰乙酸）中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。
（6）对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。
第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。
当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。
我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。
我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。
再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。
十分感谢!顶下,不错求助：DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong 你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗。