基因组编辑技术共41页
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三代基因组编辑技术
详细描述
首先，锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的设计和合成过程较为复杂，需要较 高的技术水平和经验；其次，由于这两种技术需要将蛋白质引导至细胞核内，因此对细 胞具有毒性作用；此外，由于这两种技术需要识别和切割DNA序列，因此可能存在脱
靶效应和基因突变的风险。
03
第二代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）
总结词
胞嘧啶脱氨酶引导的编辑是一种利用胞嘧啶脱氨酶对DNA进行精准编辑的方法。
详细描述
胞嘧啶脱氨酶能够将DNA中的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），进而在随后的DNA复制过程中导致基因 突变。通过将特定的脱氨酶与CRISPR-Cas9系统结合，可以实现精准的基因组编辑。
基因组编辑的最新进展与前景
总结词
04
第三代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）的改进与优化
高效性
通过优化碱基编辑器的脱靶效应 和编辑效率，提高其在基因组中 的精准度和可靠性。
特异性
改进碱基编辑器的识别机制，降 低其在基因组中脱靶编辑的可能 性，提高编辑的特异性。
适用性
拓展碱基编辑器的应用范围，使 其适用于更多种类的基因突变和 遗传疾病的治疗。
随着技术的不断进步，基因组编辑技术 正在不断发展，未来有望在医学、农业 等领域发挥更大的作用。
VS
详细描述
近年来，基因组编辑技术取得了许多突破 性进展，例如开发出更加高效和精准的编 辑工具，以及在人类疾病治疗和农作物改 良等领域的应用。未来，基因组编辑技术 有望在更多领域发挥重要作用，为人类带 来更多的福祉。
三代基因组编辑技术
目录
• 基因组编辑技术概述 • 第一代基因组编辑技术 • 第二代基因组编辑技术 • 第三代基因组编辑技术
首先，锌指核酸酶和转录激活因子样效应物核酸酶的设计和合成过程较为复杂，需要较 高的技术水平和经验；其次，由于这两种技术需要将蛋白质引导至细胞核内，因此对细 胞具有毒性作用；此外，由于这两种技术需要识别和切割DNA序列，因此可能存在脱
靶效应和基因突变的风险。
03
第二代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）
总结词
胞嘧啶脱氨酶引导的编辑是一种利用胞嘧啶脱氨酶对DNA进行精准编辑的方法。
详细描述
胞嘧啶脱氨酶能够将DNA中的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），进而在随后的DNA复制过程中导致基因 突变。通过将特定的脱氨酶与CRISPR-Cas9系统结合，可以实现精准的基因组编辑。
基因组编辑的最新进展与前景
总结词
04
第三代基因组编辑技术
碱基编辑器（Base Editors）的改进与优化
高效性
通过优化碱基编辑器的脱靶效应 和编辑效率，提高其在基因组中 的精准度和可靠性。
特异性
改进碱基编辑器的识别机制，降 低其在基因组中脱靶编辑的可能 性，提高编辑的特异性。
适用性
拓展碱基编辑器的应用范围，使 其适用于更多种类的基因突变和 遗传疾病的治疗。
随着技术的不断进步，基因组编辑技术 正在不断发展，未来有望在医学、农业 等领域发挥更大的作用。
VS
详细描述
近年来，基因组编辑技术取得了许多突破 性进展，例如开发出更加高效和精准的编 辑工具，以及在人类疾病治疗和农作物改 良等领域的应用。未来，基因组编辑技术 有望在更多领域发挥重要作用，为人类带 来更多的福祉。
三代基因组编辑技术
目录
• 基因组编辑技术概述 • 第一代基因组编辑技术 • 第二代基因组编辑技术 • 第三代基因组编辑技术
CRISPR基因编辑技术.ppt
palindromic repeat /Cas-based RNA-guided DNA endonucleases）
特异性 DNA识别域
+
非特异性 核酸内切酶
ZFN原理
ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每
CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指 导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
CRISPR-Cas系统的结构
CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/Cas 9 背景
• 由这些序列和基因组成的系统我们称之为 CRISPR/Cas系统，而在这个系统中常用到 的核酸内切酶为Cas9,所以通常称该系统 CRISPR/Cas9 系统。利用这个系统，细菌 可以不动声色地把病毒基因从自己的染色 体上切除，这是细菌特有的免疫系统。
CRISPR/Cas 9概述
TALEN介导的基因编辑
TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结 合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特 异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。
TALEN的技术特点
• 任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活 • 成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上 • 打靶效率高，可完全替代RNAi技术 • 脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应 • 技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒
特异性 DNA识别域
+
非特异性 核酸内切酶
ZFN原理
ZFN=蛋白的DNA识别域+核酸内切酶
DNA识别域： 由一系列 Cys2-His2锌指蛋白（zinc-fingers）串联组成（一般3~4个），每
CRISPR-Cas：一种来源是细菌获得性免疫的由RNA指 导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术。
CRISPR-Cas系统的结构
CRISPR-CAS 系统的组成主要包括: 由不连续的重复序列 R( repeat) 与长度相似的间区序列S( spacers) 间隔排 列而成的CRISPR 簇，前导序列L( leader) 以及一系列 CRISPR 相关蛋白基因cas。
CRISPR/Cas 9 背景
• 由这些序列和基因组成的系统我们称之为 CRISPR/Cas系统，而在这个系统中常用到 的核酸内切酶为Cas9,所以通常称该系统 CRISPR/Cas9 系统。利用这个系统，细菌 可以不动声色地把病毒基因从自己的染色 体上切除，这是细菌特有的免疫系统。
CRISPR/Cas 9概述
TALEN介导的基因编辑
TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结 合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特 异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。 形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。
TALEN的技术特点
• 任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活 • 成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%以上 • 打靶效率高，可完全替代RNAi技术 • 脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应 • 技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建Talen质粒
6.基因组编辑技术专题 ppt课件
埃马纽埃尔·卡彭蒂耶 Emmanuelle Charpentier
ppt课件
23
1 CRISPR-Cas系统的发现 免疫过程
ppt课件
24
1 CRISPR-Cas系统的发现
CRISPR-Cas系统赋予原核细胞针对外源DNA特异性免疫, 而这种特异性是由间
隔序列（spacer）决定的。在宿主防御噬菌体攻击中，细菌进化了CRISPR 介
ppt课件
1
• 自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通 过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。
1973年，斯坦利·N·科恩(Stanley N. Cohen)和赫伯特·W·博耶 (Herbert W. Boyer) 成功将蛙的DNA插入到细菌中。
20世纪70年代，基因泰克(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造， 使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿 病的胰岛素。
2） 加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因 组编辑。
3） 当然，同时需要表达一个guide RNA，把Cas9定位到靶DNA处。
4） CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5’-NGG-3’），即靶序列 后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱 基就可以出现一个NGG。
导的适应性免疫。这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，
即通过增加或删除间隔序列（spacer）pp来t课实件 现的。
25
1 CRISPR-Cas系统的发现
• CRISPR/Cas系统分类：根据CRISPR—Cas系统中的Cas蛋白的种类和同源性， 可将CRISPR—Cas系统区分成3种类型：
基因编辑技术PPT(完美版)
是感染细菌的一类病毒 ，寄生于细菌中，并能溶解 细菌细胞，故称噬菌体。
噬 菌 体 生 活 周 期
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
第五节 重组DNA技术
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组， 可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获 得目的基因。
2； 待测DNA序列使用M13噬菌体。
3、目的基因与载体的连
接
原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
3、常用载体
质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
1、质粒（plasmid）:
质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量
噬 菌 体 生 活 周 期
3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆。
4、病毒
第五节 重组DNA技术
目的基因的获取
↓
克隆载体的选择
↓
目的基因与载体 连接成重组DNA
↓
重组DNA导入受体菌
↓
重组体的筛选
↓
克隆基因的表达
5、末端转移酶 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3`-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端。
6、T4多聚核苷酸激酶 催化多聚核苷酸5ˊ羟基末端磷酸化。 用途：⑴放射性标记DNA的5`端
⑵使缺少5`-磷酸基的DNA磷酸化用于连接反应。 7、S1核酸酶
单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。
清楚的原核生物、噬菌体及病毒等基因组， 可直接用限制性内切酶消化后，通过分离获 得目的基因。
2； 待测DNA序列使用M13噬菌体。
3、目的基因与载体的连
接
原理(应用DNA同源重组原理)：通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞的特定的
克隆位 点，MCS）。
5、具有较高的遗传稳定性。
3、常用载体
质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA
这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。
1、质粒（plasmid）:
质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定 遗传的复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的 DNA分子。
应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 是指在基因水平上，将目的DNA在体外重组于能自我复制的载体DNA分子上，然后将重组DNA导入宿主细胞中进行增生，以获得大量
三代基因组编辑技术
• 发觉tracrRNA对靶点旳辨认和切割是必需旳，tracrRNA旳5'端与成熟 旳crRNA 3'端有部分序列(约13 bp)能够配对进而形成茎环构造，对维 持crRNA与靶点旳配对可能十分主要 根据tracrRNA与crRNA旳构造特 征，他们tracrRNA和crRNA体现为一条嵌合旳向导RNA (guide RNA， gRNA)，并在体外证明gRNA能够发挥tracrRNA和crRNA旳功能
• 2023年1月29日在《nature biotechnology 》上刊登旳《efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system》 一文中，作者利用人工合成旳sgRNAs能指 导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进
ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 旳比较
Ø Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配正确序列靶位点剪切双链 DNA。HNH构造域剪切配正确部分， Ruvc构造域剪切未配正确链。
N代表任意DNA碱基
CRISPR/Cas在基因改造中旳应用
• CRISPR/Cas系统旳作用特征与限制性核酸内切酶相同，它对序列旳特 异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成旳核糖核蛋白复合物辨认 靶序列上旳PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer
Genetics, Vol. 188, 773–782
ZFN mediated genome editing
• FOK1二聚体互作 • 与非同源性末端接合(Non-homologous end
joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等措施结合使用 • 同源二聚体或单一ZFN单元旳结合造成非特 异性酶切，即脱靶效应（off-target）
• 2023年1月29日在《nature biotechnology 》上刊登旳《efficient genome editing in zebra fish using a CRISER-Cas system》 一文中，作者利用人工合成旳sgRNAs能指 导Cas9内源性核酸酶对斑马鱼胚胎基因进
ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9 旳比较
Ø Cas9: 复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配正确序列靶位点剪切双链 DNA。HNH构造域剪切配正确部分， Ruvc构造域剪切未配正确链。
N代表任意DNA碱基
CRISPR/Cas在基因改造中旳应用
• CRISPR/Cas系统旳作用特征与限制性核酸内切酶相同，它对序列旳特 异性切割主要依赖于crRNA与Cas蛋白形成旳核糖核蛋白复合物辨认 靶序列上旳PAM（ Protospacer-adjacent Motif ）以及protospacer
Genetics, Vol. 188, 773–782
ZFN mediated genome editing
• FOK1二聚体互作 • 与非同源性末端接合(Non-homologous end
joining, NHEJ)和同源重组（Homologous Recombination)等措施结合使用 • 同源二聚体或单一ZFN单元旳结合造成非特 异性酶切，即脱靶效应（off-target）
热点微专题13 基因组编辑技术(原卷版)
热点微专题13 基因组编辑技术CRISPR/Cas9基因编辑技术能对基因进行定点编辑，其原理是由一条单链向导RNA(SgRNA)引导内切核酸酶Cas9到一个特定的基因位点进行切割(如图)。
CRISPR复合体中的SgRNA的主要功能是与靶向基因(目的基因)上特定碱基序列互补，从而定向引导Cas9蛋白与靶向基因结合，并在特定位点切割DNA。
CRISPR/Cas9基因编辑技术培育转基因生物，与传统的基因工程相比，其明显优点是避免了因目的基因随机插入宿主细胞DNA引起的生物安全性问题。
CRISPR/Cas9基因编辑技术在基因治疗、基因水平进行动植物的育种、研究基因的功能等方面有广阔的应用前景。
【高考真题研究】1、(2021海南卷)CRISPR/Cas9是一种高效的基因编辑技术，Cas9基因表达的Cas9蛋白像一把“分子剪刀”，在单链向导RNA（SgRNA）引导下，切割DNA双链以敲除目标基因或插入新的基因。
CRISPR/Cas9基因编辑技术的工作原理如图所示。
回答下列问题。
(1)过程①中，为构建CRISPR/Cas9重组质粒，需对含有特定sgRNA编码序列的DNA进行酶切处理，然后将其插入到经相同酶切处理过的质粒上，插入时所需要的酶是。
(2)过程②中，将重组质粒导入大肠杆菌细胞的方法是。
(3)过程③～⑤中，SgRNA与Cas9蛋白形成复合体，该复合体中的SgRNA可识别并与目标DNA序列特异性结合，二者结合所遵循的原则是。
随后，Cas9蛋白可切割序列。
(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除一个长度为1200bp的基因，在DNA水平上判断基因敲除是否成功所采用的方法是，基因敲除成功的判断依据是。
(5)某种蛋白酶可高效降解羽毛中的角蛋白。
科研人员将该蛋白酶基因插入到CRISPR/Cas9质粒中获得重组质粒，随后将其导入到大肠杆菌细胞，通过基因编辑把该蛋白酶基因插入到基因组DNA中，构建得到能大量分泌该蛋白酶的工程菌。
基因组编辑技术及其应用(115页)
由于Cas9 含有1 个RuvC-like 核酸酶功能域和1 个McrA-like HNH 核酸酶功能域，因此在识别的 靶位点处，McrA-like HNH 核酸酶结构域剪切互 补链，而RuvC-like 结构域剪切非互补链。
CRISPR／Cas系统分型
I 型CRISPR／Cas系统：使用Cas3蛋白 II型CRISPR／Cas系统：使用Cas9蛋白 III型CRISPR／Cas系统：使用Cas6蛋白
ZFNs技术
1985年，Miller等首次在非洲爪蟾(Xenopu laevis) 的转录因子(transcription factor IIIA，TFIIIA)中 发现了具有锌指结构的蛋白(Zinc—finger protein，ZFP)。
锌指结构是由多个Cys~His残基通过Zn2+螯合而成 的蛋白质结构，根据其含有保守结构域的不同， 可以分为C2 H2 、C4 和C6 三种类型。
TALE蛋白结构图
中心重复区由12～30个重复单元组成，每个单元含 有34个氨基酸残基，该单元除了12和13位重复可变 双氨基酸残基(repeat variant diresidues，RVD) 序列外，其他序列完全相同。RVD序列决定了 TALE蛋白的识别碱基的特异性。不同的RVD能够 分别对应识别A、T、G、C碱基中的一种或多种。
activator-like effector nucleases，TALENs)技术 3、CRISPR／Cas(Clustered regularly interspaced
short palindromic repeats and CRISPR associated)技 术
ZFNs技术
ZFNs技术是最早发现的人工内切核酸酶介导基因 组编辑技术，与传统的方法相比其优点是定点整 合效率高，但由于其构建难度大、费用高的缺点， 使其应用受到很大的限制。
基因组编辑技术 ppt课件
17
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌 基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组 成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间 隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶 基因进行识别。
域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp， RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成 双链的断裂。
25
CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能 够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读 框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而 HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA 模板存在时对靶位点进行可预测的插入。
18
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链
DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位 点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并 不需要形成二聚体才能发挥作用。
19
CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来 的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成， 其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切 割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单 元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设 计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜 力。
CRISPR-Cas主要由两部分组成：
CRISPR/Cas的结构 CRISPR 是一个特殊的DNA重复序列家族, 广泛分布于细菌和古细菌 基因组中。CRISPR 位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats) 组 成, 重复序列的长度通常 21~48 bp, 重复序列之间被 26~72 bp 间 隔序列(spacer)隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶 基因进行识别。
域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp， RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成 双链的断裂。
25
CRISPR/ Cas9产生的DSB能够激活细胞和生物体自身修复 机制，产生两种不同的修复途径NHEJ和HDR修复。NHEJ能 够高效地引入不同长度的插入或者缺失突变，导致转录阅读 框编码序列，转录激活相关的启动子和增强子的损坏；而 HDR的修复通常会引入特定位点的突变或者在外源供体DNA 模板存在时对靶位点进行可预测的插入。
18
Cas（CRISPR associated）： 存在于CRISPR位点附近，是一种双链
DNA核酸酶，能在guide RNA引导下对靶位 点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并 不需要形成二聚体才能发挥作用。
19
CRISPR/Cas9系统的工作原理和机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来 的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成， 其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切 割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。
2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中 发现一种转录激活样效应因子(TAL蛋白),它的核酸结合域的氨 基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单 元识别一个碱基，简单且特异性极好。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设 计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜 力。