赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性
赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析
赤点石斑鱼LECT2基因的克隆与组织表达分析施晓峰;曲朦;王航俊;张之文;尤颖哲;丁少雄【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(049)005【摘要】基于LECT2的EST序列设计特异引物,采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼LECT2 cDNA全序列,全长601 bp,包括了79 bp的3′UTR区、468 bp 的开放阅读框(ORF)以及54 bp的5′UTR区,共编码155个氨基酸.通过与21个物种的氨基酸序列进行同源比对发现,所推导氨基酸序列与大黄鱼的相似性最高,为78%,与其他物种的相似性在40%～73%之间,表明LECT2氨基酸序列具有较高的保守性.基于LECT2基因的氨基酸序列构建的脊椎动物系统进化树与传统物种树基本吻合.同时,通过RT-PCR方法得出,LECT2在健康赤点石斑鱼多种组织中均有表达,肝组织表达量最高,感染哈维氏弧菌(Vibrio barveyi)后LECT2在脾、头肾、鳃等免疫器官中有较高表达量,而在肝脏中表达量上调最为显著,其结果证实了LECT2与赤点石斑鱼免疫应答相关,肝脏可能是赤点石斑鱼LCET2蛋白最主要的表达场所.【总页数】7页(P694-700)【作者】施晓峰;曲朦;王航俊;张之文;尤颖哲;丁少雄【作者单位】厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005;漳州市水产技术推广站,福建,漳州,363000;厦门大学海洋与环境学院,福建,厦门,361005【正文语种】中文【中图分类】Q343.1【相关文献】1.罗氏沼虾组织蛋白酶D基因的克隆及其组织表达分析 [J], 张夏青;许建和;潘茜;易乐飞;彭永兴;高焕;阎斌伦;王姗;韩振2.牙鲆dmrt1基因的克隆及其与P450arom基因的组织表达分析 [J], 文爱韵;尤锋;孙鹏;徐冬冬;吴志昊;马得友;李军;张培军3.赤点石斑鱼HSP60基因克隆及弧菌应激前后的组织表达特性分析 [J], 曲朦;施晓峰;张之文;丁少雄4.草鱼褪黑激素受体Mtnr1基因克隆及组织表达分析 [J], 胡伟;吴慧;袁汉文;郜卫华;陈敦学;郭利伟;许巧情5.香鱼LECT2基因的克隆及其组织表达差异 [J], 杨红艳;陈炯;史雨红;李明云因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
赤点石斑鱼神经坏死病毒主衣壳重组蛋白多克隆抗体的制备
赤点石斑鱼神经坏死病毒主衣壳重组蛋白多克隆抗体的制备苏友禄;郭志勋;冯娟;闫云锋;喻达辉【期刊名称】《南方水产科学》【年(卷),期】2010(006)006【摘要】把赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)神经坏死病毒(RGNNV)主衣壳蛋白(MCP)基因的重组表达质粒载体pRSET A-MCP转化至大肠杆菌(Estherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达,SDS-PAGE显示表达的重组蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在,分子量约44.5 kD.通过Ni-NTA-Agarose亲和层析柱纯化,经分析纯度达90%,之后免疫新西兰兔制备抗血清,ELISA效价达1:12 800以上.Western-blot分析结果显示,该血清与表达的重组蛋白有较强反应,说明通过原核表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.【总页数】6页(P8-13)【作者】苏友禄;郭志勋;冯娟;闫云锋;喻达辉【作者单位】中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300;中国水产科学研究院南海水产研究所,广东,广州,510300【正文语种】中文【中图分类】S917;S943【相关文献】1.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化 [J], 陈晓艳;翁少萍;殷志新;何建国2.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白的原核表达与纯化研究 [J], 翟伟锋3.鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定 [J], 付小哲;李宁求;林强;刘礼辉;吴淑勤4.鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证 [J], 付小哲;李宁求;彭媛媛;石存斌;白俊杰;吴淑勤5.斜带石斑鱼神经坏死病毒主衣壳蛋白抗体的制备 [J], 陈晓艳;何建国因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
赤点石斑鱼卵型芳香化酶基因启动子调控绿色荧光蛋白在斑马鱼早期生殖腺中的表达
鱼 的 Ｃｐ ９ ｌ ｙ ｌ ａ ｂ基 因的启动 子能指 导绿 色荧光 蛋 白
（ ｒｅ ｕ ｒｓｅ ｔｐｏｅ ，Ｇ Ｐ基 因在斑 马鱼 的神 Ｇ ｅｎ ｆ ｏｅｃｎ ｒｔ ｎ Ｆ ） ｌ ｉ 经 组织 中表达 。近期 ， ｏ ｇ ｅ ａ． 】 Ｔ ｎ ， ｔ １［建立 的转 基 因斑 ９ 马鱼 品系发现 Ｇ 基 因能在斑 马鱼 Ｃ ｐ ９ ｌ ｙ １ ａ ｂ启动 子 的 指 导 下 特 异 表 达 于 脑 的胶 质 细 胞 中 。虽 然 Ｃｐ ９ ｌ ｙ １ ａ ａ基 因 的启 动子 已在青 鲻 、金 鱼 、斑 马鱼 、 罗 非鱼 、欧 洲鲈鱼 、鳗鲡 、色 齿鲈 等多 种硬骨 鱼类
近年来 ，本 实验室 针对 石斑鱼 的特殊 发育 过程 ，
化为 雌激 素，是 雌激 素生 物合 成 中的关 键酶 和 限速
酶 。 研 究 表 明 ，鱼 类 至 少 存 在 两 种 芳 香 化 酶 ： Ｐ ５ ａｏ ４ ０ｒｍＡ 和 Ｐ ５ ａｏ ，分别 来 自性 腺和脑 ，由 ４ ０ ｒｍＢ
性腺 分化 的重要基 因【
。Ｈ ａｇ ｅ １［ ｕｎ ， ｔ ． ａ 对赤 点
收 稿 日期 ：２ ０ —５ １ ；修 订 日 期 ： ０ ９ １ —０ ０ ９０ —４ ２ ０ —０１
摘要 ： ４ ０ 香化 酶（４ ０ ｒｍ） 生物体 内合成 雌激素 的关键 酶 。为研 究赤 点石斑 鱼（ｐｎｐ ｅｕ ｋａ ａ￣ Ｐ５ 芳 Ｐ ５ ａｏ 是 Ｅ ｉｅ ｈ ｌｓ ａ ｒ ） ａ 型芳香 化酶基 因（ ａ ｙ ９ ｌ ） Ｅ Ｃｐ１ ａ ａ启动 子的调控 作用 ，构建 了 Ｅ Ｃ ｐ ９ ｌ ａ ｙ １ ａ ａ启 动子 ９个 不同 的 ５端缺 失片段 与绿 色荧光 蛋 白（ ｅｎｆ ｏｅｃｎ ｒｔｉ， Ｐ组 成 的表达载体 ，分 别命名 为 ｐ ａ ｙ ９ ｌ ． Ｇ Ｐ ． 。在 Ｃ 一 Ｇｒｅ ｕ ｒｓｅ ｔ ｏｅｎ ＧＦ ） ｌ ｐ Ｅ Ｃ ｐ１ａ ａＥ Ｆ １９ ＯＳ７ 细胞 中 的瞬时转 染实 验证 明载 体 ｐ ａ ｙ １ ａ ａＥ Ｐ Ｅ Ｃ ｐ ９ ｌ — ＧＦ ７具 有很 强 的转 录活 性 。通过 显微 注 射，将 线性 化 的 ｐ ａ ｙ ９ ｌ—Ｇ Ｐ Ｅ Ｃｐｌ ａ ａＥ Ｆ ７载体 注入斑 马鱼单 细胞期 受精卵 中，定期 在荧光 显微镜 下观 察 Ｇ Ｐ的表达 。结果 发现 Ｆ ＧＦ 在胚胎期 （ Ｐ 受精 后约 ４ ｈ 开始表达 ，主要 发生在 斑马 鱼早 期生 殖腺 细胞 中，具有 明显 的性腺 特异性 。这 ８） 说 明 Ｅ Ｃｐ ９ ｌ ａ ｙ １ ａ ａ的启动子 序列 中含有调 控其性 腺特异 表达 的顺势作 用原件 。 究为进 一步 探 明芳香化 酶在 研
赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析
赤点石斑鱼MHC IA基因的克隆与表达多态性分析沈铭辉;郑乐云;杜佳莹;王军【摘要】The major histocompatibility complex molecules (MHC I and MHC II) are fundamental components of imumune response to foreign protein antigens,and occur extensively in all vertebrate organisms. For the first time,4 complete cDNA sequences of MHC class IA chain, one of the important non-specific immune genes, were obtained from Epinephelus akaara by RACE technique. The whole sequences had 1 680 bp, which consist of: a 3' UTR, promoters, a peptide-binding region (a1), an immunoglobulin-like region (a2) ,a transmembrane region,a cytoplasmic region and 5'UTR,and the size of their coding region is 1 074-1 080 bp, which encode a 155 amino acid protein and has a molecular weight about 30. 25 ku. The tested gene has classic MHC 3D molecular structure,and exhibits abundant polymorphisms in the peptide-binding region. Using realtime PCR and SSCP technique, the MHC IA gene was observed to be expressed in all the 12 tissues studied in this paper,and high levels of expression and polymorphism were observed in immune organs such as head-kidney,spleen and thymus,while in organs such as gills and muscles that are more likely to be frequently exposed to bacterial antigens, the expression and polymorphism levels were lower. Furthermore, a phylogenetic tree was also constructed based on Neighbour-joining methods with IGC region of MHC IIB gene. The satisfactory result also meaned that the amino acid sequence of the IGC region of MHC IA shouldbe potentially informative for phylogenetic studies in fishes.%采用RACE技术,成功克隆获得赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)非特异性免疫因子MHC IA基因的4个cDNA全序列,序列全长为1680 bp,含有3'UTR、启动子、多肽结合区(α1)、IGC区(α2)、跨膜区、胞质区和5'UTR区,编码区大小为1074～1080 bp,共编码357～359个氨基酸,推测蛋白质分子质量约41.66 ku.氨基酸序列分析发现赤点石斑鱼MHCIA分子具有经典MHC蛋白分子的空间结构,在多肽结合区则存在极其丰富的变异.利用Real time PCR和SSCP技术研究了赤点石斑鱼MHC IA 的组织表达特异性和表达多态性,发现其在头肾、心、肝等12个组织器官中均能有效表达,在头肾,脾,胸腺等免疫组织表达量不仅高,表达多态性也异常丰富,而在与外界环境接触较多的鳃、肌肉、肠等组织表达较弱.此外,根据MHC ⅡB分子中相对保守的IGC区氨基酸序列构建了脊椎动物的系统进化树,也表明了该分子的IGC区氨基酸序列可以作为研究鱼类物种间进化关系的良好标记.【期刊名称】《厦门大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2013(052)001【总页数】6页(P103-108)【关键词】赤点石斑鱼;MHC IA基因;多态性【作者】沈铭辉;郑乐云;杜佳莹;王军【作者单位】厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005;福建省水产研究所,福建厦门 361013;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005;厦门大学海洋与地球学院,福建厦门 361005【正文语种】中文【中图分类】S965.334主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）由紧密连锁的高度多态基因位点所组成，广泛存在于脊椎动物体内，与免疫密切相关并编码免疫球蛋白样受体，其产物是免疫系统中极为复杂且最具多态性的一类细胞表面转膜蛋白，统称为MHC分子［1－2］.MHC由3类分子组成，其中 MHC I类分布在所有有核细胞表面，负责内源性抗原（如肿瘤抗原和病毒抗原）的加工和呈递.自Hashimoto等［3］首次获得鲤鱼MHC基因序列以来，目前已对斑马鱼、牙鲆等多种鱼类的MHC基因进行了结构与功能探讨，为研究MHC基因家族在鱼类天然免疫体系中的作用提供了重要参考.赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）是我国名贵的经济鱼类，但目前其野生资源已遭极大破坏，被世界自然保护联盟（IUCN）列为濒危物种.通过人工繁育养殖减轻捕捞压力，对保护和恢复其资源具有重要意义.但是赤点石斑鱼养殖一直存在着育苗死亡率过高、病害严重等问题，尤其石斑鱼神经坏死病毒（NNV）是赤点石斑鱼的主要病原，对赤点石斑鱼的养殖破坏极大［4］.目前对石斑鱼免疫相关基因的研究已有一些报道［5］，但尚未见对内源性抗原（病毒抗原）起主要递呈作用的MHC I类基因的相关研究.本研究以赤点石斑鱼为研究对象，通过RACE技术克隆获得了MHC IA基因的cDNA全序列，并且对其组织表达特异性和多态性进行检测，以期为进一步研究赤点石斑鱼非特异性免疫体系抵御病毒侵染的分子机制提供基础资料.1 材料与方法1.1 材料来源及处理赤点石斑鱼采集于厦门渔市场，体质量200～400 g.鲜活样品暂养7d后，将其组织（心、肌肉、肝、头肾、鳍、脑、胃、肠、鳃及性腺）取出，放入1.5mLEppendorf离心管中，置入液氮中保存备用.1.2 引物设计通过NCBI上部分鲈形目鱼类MHC IA的DNA序列（StizostedionvitreumAY057459；Sparus aurata DQ211540；Scophthalmus maximusDQ848959；Aulonocara hansbaenschi AF038552）设计 1 对引物MHC－IPF、MHC－IPR，进行 MHC IA cDNA部分序列扩增和测序.根据已获得的MHC I cDNA中间序列，分别设计用于扩增3′端和5′端的巢式锚定引物 MHCIF47、MHCIF167和 MHCIR241、MHCIR31，根据获得的MHC IA cDNA 序列设计用于 Real time PCR反应的特异性引物SSCP IF和SSCP IR（表1）.表1 赤点石斑鱼MHC IA基因克隆引物序列Tab.1 Primers for E.akaara MHC IA genes cloning注：引物中出现的部分简并引物代码表示：N＝A／C／G／T，V＝A／C／G.?1.3 cDNA的克隆参照文献［9］.利用简并引物 MHC－IPF、MHCIPR扩增MHC IA中间序列；利用RA分别同 MHCIF47和MHCIF167配对，进行3′RACE的扩增；利用MHCIR241、MHCIR31，RA 和 Oligo dT－RA 为引物，以含有同聚化尾polyA的cDNA为模板进行5′RACE扩增.1.4 Real time PCR检测以SSCPIF与SSCPIR为特异引物，对赤点石斑鱼的12个不同器官组织（脑、肠、脾、胃、血、胸腺、性腺、头肾、心、鳃、肝脏与肌肉）中MHC IA基因的表达进行检测.Real time PCR反应条件为：94 ℃ 2min，（94℃15s，53℃20s，72℃30s）×40循环，反应过程中进行实时监控.每个样品进行3次重复试验.1.5 单链构象多态性（SSCP）分析通过所设计的特异引物（SSCPIF与SSCPIR）扩增MHC IA基因PBR区.以赤点石斑鱼肌肉、胸腺、脾等12个组织的cDNA 为模板，进行 Real time－PCR，反应条件为：95 ℃ 5min，（94 ℃ 30s，53 ℃1m，72℃1m）×30循环，72℃7min.1.6 序列拼接及cDNA全序列分析用Sequencher4.1.4软件进行序列拼接，得到赤点石斑鱼MHC IA基因的cDNA 全序列.用Genetyx 4.1软件统计序列总长、各碱基百分比、GC含量等信息.用DNAStar确定其开放阅读框，并采用Garnier法推测其蛋白质二级结构.采用Swiss－model软件［6］进行空间结构预测.采用singalIP3.0（http：／／www.cbs.dtu.dk／services／）寻找信号肽、糖基化位点与跨膜结构，通过http：／／／Structure／cdd／wrpsb.cgi搜索IGC结构域.运用ClustalX进行多序列比对分析，并以 MEGA4.0软件中的邻接法（neighbor－joining，NJ）构建多物种的系统发生树，通过自举分析（bootstrap）作1 000次置信度检测.2 结果2.1 MHC IA cDNA全长的克隆和序列分析经RACE扩增及序列拼接后共得到1 680bp左右的赤点石斑鱼4个MHC IA全长cDNA序列，根据Klein等的命名规则，这4条序列分别命名为：Epak－UBA＊0101、Epak－UBA＊0201、Epak－UBA＊0301和Epak－UBA ＊ 0401 （genebank accession number：EU221232～EU221235）.赤点石斑鱼 MHC IA cDNA的编码区全长1 074～1 080bp，编码358～359个氨基酸.5′UTR区长度为99～112bp和3′UTR区长度为494～501bp，在所得的4个MHC IA cDNA序列中，存在缺失位点6个，变异位点114个，占总核苷酸数的10.6%，其中有75个位点存在两碱基替换，11个位点为三碱基替换；简约信息位点28个，占总核苷酸数的2.6%.其编码的氨基酸，存在2个缺失位点和62个变异位点，占氨基酸总长的17.3%，碱基替换主要发生在MHC IA多肽结合区（图1）.2.2 MHC IA基因的氨基酸序列分析和蛋白质结构预测以Epak－UBA＊0101为例，赤点石斑鱼 MHC IA cDNA开放阅读框编码365个氨基酸，其分子质量为41.66ku，等电点为6.01，负电核残基（Asp＋ Glu）和正电核残基（Arg＋Lys）分别为48和40个.该氨基酸序列前20位为信号肽区、21～203位为多肽结合区（peptide－binding region）、第206～299个氨基酸是免疫球蛋白样区（immunoglobulin－like region，IGC区）、308～330位为跨膜区（transmembrane region），之后为胞质区（cytoplasmic region）.MHC IA 的3个经典结构域分别定位在α1（77～107），α2（155～195）与α3（314～325）位置上（图1）.对 MHC IA蛋白链的氨基酸序列分析表明，MHC IA在多肽结合区上的第103位含有1个N－糖基化位点；5个O－糖基化位点分别位于多肽结合区的第21位、IGC区的第214，260，266位和跨膜区的第309位；5个丝氨酸磷化位点位于多肽结合区的第44，197位和IGC区的第212，215，218位；5个苏氨酸磷酸化位点位于多肽结合区上的第58，83，92，125位和IGC区的第300位；5个酪氨酸磷酸化位点位于多肽结合区上的第78，131，136，190位和IGC区上的第276位.赤点石斑鱼MHC IA具有5个半胱氨酸，分别在多肽结合区的119和183，IGC区的219，278和胞质区的338位，其中119和183，219和278分别形成两个二硫键.表2 MHC IA基因cDNA组成Tab.2 The cDNA composing of MHC IA gene? 图1 4种MHC IA基因编码区的氨基酸序列Fig.1 The encoding region amino sequence of the MHC IA from four different clones采用DNA Star软件对赤点石斑鱼MHC IA蛋白分子的二级结构进行预测，结果表明：MHC IA属于alpha＋beta型蛋白，其中α螺旋占38.4%，β片层占37%，Turn（转角）占15.9%，Coil（无规则卷曲）占9.32%.而SWISS－MODEL软件对其空间结构预测的结果表明，其三维结构与人类的相似.2.3 MHC IA基因的组织表达多态性分析通过特异性引物（SSCPIF和SSCPIR），对源于赤点石斑鱼12个组织的cDNA进行MHC IA表达丰度和多态性的检测，表明：MHC IA基因在12个组织中均有表达（图2、图3）.但不同组织体现出表达强弱及多态性差异，其中，表达量最大的组织为肝脏、肠、胸腺及头肾，最弱的组织为肌肉、血液和胃，而表达多态性最丰富的组织为胸腺和头肾，多态性最差的组织为肌肉.通过对PAGE胶上的不同条带的回收和测序，一共获得22种MHC IA核苷酸单倍型序列（Genebank accession number：EU078421～EU078442），分别编码22种不同的 MHC IA氨基酸序列，该多态序列区主要存在于MHC IA第二外显子区.图2 Real time PCR检测赤点石斑鱼不同器官组织的MHC IA表达丰度Fig.2 Tissues distribution of MHC IA fromE.akaara transcripts measured by Real time PCR2.4 赤点石斑鱼MHC IA基因的系统进化分析从NCBI下载其他脊椎动物MHC IA同源氨基酸序列，为避免由于回复突变、趋同突变、平行突变等进化“噪音”所导致的错误的系统发育信息，仅取其中的保守区域IGC区氨基酸序列与赤点石斑鱼的同源序列进行比对，并基于NJ构建系统进化树，如图4所示，NJ树的拓扑结构主要表现为：1）所有硬骨鱼类构成进化树的一个主要分支，软骨鱼类与其他脊椎动物构成另一个姐妹支；2）源于同一物种不同座位的氨基酸序列均先聚合为一支再与其他物种聚合.3 讨论3.1 赤点石斑鱼MHC IA基因结构与功能比较所得的4个MHC IA cDNA序列，其变异位点共有114个，占总核苷酸数的10.6%，在其编码的359个氨基酸中，有62个变异位点，占总氨基酸位点数量的17.3%.这些变异氨基酸位点主要集中在MHC IA蛋白的多肽结合区（α1区和α2区），这种多肽结合区氨基酸序列的多态性即为I类抗原多态性的分子基础，多态性越丰富，其抵御外界病原的能力就越强.而MHC IA蛋白的IGC区、跨膜区及胞浆区均相对保守.赤点石斑鱼MHC IA蛋白肽结合区的多态性和其他功能区的保守性是与其作为抗原递呈功能相适应的，其序列结构特征表明了MHC IA基因进化一方面受到轻链（β2m），TCR和CD8＋等其他免疫递呈因子的约束，又同时具备了与外界各种抗原结合的能力.MHC I复合物由重链（α链）和β2m组成.其主要分布在专门性抗原递呈细胞（APCs）和细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）表面，通过结合内源性病原以激活T细胞受体行使免疫反应.因此，MHC IA的蛋白空间结构将极大地影响其行使免疫递呈功能的有效性.经典的 MHC IA 蛋白链由α1、α2和α33个结构域组成，α3结构域靠近细胞膜，位于分子的底部，而α1和α2结构域则远离细胞膜，位于分子的顶部，它们共同组成了抗原结合部位和T细胞受体（TCR）识别部位［7］.我们对赤点石斑鱼MHC IA蛋白二级结构和三级结构的预测发现，该蛋白同样具有α1（77～107）、α2（155～195）和α3（314～325）3个经典结构域，其中α1和α2分别由1个螺旋和4个反向平行的β折叠组成，形成一个深沟状凹槽，α3主要由β折叠组成.在与人类及鼠类的同源位置［9］，赤点石斑鱼MHC IA同样存在4个保守的半胱氨酸，组成两个二硫键，其中一个二硫键在α2结构域内，另一个二硫键在α3结构域.可以推测这两个二硫键对于稳定MHC IA的空间结构起重要作用.赤点石斑鱼MHC IA空间结构的保守性同样意味着其抗原递呈机制与人、鼠等高等脊椎动物一致.因此，我们的工作不仅为开发赤点石斑鱼的分子疫苗奠定了基础，也为研究赤点石斑鱼免疫系统的免疫应激机制提供了手段.3.2 赤点石斑鱼MHC IA基因的组织表达特性图3 SSCP方法检测赤点石斑鱼MHC IA基因在12个正常组织中的表达Fig.3 Expression of MHC IA fromE.akaarain twelve normal tissues by SSCP图4 基于MHC IA基因IGC区氨基酸序列构建脊椎动物系统进化树（NJ树）Fig.4 Phylogenetic tree based on MHC IA amino acid sequences fromE.wakaaraand other vertebrates（NJ）鱼类MHC IA基因表达具有组织特异性.Han－sen等［14］克隆了虹鳟全长MHC I重链，并检测到MHC I类基因在心、肠、肾、胸腺、脾组织中具有较强表达，而在脑、肝组织中表达较弱.在本研究中，我们对来源于脑、心、脾、肝、头肾、肠、肌肉、血细胞、胸腺、性腺、鳃、胃等12各组织的MHC IA基因进行表达特异性分析，结果表明，赤点石斑鱼的各组织均能有效表达MHC IA蛋白，但其表达强弱和表达多态性均存在明显差异，胸腺和头肾无论在表达强度或多态性方面都体现出较强优势，可以推测其应当是赤点石斑鱼行使递呈内源性病毒抗原，引导机体进行非特异性免疫最重要的组织器官.MHC IA多肽结合区域的多样性可以作为指标，用来评估石斑鱼对病毒的抵抗力.3.3 MHC IA基因在鱼类系统研究中的应用研究资料表明，作为一个较为古老的基因家族，MHC分子大约在4～5亿年前就在低等脊椎动物中出现，并且当时就开始出现分化［15］.因此 MHC可以作为一个良好的分子进化指标在高分类阶元范围内研究物种间的进化关系及基因本身的进化历程.但由于MHC IA分子各区段的进化速率差异很大，部分区段如多肽结合区的序列进化速率过快，累积了大量的突变，从而湮没了大部分真实的进化信息，不利于用来进行进化分析.因此我们选择了最为保守的IGC区段的氨基酸序列来构建脊椎动物的进化树.通过NJ法构建的进化树所示，其拓扑结果清楚地表明了所有的脊椎动物分为两个主要分支，所有硬骨鱼类集中在一个分支，而其他高等脊椎动物在另一个分支，该结果不仅说明了硬骨鱼类进化的单源性，也证实了MHC IA分子在原始脊椎动物分化前即已存在.【相关文献】［1］王重庆.分子免疫学基础［M］.北京：北京大学出版社，1997：139－140.［2］Paul W E.Fundamental immunology［M］.4th ed.Philadelphia：Lippincott－Raven Publishers，1999：297－298.［3］Hashimoto K，Nakanishi T，Korosawa K.Isolation of carp genes encoding major histocompatibility complex antigens［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1990，87：6863－6867.［4］陈信忠，苏亚玲，龚艳清.闽南地区养殖石斑鱼病毒性神经坏死病初步研究［J］.福建水产，2003，9：11－14.［5］丁少雄，张之文，杜佳莹，等.赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）MHC IIB基因的克隆与表达多态性分析［J］.海洋学报，2009，31（2）：129－138.［6］Schwede T，Kopp J，Guex N，et al.SWISS－MODEL：an automated protein homology－modeling server［J］.Nucleic Acids Research，2003，31（13）：3381－3385. ［7］Bjorkman P J，Samraoui B，Samraoui B.Structure of the human class I histocompatibility antigen，HLA－A2［J］.Nature，1987，329：506－512.［8］LeBouteiller P，Lenfant F.HLA－G gene：the more classical among the non－classical［J］.M S－Medecine Sciences，1997，13（12）：1436－1444.［9］West A P Jr，Bjorkman P J.Crystal structure and immunoglobulin G binding properties of the human major histocompatibility complex－related Fc receptor［J］.Biochemistry，2000，39（32）：9698－9708.［10］Hansen J D，Strassburger P，Du Pasquier L.Conservation of an alpha2domain within the teleostean world，MHC class I from the rainbowl trout on corhynchus mykiss ［J］.Dev Comp Immunol，1996，20：417－425.［11］Lie O，Grimholt U.The major histocompatibility complex of fish：genetics structure and function of the MHC of teleost sepcies［M］∥The major histocompatibility complex of domestic animal species.Boca Raton，Florida，USA：CRC press，1996：17－33.。
赤点石斑鱼HSP60基因克隆及弧菌应激前后的组织表达特性分析
性 、 可溶 的凝 聚 蛋 白恢 复天 然 构象 ＿ 。另 外 ， 不 ６ ］ 它
还 可作 为分 子伴 侣 和不 同 的多肽 链 非特 异性 结合 催
化 介导 蛋 白质 特定 构 象 的形 成 ， 与 体 内蛋 白质 的 参
折 叠 、 配 和转 运 ＿ 。ＨＳ ６ 装 ６ ］ Ｐ ０是 分 子 量 为 ６ ｕ的 Ｏｋ
中在 对 环 境 理 化 因 子 的 应 激 方 面 ， 关 于 ＨＳ ０ 而 Ｐ６ 在 鱼体 受到外 界 病菌感 染 应激 时 的表达 调控 影 响 目 前 尚未 见报 道 。
３端和 ５端 Ｒ Ｃ Ａ Ｅ反 应 的 巢 式 特 异 性 引 物 Ｆ ２ ０ １３ ，
Ｆ ５ ５Ｒ１７ Ｒ ３ 。根据 所获得 ＨＳ ０的 ｅ ＮＡ 序 １２ ， ８ ， １ ７ Ｐ６ Ｄ 列选取特定 区段设计 用于实 时 Ｐ Ｒ反应 的特 异性 引 Ｃ 物 ＨＳ — ｔ ５４和 ＨＳ — ｔ ６ ６ Ｐ ａ ０ Ｆ Ｐ ａ ７ 。根 据所 得 Ｏ Ｆ序 Ｒ Ｒ
２ ３ １ 模 板 的制备 ．．
使 用 Ｔｒ ｏ 分 别 提 取 健 康 和攻 毒 后 的 赤 点 石 ｉ１ ｚ 斑鱼各 个 组织 总 ＲＮＡ， 个样 品取 ５／ 每 ＊ ＲＮＡ 置 于 Ｉ Ｒ ａｅｆｅ 离 心管 中 ， 别加 入 １／ ｉｏｄ — Ａ， ｎ ｓ—ｒｅ 分 ｚ Ｏｌ Ｔ Ｒ Ｌ ｇ
列与其他 物种 的比对 结果 ， 在保 守外显 子 区段设计 引 物 Ｆ ０ ７ Ｒ ０ ８ Ｆ ９和 Ｒ ６ １作为 扩增基 因组 的引 １ ５ ， １ ９ ，６ １５ 物 。所 设计引 物序列见 表 １ 所 有 引物均 由上 海英 骏 ， 生物 工程公 司（ ｖｔ ｇｎ 合成 。 ｉ ｉｏｅ） ｎ ｒ
受 到病菌 感染 后 的炎症 反应 中所 起作 用 的相关 研究
赤点石斑鱼4 种同工酶的组织分布及基因位点分析
!/&-.#9-% VT SDH RHIS=QNK >JKTNQITKN5=WH @HK @INW=H?S HKHQSIJ>DJIH6=6 LJEI =6JXT5H ) ./0、 123、 423、 4. + LIJ5 6HRH? S=66EH6 ) 5E6QKHU K=RHIU Y=W?HTU DHNISU ZIN=?U 6>KHH?U @J?NW + JL !"#$%"&%’() *+**,* FHIH 6SEW=HWU N?W SDH KJQ= N?W >DH?JST>H6 FHIH NK6J N?NKTXHW9 0DH IH6EKS6 6DJFHW SDNS NKK =6JXT5H >IH6H?SHW S=66EH 6>HQ=L=Q=ST9 ./0 H?QJWHW ZT LJEI KJQ=9 123 H?XT5NS=Q ZN?W FN6 5JIH SDN? , JL ST>=QNK SHKHJ6S 123 >DH?JST>H69 0FJ Y=?W6 JL 423 ) 5 ’ 423U 6 ’ 423 + N?W J?H ST>H JL 4. FHIH LJE?W =? !- *+**,*9 2+% :(.3&% !"#$%"&%’() *+**,*； =6JXT5H； HKHQSIJ>DJIH6=6； S=66EH 赤点石斑鱼 !"#$%"&%’() ./*,* 属于酯科 /HIIN?=WNH 石斑鱼属 !"#$%"&%’()U 肉质鲜美、 营养丰富， 是名贵 [!\ 的经济鱼类品种。 目前对其繁殖生物学已有研究 ， 但对石斑鱼的生化遗传研究仅见网纹石斑鱼乳酸脱氢 酶组织特异性的报道 [ $ \ 。 本文用聚丙烯酰胺垂直梯度凝胶电泳法对赤点石斑鱼 - 种组织进行了初步研究， 探讨其同工酶系统的遗传基础，为赤点石斑鱼的遗传多样性分析和品种改良提供有价值的生化遗传指 标。
赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA的克隆及其表达的组织特异性(1)
动物学报 50(5):791-799,2004A cta Zoologica S i nica 赤点石斑鱼两种芳香化酶cD NA的克隆及其表达的组织特异性3李广丽1,2 刘晓春1 张 勇1 贝锦新1 林浩然1331.中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室,广州51027522.湛江海洋大学水产学院,广东 湛江524025摘 要 以赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)脑垂体中提取的RNA为模板,根据芳香化酶的保守序列设计引物,利用G eneRacer TM技术,克隆出两种芳香化酶即脑芳香化酶(P450aromB)和性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA,其全长分别为1901bp(编码509aa)和1833bp(编码518aa)。
序列分析结果表明,赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA序列的同源性为5116%,氨基酸序列之间同源性为6215%,与斜带石斑鱼两种芳香化酶氨基酸同源性分别为9417%和9719%。
对8个科的10种鱼进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。
以特异性引物扩增雌、雄赤点石斑鱼各种组织(垂体、嗅球、端脑、下丘脑、中脑、后脑、延脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、性腺、鳃、胃、肠、皮肤、脂肪、肌肉、头肾、胸腺、鳔),以β2actin作内标比较各组织芳香化酶基因表达量的差异,结果表明,赤点石斑鱼脑芳香化酶(P450aromB)有广泛的组织分布,脑和垂体的表达量很高,各组织表达量有明显的雌、雄差异;而性腺芳香化酶(P450aromA)表达主要集中于垂体和性腺,且不论雌雄,其性腺表达量均高于脑垂体,和P450aromB的表达模式明显不同,表现为在脑部,P450aromB表达量高于P450aromA,而在性腺,P450aromA表达量高于P450aromB,两种芳香化酶在脑垂体和性腺出现重叠表达[动物学报50(5):791-799,2004]。
赤点石斑鱼微卫星DNA的筛选
关 键 词 ：赤 点 石斑 鱼 ；微 卫 星 ；Ｐ Ｒ 混 合 池 法 Ｃ
中图 分 类 号 ：Ｑ ９ ９ ４ ５． 文 献 标 识 码 ：Ａ
Ｉｏｌｔｏ ｏ ｉｒ ｓ ｔ Ｉｌｅ Ｄ ＮＡ ｎ Ｅｐｉ ｅ ｅ ｕｓａ ａａ ａ ｓ ａ ｉｎ ｆ ｍ ｃ ｏ ａ ｅ ｌｔ ｉ ｎ ｐｈ ｌ ｋ ｒ
ＬＩ Ｎｅ ｇ ｆ ｎ ， Ｓ Ｙｏ ｇ ｑ ａ ＤＩ Ｎ ｎ —ｅ ｇ Ｕ ｎ — ｕ ｎ 。 ＮＧ ｈ ｏ ｘ ｏ ｇ ， Ｗ ＡＯｃａ ｏ ａ ｈ １ ｐａ ｔ ｎ ｅ ｎ ｇｒ ｐ ｙ，Ｃｏｌｇ ｆ Ｏｃａ ｏ ａ ｈ ｎ ｖｒ ｎ ｎａ ｃｅ ｃ ｏ ｌｅ ｅｏ ｅ ｎ ｇｒ ｐ ｙ ａ ｄ Ｅｎ ｉｏ ｍｅ ｔｌＳ ｉｎ ｅ，Ｘｉｍｅ ｉｅｓｔ ａ ｎＵｎ ｖ ｒｉｙ，
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动物学报 50(5):791-799,2004A cta Zoologica S i nica 赤点石斑鱼两种芳香化酶cD NA的克隆及其表达的组织特异性3李广丽1,2 刘晓春1 张 勇1 贝锦新1 林浩然1331.中山大学水生经济动物研究所暨广东省水生经济动物良种繁育重点实验室,广州51027522.湛江海洋大学水产学院,广东 湛江524025摘 要 以赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)脑垂体中提取的RNA为模板,根据芳香化酶的保守序列设计引物,利用G eneRacer TM技术,克隆出两种芳香化酶即脑芳香化酶(P450aromB)和性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA,其全长分别为1901bp(编码509aa)和1833bp(编码518aa)。
序列分析结果表明,赤点石斑鱼两种芳香化酶cDNA序列的同源性为5116%,氨基酸序列之间同源性为6215%,与斜带石斑鱼两种芳香化酶氨基酸同源性分别为9417%和9719%。
对8个科的10种鱼进行了分子系统进化树分析,结果与根据传统的形态学和生化特征分类进化地位基本一致。
以特异性引物扩增雌、雄赤点石斑鱼各种组织(垂体、嗅球、端脑、下丘脑、中脑、后脑、延脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、性腺、鳃、胃、肠、皮肤、脂肪、肌肉、头肾、胸腺、鳔),以β2actin作内标比较各组织芳香化酶基因表达量的差异,结果表明,赤点石斑鱼脑芳香化酶(P450aromB)有广泛的组织分布,脑和垂体的表达量很高,各组织表达量有明显的雌、雄差异;而性腺芳香化酶(P450aromA)表达主要集中于垂体和性腺,且不论雌雄,其性腺表达量均高于脑垂体,和P450aromB的表达模式明显不同,表现为在脑部,P450aromB表达量高于P450aromA,而在性腺,P450aromA表达量高于P450aromB,两种芳香化酶在脑垂体和性腺出现重叠表达[动物学报50(5):791-799,2004]。
关键词 赤点石斑鱼 芳香化酶 cDNA 组织分布Cloning and expression of t w o cytochrome P450aromatase genes in red2spotted grouper Epinephel us akaa ra3L I Guang2Li1,2,L IU Xiao2Chun1,ZHAN G Y ong1,B EI Jin2Xin1,L IN Hao2Ran1331.Institute of Aquatic Economic Animals and Guangdong Provincial Key Laboratory for Aquatic Economic Animal,Zhongshan Universi2ty,Guangzhou 510275,China2.Fisheries college,Zhanjiang Ocean University,Zhanjiang 524025,Guangdong,ChinaAbstract The cDNA sequences encoding two distinct cytochrome P450Aromatases,namely P450aromB and P450aromA,were isolated from pituitary of the red2spotted grouper Epinephelus akaara by G eneRacer TM.The P450aromA cDNA is1833bp in length,and the open reading frame encodes a putative protein of518amino acids.The P450aromB cDNA is1901bp in length,and the open reading frame encodes a putative protein of509amino acids.Se2 quence and phylogenetic analysis showed that these two P450arom genes of the red2spotted grouper are the orthologs of previously identified P450arom genes in the orange2spotted grouper,and results were similar to those analyzed by tradi2 tional morphology and biochemistry in their evolution status.The sequence analysis indicated that the cDNA sequence and the amino acids homogeneity between them were5116%and6215%,res pectively,and the highest identity to orange2 spotted grouper were9417%(P450aromB)and9719%(P450aromA).The ex pression of both P450aromA and P450aromB genes in different tissues of the red2spotted grouper were further examined using RT2PCR in21tissues be2 2004203222收稿,2004204224接受 3国家海洋863项目(2001AA621010)、广东省科技计划项目(A3050201)、教育部科学技术研究重点项目(02105)和国家自然科学基金项目(39970586)资助[This research was funded by the grants from State Ocean863Project(No12001AA621010),Guangdong Provincial Scientific and Technical Program(No1A3050201),Leading Program of State Education Ministry(No102105),and the NationalNatural Science Foundation of China(No139970586)]33通讯作者(Corresponding author). E2mail:ls32@zsu1edu1cn ν2004动物学报Acta Zoologica Si nicatween male and female fish.The expression in gonad(P450aromA>P450aromB)was opposite to that in brain (P450aromB>P450aromA),there were overlapping expression of the two genes in neural and gonadal tissues[Acta Zo2 ologica Sinica50(5):791-799,2004].K ey w ords Red2spotted grouper,Epinephelus akaara,Cytochrome P450aromatase,cDNA,Tissue distribution 赤点石斑鱼(Epi nephel us akaara)为我国名贵的海产经济鱼类之一,为雌雄同体,雌性先熟鱼类,存在性转化现象(Tanaka et al.,1990a);其肉质鲜美,营养丰富,经济价值甚高,深受养殖户的欢迎,但因没有足够数量的雌雄同步成熟亲鱼,给人工繁殖造成很大的困难,目前苗种仍主要来源于自然海区捕捞和进口,严重制约其增养殖事业的发展。
因此,获得数量充足的、雌雄同步成熟的亲鱼,是海水鱼类养殖事业发展的关键。
芳香化酶是类固醇激素代谢中的一种重要酶类,属于细胞色素P450家族中的一员,广泛存在于大多数脊椎动物的脑和垂体中,它可催化某些雄激素转化为雌激素,是雌激素生物合成中的关键酶和限速酶。
研究表明,芳香化酶可以影响哺乳动物中枢神经系统的功能和发育,调节神经内分泌和繁殖功能以及性行为(Lephart,1996),并参与非哺乳动物性腺分化的调控(Pifferrer et al.,1994),很多实验已证实芳香化酶可控制多种鱼类的性别分化和性别转化(Nakamara et al.,1998)。
迄今为止,已从虹鳟(Tanaka et al.,1992)、鲫(Tchoudakova et al.,1996)、青 (Fukada,et al.,1996)、斑点 (Trant,1994)、斑马鱼(K ishida and Callard,2001)、日本鳗鲡(Ijiri et al.,2003)等淡水硬骨鱼和牙鲆(K itano et al., 1999)、欧洲舌齿鲈(Valle et al.,2002a)等海水硬骨鱼类的卵巢中克隆出性腺芳香化酶基因,甚至软骨鱼类大西洋 中的芳香化酶基因也被克隆(I 2 jiri et al.,2000)。
此外,在金鱼(Tchoudakova et al.,1996;G elinas et al.,1998)、斑马鱼(K ishida et al.,2001;Callard et al.,2001)、虹鳟(Valle et al.,2002b)等鱼类中已克隆出芳香化酶基因的第二种形式———脑芳香化酶,舌齿鲈脑中较低的芳香化酶活性也暗示着在这种鱼可能也存在着芳香化酶的第二种基因形式(Valle et al.,2002a)。
本文应用G eneRacer TM方法,克隆赤点石斑鱼脑芳香化酶(P450aromB)和性腺芳香化酶(P450aromA)的cDNA全长,并比较这两种芳香化酶在不同性别赤点石斑鱼组织中的mRNA表达,旨在深入研究赤点石斑鱼性腺发育、性分化和性逆转的分子机制及其基因调控,为人工控制赤点石斑鱼性别提供基础资料。
1 材料和方法111 材料所用赤点石斑鱼购自广东省水产厅大亚湾鱼种增殖中心的海水养殖基地,雌雄鱼各3尾,均为性成熟个体,实验鱼经尾静脉取血后立刻取垂体、嗅球、端脑、下丘脑、中脑、后脑、延脑、心脏、肾脏、肝脏、脾脏、卵巢、鳃、胃、肠、皮肤、脂肪、肌肉、头肾、胸腺和鳔,放入液氮中运回实验室,存于-80℃冰箱待用。