2.2 细胞破碎

渗透压法（ pressure） 2. 渗透压法（Osmotic pressure） 将细胞放在高渗透压的介质中（ 将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘 油或蔗糖溶液），达平衡后， ），达平衡后 油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化， 冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。 仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶 处理或在培养过程中加入某些抑制剂（ 处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素 ），使细胞壁有缺陷 强度减弱。 使细胞壁有缺陷， 等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。
生物类型 G+细菌 主要组成 肽聚糖 （40-90%） 多糖 胞壁酸 蛋白质 脂多糖 （1-4%） G-细菌 肽聚糖 （5-10%） 脂蛋白 脂多糖 （11-22%） 磷脂 蛋白质 酵母菌 葡聚糖 （30-40%） 甘露聚糖 （30%） 蛋白质 （6-8%） 脂类 （8.513.5%） 霉菌 植物细胞
多聚糖（几 初生壁 丁质） 次生壁 （80-90%） 脂类 蛋白质
细菌
的网状结构， 破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结
构越致密，破碎的难度越大， 构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不 及革兰氏阳性细菌的坚固； 及革兰氏阳性细菌的坚固； 的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架， 酵母 葡聚糖的细纤维构成了细胞壁的刚性骨架，甘露聚 糖形成网状结构，细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构 糖形成网状结构， 交联的紧密程度和它的厚度； 交联的紧密程度和它的厚度； 霉菌 的纤维状结构， 细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强
3.超声破碎法（Ultrasonication） 3.超声破碎法（Ultrasonication） 超声破碎法
利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。 15 的超声波探头处理细胞悬浮液 一般认为超声波破碎的机理是： 一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液 体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极 体发生空化作用，空穴的形成、 大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。 大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。
非机械方法 ：辅助方法
–2.2.3.2 化学和生物化学渗透 酸碱处理；（ ；（2 化学试剂处理； （1）酸碱处理；（2）化学试剂处理； （3）酶溶 –2.2.3.3 物理渗透法 渗透压冲击；（ ；（2 冻结（1）渗透压冲击；（2）冻结-融化法
常用破碎方法
分 机 械 法 适 应 性 可达较高破碎率，可较大规模操作， 大分子目的产物易失活，浆液分离困 难 高压匀浆 液体剪切作用 可达较高破碎率，可大规模操作，不 法 适合丝状菌和革兰氏阳性菌 超声破碎 液体剪切作用 对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧 法 烈，不适合大规模操作 X-press法 固体剪切作用 破碎率高，活性保留率高，对冷冻敏 感目的产物不适合 非 酶溶法 酶分解作用 具有高度专一性，条件温和，浆液易 机 分离，溶酶价格高，通用性差 械 化学渗透 改变细胞膜的渗透 具一定选择性，浆液易分离，但释放 法 法 性 率较低，通用性差 渗透压法 渗透压剧烈改变 破碎率较低，常与其他方法结合使用 反复冻结-融化 破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的 冻结融化 法 产物 干燥法 改变细胞膜渗透性 条件变化剧烈，易引起大分子物质失 活 类 珠磨法 作 用 机 理 固体剪切作用
2.化学渗透法（Chemical permeation） 2.化学渗透法（ 化学渗透法 permeation）
某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、 某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性 剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或 抗生素、金属螯合剂等， 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择 膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择 ）， 地渗透出来。 地渗透出来。
非 机 械 法
1.酶溶法（Enzymatic Lysis） 1.酶溶法（ 酶溶法 Lysis）
（1）外加酶法 溶菌酶 β-1，3-葡聚糖酶 β-1，6-葡聚糖酶 蛋白酶 甘露糖酶 糖苷酶 肽键内切酶 壳多糖酶等
常用的溶酶
利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞， 利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受 到部分或完全破坏后， 到部分或完全破坏后，再利用渗透压冲击等方法 破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。 利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构 和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。 和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序。
度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高； 的形成提高了细胞壁的坚硬性， 植物细胞 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物 细胞具有很高的机械强度。 细胞具有很高的机械强度。
图2.9 细胞破碎机理
细胞破碎技术
2.2.3.1 机械破碎
–高压匀浆器 工业上常用 –球磨机 –喷雾撞击法 –超声波破碎 实验室常用
玻 璃 珠
氧 化 锆
胶体磨
德国进口珠磨机
2.高压匀浆法（High-pressure homogenization） 2.高压匀浆法（High高压匀浆法 homogenization）
——大规模细胞破碎的常用方法，在微生物细胞和植物 大规模细胞破碎的常用方法， 大规模细胞破碎的常用方法 细胞的大规模处理中常采用
酶溶法的优点： 酶溶法的优点： 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少， 选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外 形完整。 形完整。 酶溶法的缺点： 酶溶法的缺点： 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。 溶酶价格高，溶酶法通用性差，产物抑制的存在。
（2）自溶法（Autolysis） 诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞 酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 酶的活力，以达到细胞自溶的目的。 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、 影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值 激活剂和细胞代谢途径等。 激活剂和细胞代谢途径等。 缺点：对不稳定的微生物， 缺点：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质 的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大， 的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度 下降。 下降。
实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎 实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎 Mickle Braun匀浆器 匀浆器； 机、 Braun匀浆器； 中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 中试规模的细胞破碎可采用胶体磨处理； 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和 在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和 WAB 德国西门子机械公司制造）。 德国西门子机械公司制造）。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。 珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。 80%以下 珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。 珠磨法适用于细胞悬浮液和植物细胞的大规模处理。
缺点： 缺点：
通用性差； 通用性差； 时间长，效率低； 时间长，效率低； 有些化学试剂有毒 。
其他方法
X-press法 1. X-press法 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成 将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25℃形成冰晶体，利 500MPa以上的高压冲击 以上的高压冲击， 用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小 孔中挤出。 孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋 在冰中的微生物变形而引起的。 在冰中的微生物变形而引起的。 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不 细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点， 适应于对冷冻敏感的生化物质。 适应于对冷冻敏感的生化物质。
（3）有机溶剂
能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀， 能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细 胞破裂，胞内物质被释放出来。 胞破裂，胞内物质被释放出来。 乙醇、异丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高 乙醇、异丙醇、甲苯、 氯仿、 级醇等。 级醇等。 与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用， 与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用， 从而使疏水性化合物溶于水溶液。 从而使疏水性化合物溶于水溶液。 盐酸胍和脲是常用的变性剂。 盐酸胍和脲是常用的变性剂。 是常用的变性剂
影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、 影响超声波的细胞破碎效率因素：频率、液体温 度和粘度、处理时间等。 度和粘度、处理时间等。 超声波破碎法是很强烈的破碎方法， 超声波破碎法是很强烈的破碎方法，适用于多数 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎， 微生物的破碎。一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌 比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差。 细菌易破碎 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。 该法在实验室小规模细胞破碎中常用。
原理： 原理：
细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（可达 细胞悬浮液在高压作用下从阀座与阀之间的环隙高速（ 450m/s)喷出后撞击到碰撞环上，细胞在受到高速撞击作 喷出后撞击到碰撞环上， 喷出后撞击到碰撞环上 用后，急剧释放到低压环境，从而在撞击力和剪切力等综合 用后，急剧释放到低压环境， 作用下破碎。操作压力通常为50-70MPa。细胞在这一系 作用下破碎。操作压力通常为 。 运动过程中经历了剪切、 的变化， 列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化， 从而造成细胞破碎。 从而造成细胞破碎。
化学渗透法优点： 化学渗透法优点：
对产物释放有一定的选择性， 对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶 质如多肽和小分子的酶蛋白透过， 质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物 质仍滞留在胞内； 质仍滞留在胞内； 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低， 细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和 进一步提取。 进一步提取。
（1）表面活性剂
表面活性剂可促使细胞某些组分溶解， 表面活性剂可促使细胞某些组分溶解，其增溶作 有助于细胞的破碎。 用有助于细胞的破碎