土壤酶活性测定方法
土壤酶活性测定方法
土壤酸性磷酸酶活性的测定1．试剂配制(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6HO,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至2250ml.4摄氏度冰箱保存。
(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）原液由以下成分组成:三羟甲基氨基甲烷12.1g顺丁烯二酸11.6g柠檬酸14g硼酸6.3g溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。
取原液200 ml，再加入0.1N HCL 或浓HCL来调pH为4.5。
最后稀释至1L，即得。
(3)甲苯(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml)(5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L.2．测定步骤置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。
培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过致密滤纸过滤到50ml容量瓶，用蒸馏水定容后在410nm处比色.3．计算方法土壤酸性磷酸酶的活性用单位时间内每克土中的对硝基苯酚的毫克数表示，W（mg·g-1·h-1）=M1/（m×t）式中：M1—标准曲线上查得样品中对硝基苯酚的质量（mg）；t —反应时间（h）；=1hm—样品土壤的重量（g）无土壤CK: 用1ml蒸馏水代替1g土壤；每批土样做2个；无基质CK: 用1ml蒸馏水代替1ml PNPP。
每个处理做1个。
标准曲线的制作：1）对硝基苯酚标液：1g对硝基苯酚定容1L，低温保存。
2）取标液0、1、2、3、4、5ml于0-6号硬质试管中，分别加pH6.5通用缓冲液4ml，Cacl2.2H2O 溶液1ml，NaOH溶液4ml，②混匀后，定量滤纸过滤到50ml容量瓶，定容后，再取各浓度标液1ml定容至50ml，以0号试管作为对照，在A410nm波长下测光吸收值，并记录光吸收值A410。
土壤酶活性的测定方法
土壤酶活性的测定方法土壤酶活性的测定方法主要包括测定土壤中的蔗糖酶、脲酶、过氧化氢酶和过氧化物酶等多种酶活性，这些酶活性的测定可以反映土壤的微生物代谢能力和土壤质量。
本文将详细介绍几种常用的土壤酶活性测定方法。
一、酶活性测定方法的准备工作1. 样品处理：收集土壤样本后，将其放在4C冷藏保存，保持样品活性，避免酶的降解。
2. 取样：根据需要，从土壤样品中取出一定量的湿重或干重样品。
3. 土壤处理：依据实验要求，对土壤样品进行处理，如水分调整、添加营养物质等。
二、蔗糖酶活性测定方法蔗糖酶是一种常见的土壤酶，可反映土壤中的碳循环能力。
蔗糖酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤，去除杂质。
2. 准备培养基：其中包括蔗糖作为底物、缓冲液、指示剂等。
3. 加入适量的土壤样品和培养基到离心管中，混匀后，放置在恒温摇床上培养一定时间。
4. 培养结束后，通过离心将土壤颗粒沉淀到底部。
5. 取沉淀后的上清液，用酚酞指示剂进行比色检测，根据比色结果计算蔗糖酶活性。
三、脲酶活性测定方法脲酶是一种重要的土壤酶，参与土壤中尿素的分解过程。
脲酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，在10C恒温条件下接种脲酶底物，使底物完全被土壤降解。
2. 在一定时间后，通过添加草酸溶液阻止进一步反应，停止脲酶的活性。
3. 取样品，加入酚硫酸溶液，进行比色测定。
4. 根据比色结果计算脲酶活性。
四、过氧化氢酶活性测定方法过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可反映土壤的抗氧化能力。
过氧化氢酶活性的测定方法如下：1. 取一定量的土壤样品，并通过筛网过滤去除杂质。
2. 准备含过氧化氢底物和其他试剂的反应体系。
3. 将土壤样品加入反应体系中，充分混匀后，在一定时间内反应。
4. 在反应结束后，通过添加硫酸钠溶液停止反应，阻止进一步的化学反应。
5. 使用紫外分光光度计测定样品的吸光度，根据结果计算过氧化氢酶活性。
五、过氧化物酶活性测定方法过氧化物酶是一类重要的土壤酶，在土壤中参与有机物降解和氧化还原反应。
土壤酶的测定方法
一、脲酶测定(比色法)脲酶是对尿素转化起关键作用的酶，它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源，它的活性可以用来表示土壤供氮能力。
1、试剂配制：（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。
（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。
称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。
使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。
（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。
（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。
（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN 的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。
2、操作步骤称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。
在37℃恒温箱中培养24ｈ。
然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。
取滤液1mL 置于50mL容量瓶中,用蒸馏水稀释至10mL,然后加入4mL苯酚钠溶液,并立即加入3mL次氯酸钠溶液，加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20ｍｉｎ后,将混合物稀释至刻度,在波长578ｎｍ处测定吸光值。
脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差,根据标准曲线求出氨态氮量。
标准曲线绘制：分别取0、1、3、5、7、9、11、13mL氮工作液置于50mL容量瓶中，加蒸馏水至20mL，再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀，20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于578nm处比色。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法
土壤酶活性及土壤微生物计数测定方法土壤酶活性测定取样工具及取样方法在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或者塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
土样在自然条件下烘干装入袋中备用。
所需试剂：酒石酸钠、NaCl、阿拉伯胶、纳氏试剂、硫酸铵[(NH4)2SO4]、甲苯、苯磷酸二钠、NaAc.3H2O、HAc、酚、铁氰化钾、4-氨基安替吡啉、碘化钾、氯化汞、氢氧化钾、、配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）与0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱与水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱与溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳固，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳固后，570nm比色绘制标准曲线。
测定方法磷酸酶活性测定一、试验原理土壤中的磷，很大部分以有机磷化合物的形式存在。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。
培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
土壤酶活性测定方法综合
土壤酶活性测定方法1、土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）一、原理脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。
它是一种酰胺酶作用是极为专性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。
土壤脲酶活性，与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。
根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。
人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。
土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。
本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚—次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。
二、试剂1）甲苯2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。
将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。
将A、B溶液保存在冰箱中。
使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至100ml。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg 氮的标准液；再将此液稀释10倍（吸取10ml标准液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）。
三、操作步骤称取5g土样于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振荡均匀，15min后加10ml10%尿素溶液和20ml PH 6.7柠檬酸盐缓冲溶液，摇匀后在37℃恒温箱培养24小时。
培养结束后过滤，过滤后取1ml滤液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚钠溶液和3ml次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
土壤酶活性及土壤微生物计数测定办法
土壤酶活性及微生物测定配置方法：铵态氮标准溶液：称取0.4717g(精确至0.0001g)干燥的硫酸铵[(NH4)2SO4]溶于水中，再加水稀释至1000mL，此溶液1mL含100µg N。
往500ml容量瓶中注入10、25、40、60、75、90ml标准溶液并用蒸馏水稀释至刻度，制备成的溶液在490nm下比色，并绘制标准曲线。
醋酸缓冲液：PH5.0，NaAc.3H2O50g，溶于适量水中，加6mol/LHAc34ml，稀释至500ml。
硼酸缓冲液：PH9.0，80毫升0.05mol/l硼砂（Na2B4O7.10H2O）和0.2mol/l的硼酸混合。
纳氏试剂：将碘化钾10g溶于10ml水中，边搅拌边慢慢地加入氯化汞饱和水溶液，直至生成的红色沉淀不再溶解为止。
加入氢氧化钾30g并溶解之，再加入氯化汞饱和溶液1ml，加水至200ml。
静置，取上层清液，贮于棕色瓶中酚的标准溶液：（1）原液—1克酚溶于蒸馏水中定容至1升，溶液在暗色中稳定，（2）工作液—取50ml原液稀释至1升（1ml含0.05mg酚）；分别向100ml容量瓶中注入1、2、3、4、5、6、7ml工作液并显色定容（分别相当于0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35毫克酚），待颜色稳定后，570nm比色绘制标准曲线。
七、八、实验步骤取5克过20目筛的风干土样于50毫升容量瓶中，用0.8(16滴)毫升甲苯处理，15分钟后，加入5毫升苯磷酸二钠溶液（6.75克苯磷酸二钠溶于水，并稀释至1升）和5毫升相应的缓冲液（碱性磷酸酶用pH10的硼酸缓冲液，中性磷酸酶用pH7.0的柠檬酸缓冲液，酸性磷酸酶用pH5.0的醋酸缓冲液）。
仔细混合后，将反应物置于37摄氏度恒温箱中培养12小时，然后用蒸馏水定容至刻度，摇匀过滤，用5毫升水代替基质以设置对照。
为了测定反应混合物中的酚量，取1毫升滤液于100毫升容量瓶中，加5毫升硼酸缓冲液（pH9.0），再加入3毫升2.5%的铁氰化钾和3毫升0.5%的4-氨基安替吡啉，摇动，溶液呈粉红色，然后再加水定容，待颜色褪到稳定时（约需20~30分钟），在分光光度计上于波长570纳米处测定溶液的光密度，根据用酚制备的标准曲线查出供试滤液中酚的含量。
土壤酶活性测定的实验步骤
土壤酶活性测定的实验步骤土壤酶的测定1．三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。
2．土样研磨精细后分袋装好。
土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g，重复一次，14.5某2=29g。
一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）1．试剂配制：(1)0.3%过氧化氢溶液：①（1：10030%的H2O2和水）②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水）③（1ml30%H2O2+99ml蒸馏水）(2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水）(3)0.1N 高锰酸钾溶液：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）2．操作步骤：2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色3．结果计算过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1NKMnO4的毫升数表示：M=（A－B）某T式中：A：空白消耗的0.1NKMnO4毫升数B：滤液消耗的0.1NKMnO4毫升数T：KMnO4滴定度的校正值备注：以容量法测H2O2的酶活：Kappen（1913）首先介绍硫酸存在下用高锰酸钾滴定剩余的过氧化氢测定酶活。
此法根据H2O2与土壤相互作用时，未分解的H2O2的数量用容量法（常用高锰酸钾滴定未分解的H2O2）测定H2O2的酶活2KMnO4＋5H2O2＋3H2SO4→2MnSO4＋K2SO4＋8H2O＋5O2土壤H2O2酶促过氧化氢的分解有利于防止它对生物体的毒害作用二、蔗糖酶（P278）滴定法1.试剂配制：(1)20％蔗糖：（20g蔗糖＋80ml水或12.5g蔗糖＋50ml水）(2)甲苯(分析纯)(3)PH5.5醋酸盐－磷酸盐缓冲液0.5ml磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)+9.5ml磷酸二氢钾（1/15M）磷酸氢二钠·12H2O(1/15M)：23.88gNa2HPO4,，加H2O溶解，定容至100ml。
测土壤酶活方法
测土壤酶活方法酶活性是评价土壤质量和生物活性的重要指标之一。
测定土壤酶活性可以帮助我们了解土壤中微生物的活动水平和土壤中有机物的分解能力，从而判断土壤的肥力和健康状况。
本文将介绍几种常用的测土壤酶活性的方法。
一、脲酶法测定土壤酶活性脲酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中脲酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
脲酶是一种催化尿素分解的酶，可以将尿素分解为氨和二氧化碳。
测定土壤中脲酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
脲酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有尿素和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的尿素，计算出脲酶的活性。
二、过氧化氢酶法测定土壤酶活性过氧化氢酶法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中过氧化氢酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
过氧化氢酶是一种催化过氧化氢分解的酶，可以将过氧化氢分解为水和氧气。
测定土壤中过氧化氢酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
过氧化氢酶法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有过氧化氢和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的过氧化氢，计算出过氧化氢酶的活性。
三、醋酸红法测定土壤酶活性醋酸红法是一种常用的测定土壤酶活性的方法。
该方法是通过测定土壤中醋酸红酶的活性来间接反映土壤中的酶活性。
醋酸红酶是一种催化醋酸红分解的酶，可以将醋酸红分解为醋酸和二氧化碳。
测定土壤中醋酸红酶的活性可以反映土壤中微生物的活动水平和有机物的分解能力。
醋酸红法的操作步骤如下：1. 取一定质量的土壤样品，将其与含有醋酸红和缓冲液的试剂混合。
2. 反应一段时间后，加入酸性试剂停止反应。
3. 用碱性试剂滴定未反应的醋酸红，计算出醋酸红酶的活性。
测定土壤酶活性可以通过脲酶法、过氧化氢酶法和醋酸红法等方法来进行。
大实验—土壤酶活性的测定
4.2.5 土壤酶活性的测定脲酶活性的测定采用奈氏比色法．以1 g干土24 h生成的NH3- N量为脲酶的1个活性单位[41]．过氧化氢酶活性的测定采用高锰酸钾滴定法．酶活性以1 g干土1 h内消耗的0．1 mol·L-1KMn04体积数(以ml计)表示[42]多酚氧化酶活性的测定采用邻苯三酚比色法，以1 g干土3 h内生成的没食子素的量为多酚氧化酶的1个活性单位[43]，脱氢酶活性的测定采用三苯基四氮唑氯化物作为氢受体。
被还原后生成红色的甲臜，用比色法测定，以1 g干土6h生成的甲臜质量为脱氢酶的1个活性单位[44]。
1. 脲酶活性的测定——苯酚钠比色法（1）标准曲线的绘制吸取稀释的氮的标准溶液1，4，7，10，13，16，19mL，移入50mL容量瓶中，然后加蒸馏水至20mL。
再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液，随加随摇匀。
20min后显色，定容。
1h内在分光光度计上于波长578nm处比色。
根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。
绘制的标准曲线如图4-1所示：图4-1脲酶标准曲线（2）操作步骤取5g风干土，置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。
15min后加10mL10%尿素液和20mL PH6.7柠檬酸盐缓冲液。
摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。
过滤后取3mL滤液注入50mL容量瓶中，然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。
脲酶活性以24h后1g土壤中NH3-N的毫克数表示。
2. 过氧化氢酶活性的测定——高锰酸钾滴定法（1）操作步骤取5g土壤样品于100mL三角瓶中（用不加入土样的作空白对照），加0.5mL 甲苯，摇匀，于4℃冰箱中放置30min。
取出，立刻加入25mL冰箱储存的3%H2O2水溶液，充分混匀后，再置于4℃冰箱中放置1h。
取出，迅速加入冰箱储存的2mol/L H2SO425mL，摇匀，过滤。
取1mL滤液，用0.05mol/L的KMnO4滴定。
（2）计算根据对照和样品的滴定差，求出相当于分解的H2O2的量所消耗的KMnO4。
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土壤蛋白酶活性测定方法：铜盐比色法
（一）方法原理
本法基于以精胶为基质，酶解后所释放的氨基酸使其与铜盐反应形成蓝色复合物。
用比色测定颜色深度，计算出氨基酸含量，来度量酶的活性。
（二）试剂
1）1%精胶
2）甲苯
3）铜-磷酸盐溶液：① 27.3g CuCl2·H2O溶于1 L水；②64.5g Na2HPO4·12H2O 溶于500mL 水，加入7.2g NaOH，稀释至1L；③57.21g Na2B4O7溶于1.5L 水，加入100毫升0.1 mol/L HCL稀释至2L，使用按照1：2：2的体积分数前将上述①、②、③混合。
4）甘氨酸标准溶液的配制：取267.9mg甘氨酸溶于蒸馏水，稀释至 1 L （1mL含50µg NH3-N）。
（三）操作步骤
（1）标准曲线绘制
取0、5、10、15、20 mL 甘氨酸标准溶液，用蒸馏水加至20 mL，然后加入20 mL 新配制的铜-磷酸盐溶液。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，绘制标准曲线。
（2）土壤蛋白酶活性测定
称取5g土壤置于100mL 三角瓶中，加入甲苯2mL ，放置15 min，加入20mL 1%精胶溶液，于37℃恒温培养24h，于此同时，以水代替基质作为对照。
培养结束后，将悬液过滤，取10mL 滤液，加水10mL，铜-磷酸盐溶液20mL。
显色后，用分光光度计在650nm处测定，根据标准曲线求出NH3-N含量。
以每克土壤在37℃下24h内酶解蛋白质释放的NH3-N的质量（µg）表示蛋白酶活性。
土壤蔗糖酶测定方法：3,5- 二硝基水杨酸比色法
分析意义：对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用，蔗糖酶与土壤许多因子有相关性，如与土壤有机质、氮、磷含量，微生物数量及土壤呼吸强度有关，一般情况下，土壤肥力越高，蔗糖酶活性越高。
（一）方法原理
蔗糖酶酶解所生成的还原糖与 3,5- 二硝基水杨酸反应而生成橙色的3-氨基-5-硝基水杨酸。
颜色深度与还原糖量相关，因而可用测定还原糖量来表示蔗糖酶的活性。
（二）试剂
1）酶促反应试剂：基质8%蔗糖，pH5.5磷酸缓冲液：1/15M磷酸氢二钠（11.876gNa2HPO4·2H2O溶于1L蒸馏水中）0.5ml加1/15M磷酸二氢钾（9.078gKH2PO4溶于1L蒸馏水中）9.5ml即成，甲苯
2）葡萄糖标准液（1mg/mL）
预先将分析纯葡萄糖置80℃烘箱内约12小时。
准确称取50mg葡萄糖于烧杯中，用蒸馏水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，摇匀（冰箱中4℃保存期约一星期）。
若该溶液发生混浊和出现絮状物现象，则应弃之，重新配制。
3） 3,5- 二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）
称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天）
（三）测定步骤
（1）标准曲线绘制
分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS试剂3mL混匀，于沸水浴中准确反应5min（从试管放入重新沸腾时算起），取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
（2）土壤蔗糖酶测定
称取5 g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml 8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。
摇匀混合物后，放入恒温箱，在37℃下培养24h。
到时取出，迅速过滤。
从中吸取滤液1ml，注入50ml容量瓶中，加3mlDNS试剂，并在沸腾的水浴锅中加热5min，随即将容量瓶移至自来水流下冷却3min。
溶液因生成3-氨基-5-硝基水杨酸而呈橙黄色，最后用蒸馏水稀释至50ml，并在分光光度计上于508nm处进行比色。
为了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的误差，每一土样需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。
（3）结果计算
葡萄糖（毫克）= a×4
式中，a——从标准曲线查得的葡萄糖毫克数
4——换算成1g土的系数
纤维素酶
分析意义：纤维素是植物残体进入土壤的碳水化合物的重要组分之一。
在纤维素酶作用下，它的最初水解产物是纤维二糖，在纤二糖酶作用下，纤维二糖分解成葡萄糖。
所以，纤维素酶是碳素循环中的一个重要的酶。
分析方法：硝基水杨酸比色法
试剂：1%羧甲基纤维素溶液，pH5.5磷酸盐缓冲液：由0.06M KH2PO4和Na2HPO4溶液混合制成，甲苯，3,5-二硝基水杨酸溶液：称0.5g二硝基水杨酸，溶于20ml 2N氢氧化钠和50ml水中，再加30g酒石酸钾钠，用水稀释至100ml（保存期不过7天），葡萄糖标准溶液：分别吸1 mg/mL的标准葡糖糖溶液0，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于试管中，再补加蒸馏水至1mL，加DNS溶液3ml混匀，于沸腾水浴中加热5min，取出立即泠水浴中冷却至室温，以空白管调零在波长540nm处比色，以OD值为纵坐标，以葡萄糖浓度为横坐标绘制标准曲线。
操作步骤：称10g土壤置于50ml三角瓶中，加20ml1%羧甲基纤维素溶液、5mlpH5.5磷酸盐缓冲液及1.5ml甲苯，将三角瓶放在37℃恒温箱中培养72h。
培养结束后，过滤并定容25ml。
取1ml滤液，然后按绘制标准曲线显色法比色测定。
每一实验处理均应设置以5ml水代替DNS基质的对照，为检验试剂纯度应设无土壤的对照。
纤维素酶活性以72h，10g土壤生成葡萄糖毫克数表示。