DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤
最近需要做DNA非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,需要用银染显示条带,但是找不到具体的配方和步骤,不知和蛋白PAGE电泳银染有什么差别,哪位师兄师姐有配方可否发一份,十分感谢!一、电泳试剂：
1、30％聚丙烯酰胺(29:1)
丙稀酰胺29克，Bis1克，水100ml。
2、10％过硫酸胺
过硫酸胺1克，水10ml。
3、TEMED
4、5xTBE
Tris 27克，硼酸13.75克，0.5M EDTA(pH 8.0) 10ml，定容至500ml。
二、银染试剂
1、固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1000ml。
2、0.2% AgNO3：AgNO3 1克，水500ml。
3、1.5% NaOH：NaOH 7.5克，水500ml。
4、37％甲醛。
三、配胶(6%)：
30％聚丙烯酰胺(29:1) 8ml，5xTBE 8ml，定容至40ml，加10％过硫酸胺 200ul；T EMED 20ul。
室温凝固时间>1小时。
四、银染：
1、固定液固定10m。
2、水洗2m x3次。
3、0.2% AgNO3 100ml ＋37％甲醛50ul，混匀，避光染色30～50m。
4、水洗 20秒x2次。
5、1.5% NaOH 100ml，加37％甲醛 0.5ml，混匀，显色3～10m。
6、水洗若干次，终止显色。
电泳时间：150v x 3h，溴酚兰的位置相当于40bp。
银染后胶面积将膨胀10％。
在终止显色过程中，将依惯性继续显色，所以不等显色到位即可进行终止显色。
显色到位后立即拍摄，水浸泡过夜将使背景加深转贴
聚丙烯酰胺凝胶电泳是分子生物学常用的一种技术。
我们实验室应用该项技术进行基因组甲基化的筛选，取得了一定结果。
因为全基因组的筛选需要很高的灵敏度，背景干扰降到最低，因此在对凝胶进行染色时，往往采用同位素法或银染法，而且配制的胶往往很大，我们配制的是大约40×35cm的胶，0.4mm厚。
同位素十分灵敏，特异，但是由于其操作的复杂性，许多实验室开展有一定困难。
银染法相对简便易行，便于一般的实验室开展。
需要指出的是，应用与筛选基因组的银染往往采用测序胶的染色方法，这样才能保证灵敏性，我们在长期的工作中积累了一些银染的经验，与大家分享。
下面是网上的一个银染方法，我们使用后觉得效果不错，然后以此为基础，介绍一下我们的经验
测序凝胶的银染
染色过程要求凝胶浸在塑料盘中。
因而至少使用两个盘子，大小与玻璃板类似。
在盘中加入新鲜溶液之前须用高质量的水洗涤盘子。
1. 电泳完毕后用一个塑料片子小心地分开两板，凝胶应该牢固地附着在短玻璃板上。
2. 固定凝胶：将凝胶(连玻璃板)放入塑料盘，用固定/停止溶液浸没,充分振荡20分钟或直至样品中染料完全消失，胶可在固定/停止溶液中保存过夜(不振荡)。
保留固定/停止溶液，用于终止显影反应。
3. 洗胶：用超纯水振荡洗胶3次，每次2分钟。
从水中取出, 当转移至下一溶液时拿着胶板边沿静止10-20秒，使水流尽。
4. 凝胶染色：把凝胶移至染色溶液充分摇动30分钟。
5. 凝胶显影：
(1). 在显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制。
(2). 从染色溶液中取出凝胶放入装有超纯水的盘中浸洗5-10秒。
注重，把凝胶从超纯水转移到显影溶液的总时间不能长于5-10秒。
浸泡时间过长则导致信号微弱或丧失信号。
若浸泡时间过长,可重复第五步用染色液浸泡。
(3). 马上将凝胶转移至1升(总量的一半)预冷的显影液充分振荡直至模板带开始显现或开始出现第一批条带,把凝胶移入剩下的1升显影液中继续显影2--3分钟,或直至所有条带出现。
6. 固定凝胶：在显影液中直接加入等体积的固定/停止溶液。
停止显影反应,固定凝胶。
7. 在超纯水中浸洗凝胶两次，每次2分钟，注重在本操作中戴手套拿着胶板边缘避免在胶上印上指纹。
8. 将凝胶置于室温干燥或用抽气加热法干燥。
在可见光灯箱或亮白，黄色背景(如纸)上观察凝胶，若需永久保存的记录, 则可用EDF胶片保留实验结果。
经验分享：
（1）固定液：网上有好几种固定液的配制方法，我们采用的是10％的冰乙酸，用蒸馏水稀释即可，简便易行。
可提前配制，室温放置。
（2）染色液：我们用的是0.1％的硝酸银溶液，加入3ml甲醛。
硝酸银要现用现配，时间长了硝酸银会分解，一般在固定的时候配制，要有一段时间让硝酸银充分溶解。
（3）显影液：用10％碳酸钠，北化的质量就不错，完全不用买进口的，显影液要提前配制，放入4度冰箱预冷。
这一步很重要，假如没有充分预冷，显色时很难控制显色时间，不是染过了导致背景很高，就是染的很浅。
因此在固定前就要把显影液配好。
（4）在2L显影溶液中加入甲醛(3ml)和硫代硫酸钠溶液(400μl)以完成显影液的配制，这一步要在显影前加，不要提前加。
原理忘记了，但是一般都是这样做的。
甲醛将银离子还原为金属银，硫代硫酸钠防止自由银离子还原为金属银，否则会增加背景。
甲醛和硫代硫酸钠溶液的量是变化的，根据凝胶染色的效果决定。
当时我是把甲醛调整为2.7ml，硫代硫酸钠改为420μl，两者作用不一样，所以调整的时候一个多，一个少，而且要微调。
具体什么方向调整忘记了，需要摸索最合适的条件。
（5）也是比较重要的，即一定要分两次显色，第一次显色出现条带后马上转移至剩
下的显影液中。
显色时间第一次大概是5分钟左右，操作中一定要在边上看着。
显色后马上放入终止液（10％的冰乙酸）中，两分钟后放入纯水中即可，两分中后取出即可。
（6）对我来说教训最为惨痛的，即显色时间的控制。
第二次显色时不要等所有条带都出来后再终止，因为显色有一个延续效应。
当时我染色时，忽然走神了，就走神5秒钟，胶全黄了，背景奇高。
我两天的工作因为5秒钟全部over了，当时差点疯了。
我的经验是：当染色离自己期望的效果还差那么两点时马上终止，具体时间需要摸索，但一定要提前终止。
再加一句：万一染色浅了是可以复染的，效果差不太多。
十分感谢!顶下,不错求助：DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染配方及步骤aifuhong 你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？aifuhong你好，我想请教下：我在做DNA变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，我看到文献中显影液中有的加硫代硫酸钠，有的文献上没有加，我第一次做这实验不清楚，到底这个加不加会影响很大吗？。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理,步骤和结果分析
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理，步骤
和结果分析
一、实验原理
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和纯化技术，其原理基于蛋白质在凝胶电泳过程中受到凝胶孔隙大小及电场力的影响而发生迁移分离。
在非变性条件下，蛋白质保持其原有的构象，通过电泳进行分离。
二、实验步骤
1. 制备凝胶：首先准备非变性聚丙烯酰胺凝胶，通常是通过聚丙烯酰胺单体聚合成凝胶板。
2. 样品加载：将待分离的蛋白样品混合添加载体缓冲液，并加热变性处理，然后加载到凝胶槽中。
3. 电泳分离：将已加载样品的凝胶槽浸入电泳缓冲液中，施加电场进行电泳分离，蛋白质根据其分子大小及电荷迁移至不同的位置，最终形成条带。
4. 凝胶染色：分离完成后，应用染色方法将蛋白质条带可视化。
5. 结果分析：根据蛋白质条带的迁移位置以及染色效果，分析样品中含有的蛋白种类及相对含量。
三、实验结果分析
通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验，我们可以获得样品中蛋白质的分子量信息，并进一步分析样品中可能存在的杂质及纯度。
在电泳过程中，蛋白质根据其分子大小在凝胶中迁移的速度不同，从而实现了蛋白质的分离。
根据蛋白质在凝胶上的位置，我们可以对样品进行定性和定量分析，从而获得关于样品组成和含量的重要信息。
综上所述，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种简单有效的蛋白质分离技术，广泛应用于生物学和生物化学研究中。
通过实验结果的分析和解读，可以更好地了解样品中蛋白质的组成及结构，为进一步的实验研究提供重要参考。
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE）是一种常用的分离和分析蛋白质的方法。
以下是一般
的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤：
1. 制备凝胶：将聚丙烯酰胺和交联剂（通常是二甲基亚砜）在缓冲液中混合，加热溶解，然后迅速倒入电泳槽或制备模具中，留下一端可以装入电极。
2. 固化凝胶：将凝胶慢慢冷却至室温，使其固化。
这通常需要约30分钟至1小时。
3. 准备样品：将待测样品与一定体积的加载缓冲液混合均匀（可以包含甲基绿或其他荧光染料），并加热处理。
这样做是为了使样品蛋白质裂解、去除二硫键、破坏二级和三级结构，以使所有蛋白质都呈线性链状。
4. 加载样品：用微量移液器向凝胶中的小孔加入已经处理好的样品。
5. 进行电泳：将电泳槽连接至电源并设定合适的电压和电流。
根据待测蛋白质的大小和分子量，可以选择不同的电泳条件（如电压、电流和时间）。
6. 着色和显影：电泳结束后，用染料染色或其他方法可视化蛋白质。
通常使用染料如明胶蓝或银染法来增强蛋白质的显色。
7. 分析和解读：根据电泳图像，分析和解读样品中的蛋白质分离情况，如判断蛋白质的相对分子量、纯度等。
请注意，以上步骤仅为一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤，具体操作可能会根据实验目的和需求有所变化。
同时，操作和设备使用时应遵守实验室安全规定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA基本步骤与药品配方PAGE步骤1、清洗：1）戴上胶手套，将事先用NaOH溶液浸泡2—4h后的亲水板取出，用热水及洗涤剂刷洗需要使用的一面。
用试管刷轻刷，一般洗三次左右，直至干净，洗净后，置于通风橱风干。
取疏水板洗净后，置于通风橱风干。
（注意：洗的时候亲水板和疏水板要分开，所用刷子也要分开。
）2）用无尘纸沾取少量无水乙醇，擦净亲水版和疏水板，分别2次，风干。
2、硅化：倒亲水硅烷与亲水版上，轻涂，使其均匀涂抹（可先画圈然后上下刮擦），倒疏水硅烷与疏水板上，轻涂，使其均匀涂抹。
将两板置于通风橱中硅化15min以上。
3、装板：将疏水板置于下方，两边置隔离带，亲水版扣上，使端部齐平，立放；卡好两边卡子，固定好，取底座，上好板子，旋紧，平放。
手动调节水平。
4、制胶：1）准备好梳子、针筒、枪和枪头，在量筒中加入适量PAG，加入适量TEMED和APS。
立即混匀，迅速吸入针筒，注射器垂直注入胶板，倒插梳子，排除气泡，等待其凝固，大约需时20—30min。
（期间可向PCR产物中加入SGB）2）取出倒插的梳子，刮去废胶，用热水冲洗，前后上好电泳槽。
3）1×TBE缓冲液于电泳槽中预热半个小时，排除气泡。
插梳子，点样3.5ul。
5、电泳：45℃,75W，1h左右。
电泳完后取板，取胶，取梳子。
6、染色：1）固定：3L蒸馏水，20ml冰乙酸，400ml乙醇，在摇床上震荡5min。
2）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
3）染色：2L蒸馏水，5gAgNO3(可反复利用)，在摇床上震荡12min。
4）漂洗：2L蒸馏水，10s钟内拿出。
5）显色：2L蒸馏水，60gNaOH，8ml甲醛，在摇床上震荡直至显色，但是显色时间最好在15min以内。
6）用弱水冲洗3—5min，晾干观察，最后统计记录。
6﹪ PAGESGB 10ml (棕色瓶存放)去离子甲酰胺10ml二甲苯氰（FF）10mg溴酚蓝（含蔗糖）10mgEDTA（0.5mol/L，PH=8.0）200ulAPS(2.5﹪)2.5gAPS(过硫酸铵)，100ml水（一周之内用完）亲水硅烷（100ml 0.5﹪Bind-Silane）500ul Bind-Silane+500ul冰乙酸+99.5ml无水乙醇剥离硅烷（50ml 2﹪Repel-Silane）49ml氯仿+1mlRepel-Silane,混合后室温保存PAGE上样Loading Buffer(3×SGB)98﹪甲酰胺、0.025﹪二甲苯氰、0.025﹪溴酚蓝、10mmoL/L EDTA0.5mol/L EDTA29.225gEDTA溶于200mlddH2O中。
聚丙烯酰胺凝胶电泳
8%聚丙烯酰胺凝胶电泳
50ml配方：
30%丙烯酰胺：13.33ml
10×TBE：5ml（或者5×TBE加10ml）
TEMED：25ul
10%过硫酸铵（新鲜配制）：250ul
ddH2O:补到50ml
丙烯酰胺30%为29：1（质量比，丙烯酰胺：双甲叉丙烯酰胺）
电泳槽中加入0.5×TBE
银染液的配制：
固定液: 100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用；
染色液: 1g AgNO3、1. 5mL 37%甲醛, 加水至1000mL (4摄氏度预冷效果佳)，可重复使用，棕色瓶存放；
显色液: 30g Na2 CO3、1. 5mL 37% 甲醛、0. 2mL Na2S2O3(10mg/mL) , 加水至1000mL；
终止液：配方同固定液，10%冰乙酸，可以用回收的固定液进行终止。
染色：
1、加入固定液固定30min，水洗5-10min；
2、加入染色液染色30min，水洗2次，每次不超过30s；
3、加入显色液显色（条带清晰即可，一般不超过5min）；
4、加入终止液终止反应；
需要配制的溶液：
10%过硫酸铵：称取5g过硫酸铵溶解于50ml蒸馏水中。
37%甲醛：37ml甲醛和63ml蒸馏水混匀。
10mg/mL Na2S2O3：称取0.3g溶解于30ml蒸馏水中。
10%冰乙酸：100mL 冰乙酸加水稀释至1000mL，可重复使用。
5×TBE缓冲液：54gTris，27.5g硼酸，20ml 0.5M EDTA(pH8.0)，加水定容至1升。
双向电泳凝胶银染操作流程.
2.银染液成分：
(18cm 胶)每块用 500 ml 银染液
成分
(7cm 胶)
(18cm 胶)
(克，毫升,微升) 100 mlⅹ1 500mlⅹ1 500mlⅹ2 500mlⅹ3 500mlⅹ4
AgNO3
0.25 g
1.25 g
2.5g
3.75g
5.0g
1
北京基因组研究所-阳光
纯水
定容
定容
定容
定容
北京基因组研究所-阳光
双向电泳凝胶银染操作流程
目的：检测聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质。
原理：在碱性条件下，用甲醛将蛋白带上的硝酸银（银离子）还原成金属银，使
银颗粒沉淀在蛋白带上。
一、固定：过夜+10minⅹ3
1.方法：1）.固定 30min 后纯水洗 10minⅹ3。2）.固定过夜后纯水洗 10minⅹ3（推荐）。
1.24g
6.20 g
12.4g
18.6g
24.8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
K3Fe(CN)6：铁氰化钾，深红色菱形结晶，比重 1.845，在碱性介质中为强氧化剂； Na2S2O3·5H2O：易溶于水，水溶液呈弱碱性，不溶于乙醇。
Glycine
0.4 g
2g
4g
6g
8g
纯水
定容
定容
定容
定容
定容
总体积
100 ml
500ml
1000 ml
1500 ml
2000 ml
甘氨酸：Glycine，75.07（可以用 EDTA 代替，3.65g 的 EDTA.2H2O 相当于 1g 甘氨酸） 六、（补充）：脱色
实验4 小垂直板 - 聚丙烯酰胺凝胶分离DNA片段及银染
实验三聚丙烯酰胺凝胶分离DNA片段及银染一、目的与要求1.了解聚丙烯酰胺电泳的原理与技术；2.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离DNA片段的技术；3.了解银染显影技术。
二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(N，N，N'，N'—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
三、试剂与器材1.试剂：脲素（Urea，分析纯）、丙烯酰胺（Acrylamide）、N,N'-甲叉双丙烯酰胺(Bisacrylamide)、N，N，N'，N'—四甲基乙二胺(N，N，N'，N'—tetramethyl ethylenedia mine)、10%过硫酸铵，5×TBE；2.器材：垂直板电泳槽、稳压稳流电泳仪、脱色摇床、微量移液器。
四、实验步骤1.6%的PAGE的配制配制1L的胶液需要：420g 尿素，100ml 5×TBE，60g 丙烯酰胺（丙烯酰胺是强烈的神经毒素，可经皮肤吸收，配制时需戴口罩），3g N-N甲叉双丙烯酰胺，加ddH2O至1000ml, 过滤，4保存。
2.制备凝胶板（l）装板：先将玻璃板和胶条彻底洗净、晾干，将平板玻璃和嵌有1mm垫条的玻璃扣在一起，两块玻璃上下之间应错开3CM的距离，并把平板玻璃插入胶条的凹槽中，同时用胶条固定两块玻璃的两侧；（2）封板：装板完成后，将玻璃板倾斜750靠在墙壁上，然后称取1g琼脂糖溶加100mL 的水，在微波炉中迅速溶解在凝固之前用胶头滴管吸取1%琼脂糖溶液沿玻璃板与胶条底部的缝隙缓缓加入，应保证溶液完全覆盖缝隙并不外流，待溶液凝固。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离和分析方法。
以下是其操作步骤：1. 准备试剂聚丙烯酰胺凝胶电泳所需试剂包括：丙烯酰胺、N，N'-甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、TEMED、甘氨酸、尿素、溴酚蓝等。
其中，丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺是聚合反应的主要原料，过硫酸铵和TEMED是聚合反应的催化剂和加速剂，甘氨酸和尿素可以增加凝胶的强度和稳定性，溴酚蓝则可以作为指示剂。
2. 制备凝胶首先将丙烯酰胺和N，N'-甲叉双丙烯酰胺按照一定比例混合，加入适量的去离子水溶解，然后加入过硫酸铵和TEMED，混合均匀后倒入聚四氟乙烯模具中。
接着将模具放入电泳槽中，加入电极缓冲液，连接电源开始电泳。
3. 加样在电泳过程中，当凝胶完全聚合后，将电极缓冲液排出，取下凝胶。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入电泳槽中。
然后加入适量的样品溶液，用微量进样器将样品加入到凝胶孔中。
4. 开始电泳加完样后，重新连接电源，设置电泳参数（如电压、电流和时间等），开始电泳。
在电泳过程中要随时注意电泳进度，观察是否有异常情况发生（如条带跑偏、条带模糊等）。
5. 终止电泳当电泳完成后，断开电源，将凝胶取出。
用刀片将凝胶切割成所需大小的小块，放入缓冲液中浸泡一段时间，以终止电泳反应。
6. 染色将终止电泳后的凝胶进行染色。
常用的染色方法有银染法和考马斯亮蓝染色法等。
银染法是用硝酸银溶液将蛋白质固定在凝胶上，然后进行显色；考马斯亮蓝染色法是用考马斯亮蓝染料将蛋白质染色后用乙醇进行脱色。
7. 脱色经过染色后的凝胶可以进行脱色处理。
常用的脱色方法有乙醇脱色法和醋酸铵脱色法等。
乙醇脱色法是用无水乙醇多次冲洗凝胶以去除未结合的染料；醋酸铵脱色法是用醋酸铵溶液浸泡凝胶以去除未结合的染料。
8. 观察和拍照最后观察并拍照记录电泳结果。
银染法可以通过观察颜色深浅判断蛋白质分子量大小；考马斯亮蓝染色法则可以通过观察条带的亮度判断蛋白质含量高低。
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染实验操作指导书(银染) V1.0
8.1.2红色硅胶条应保持清洁，以保证良好的密封性。然后将玻璃板置于制胶夹上的红色硅胶条中心，轻推夹牢即可，无需下压（按压夹子时应轻柔）。
8.2制胶（6%）
8.2.130%聚丙烯酰胺（29:1）8ml,5*TBE，定容至40ml(每块胶约5ml),加过硫酸铵200ul，TEMED20ul,插入梳子。室温凝固，垂直向上轻轻拔出梳子。避免产生气泡。（若有气泡，用手轻轻弹几下玻璃板，赶尽气泡）
7.银染试剂
7.1固定液：100ml无水乙醇，5ml冰醋酸，定容至1L。
7.2 0.4%硝酸银：硝酸银1克，水250ml。
7.3 1.5%氢氧化钠：氢氧化钠15克，水1L。
7.4 37%甲醛
8.非变性聚丙烯酰胺凝胶的制备
8.1安装玻璃板夹心
8.1.1分别取内板（10cm*7.3cm）、外板（10cm*8.3cm）各一块（注意勿用手接触灌胶面的玻璃），将内板置于外板夹条一侧，使内外玻板底部、两边齐平（否则需重新安装），置于玻璃夹中，将两边固定（夹子应夹在侧边条中央位置）。
5．仪器与器具
移液枪和枪头、脱色摇床、EP管、205ml锥形瓶、塑料盒、电泳仪、液：
丙烯酰胺：29g,N,N’-亚甲基双丙烯酰胺：1g,加去离子水定容至100ml，装于棕色瓶内，4℃可保存两个月。
6.2．过硫酸铵0.1g/ml：称取过硫酸铵1g加去离子水值10ml。4℃可保存一周，-20℃可保存一个月。
6.3．TEMED(四甲基乙烯基二胺)：和过硫酸铵一起作为交联反应的催化剂。易吸潮，4℃封闭保存。
6.4. 5*TBE电泳缓冲液
分别称取54克Tris,27.5克硼酸，20ml0.5M/EDTA(pH=8.0)定容至1L
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验修改版
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染实验一变性聚丙烯酰胺凝胶电泳配制溶液：1、30% Acrylamide（14.5 g 丙烯酰胺，0.5g 双丙烯酰胺，加水溶解，定容至50 ml，4℃，棕色瓶中储存）2、10% 过硫酸铵（0.5g APS，溶于5ml 去离子水中，4℃可储存数个月）3、10 ×TBE 缓冲液（10.8g Tris,0.744g EDTA,5.5g 硼酸，定容到100ml）4、TEMED5、20-200 DNA marker实验步骤：1、配置10%的胶10ml：5.5 ml water3.3ml 30% Acrylamide1ml 10 ×TBE0.11ml APS（现配现用）0.01mlTEMED2、立即将胶倒入两块板间并插好梳子，放置，待凝固30min，时间可以适当延长。
3、向电泳槽加入1×TBE，拔出梳子并用注射针筒多次洗涤点样孔，尽可能排除未聚合的丙烯酰胺。
4、将DNA marker 加到点样孔中，以120V（10V/cm）进行电泳直到燃料走到靠近底部的三分之一处，大约需要60-90分钟。
二银染实验银染溶液的配置：实验之前准备4℃水1、固定液（10%醋酸）：20ml冰醋酸，180mlddH2O混匀（通风厨中进行）2、染色液：将0.1g AgNO3溶解于100 ml ddH2O中，使用前加0.15ml37%甲醛溶液，必须储存于避光瓶中，防止接触皮肤（通风厨中进行）3、显影液：将6g Na2CO3溶解于200ml ddH2O中，冷却至4℃，使用前加0.3ml37%甲醛溶液（通风厨中进行）30μl0.1M五水硫代硫酸钠；（0.1M Na2S2O3。
5H2O：将1.24g Na2S2O3。
5H2O溶于50ml ddH2O）。
放入冰箱中冷却到4摄氏度。
注意事项：1、染色液和显影液要现用现配；2、显影液必须在4℃使用且必须保存在4℃；3、甲醛蒸汽致癌，在通风厨内操作；4、实验室中柔和的背景光线有利于降低背景颜色；5、显色不能在透光的盒子中进行；6、溶液不能直接倒在胶面上，应使盘倾斜后将溶液倒在盘的角上，或者将每种溶液各方一盘，然后将胶从一个盘转到另一个盘；7、溶液的体积必须足够将胶全部浸没；8、显色过程中盘中须轻轻摇动。
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤
聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤(总2页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--聚丙烯酰胺凝胶电泳操作步骤一、制胶前的准备1、玻璃板的准备用洗涤剂将玻璃板反复擦洗，然后用清水冲洗干净，待玻璃板晾干后，将1mm塑料薄片沾少许清水，使其贴在玻璃板上，然后将另一块凹行玻璃板与原玻璃板紧贴。
2、垂直平板支架的安装将准备好的玻璃板，放入垂直支架内，两侧用钢夹使其固定，钢夹的高度不要超过凹行玻璃的凹口处为宜，两侧选用力度大小适中、对称的钢夹。
3、玻璃板的密封将1%琼脂糖用微波炉加热融化后，倒入支架板底槽中，使其密封即可，然后用吸管吸取少量琼脂溶液，沿玻璃板两边的缝隙内加入，使其密封，待其冷却凝固后备用。
二、凝胶的制备1、30%的丙烯酰胺溶液的配制（1L）配方：丙烯酰胺（Acr）290g 甲叉双丙烯酰胺（Bis）10g步骤：称取样品，倒入烧杯中用蒸馏水定容至1 L将烧杯置于搅拌器上，使溶液充分溶解至透明将完全溶解的溶液分多次过滤到棕色容器中保存备用2、10ｘTBE溶液的配制（1L）配方：Tris：108g；硼酸：55g ；EDTANa２：步骤：称取各成分至烧杯用蒸馏水定容至1L用玻璃棒搅拌至溶剂完全溶解分瓶倒装待用3、PAGE凝胶的制备（一块胶为例）配方：30%的丙烯酰胺溶液10ml ; 10ｘTBE溶液4ml；双蒸水16ml;20%的过硫酸铵（AP）200ul;TEMED溶液20ul步骤：将各成分称量好之后混合好以备灌胶4、灌胶把垂直支架倾斜30°，将配好的PAGE凝胶溶液沿凹形玻璃平口处缓缓倒入至距平口7mm处为宜，倒入过程中要避免气泡的产生，发现有气泡产生时，要待气泡消失后再倒入。
灌胶完成后，用枪吸取少量水密封胶口，压平胶面。
当胶面与水之间有一条明显的界限时，表示凝胶已凝固，可以开始点样电泳。
三、点样及电泳1、ｘTBE缓冲溶液的配制量取950ml的蒸馏水，然后加50ml的10ｘTBE溶液至1000ml处，装瓶摇匀，备用。