致突变作用实验方法
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Ames实验解析
化学毒物致突变作用的后果
观察化学毒物致突变作用的基本方法
------致突变试验
遗传学终点(genetic endpoint)： 在致突变试验中观察到的现象所反映的各种 事件的统称。
一、观察项目的选择
1.观察效应终点的类型：
(1)DNA完整性改变
(2)DNA重排或交换 (3)DNA碱基序列改变（基因突变） (4)染色体完整性改变（染色体畸变） (5)染色体分离改变（非整倍体和多倍体）
❑非整倍体(aneuploid)
❑多倍体(polyloid)
❑非整倍体(aneuploid)
含义：指细胞丢失或增加一条或几条染色体。 类型：缺体(2n-2)、单体(2n-1)、 三体(2n+1)、四体(2n+2) 后果：染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能 影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。
❖致突变物(mutagen)：凡能引起生物体遗传物质 发生改变的化学物质或任何环境因子，又称诱变 剂。 ❖遗传毒物(genotoxic agent)：由于致突变物能损 伤遗传物质，因此致突变物又称为遗传毒物。
化学毒物致突变的类型
染色体改变
基因突变
碱 基 置 换
移 码 突 变
染 色 体 结 构 畸 变
突变依其发生的方式分为：
1.自发突变 (spontaneous mutation) 2. 诱发突变 (induced mutation)
➢自发突变 (spontaneous mutation)
❖概念：是由于普遍存在的未知因素作用 下，在自然条件下发生的突变。 ❖特点：发生过程长、频率很低，与物种 进化有关。
例如： 21-三体综合征(Down氏综合征、先天愚型）
❑多倍体(polyloid)
第七章外源化学物致突变作用详解演示文稿
第二十七页，共100页。
染色体插入和重复示意图
染色体的臂间倒位
第二十八页，共100页。
染色体相互易位示意图
第二十九页，共100页。
三、非整倍体和多倍体 (aneuploidy and polyloid) 细胞的染色体数目不同于正常的染 色体数目。 或称为基因组突变（genomic mutation) 即基 因组中染色体数目的改变 • 染色体数目异常以二倍体细胞为标准进行命 名。 • 非整倍体指增加或减少一条或几条染色体； • 多倍体指以染色体组为单位的增加。
变作用。这项研究结果不但有助于研究基因的本 质和基因如何控制代谢作用及个体发育，有利于 通过突变基因进行染色体结构分析研究，而且在 诱变育种发展农业生产方面也有重要意义。
1946年获诺贝尔
生理学医学奖。
第五页，共100页。
突变作用的研究史
20世纪50年代，Watson 和Crick阐明了DNA的结构，为研 究突变机理开辟了一条新的途径。
指染色体结构改变，它是指遗传物质大的改变。一般可用 光学显微镜检查适当有丝分裂中期的染色体来发现。分染 色单体型畸变和染色体型畸变。
结构异常:缺失 (deletion)
重复 (duplication) 倒位 (inversion)
易位 (translocation)
第二十六页，共100页。
染色体缺失及环状染色体的形成图
产生原因：基因重组、基因突变、染色体成分 改变、细胞质变化。
• 突变（Mutation）遗传物质自身发生改变 及其引起的变异。分为自发突变和诱发突 变
第九页，共100页。
• 遗传毒理学 (genetic toxicology) 属毒理学下属三级学科,是研究化学性和 放射性物质对机体遗传物质的损害作用 （致突变作用）及可能引起的健康效应。
致突变试验的概念
致突变试验的概念引言突变试验是一种重要的实验方法，用于研究有机生物体遗传物质的突变现象。
通过此类试验，我们能够更好地了解突变的发生原理、频率和遗传效应等。
本文将全面、详细、完整且深入地探讨突变试验的概念及其重要性。
什么是突变试验突变试验是一种人工诱发或检测自然发生突变的实验方法。
通过这种方法，我们可以观察到一种或多种突变体形成的频率以及其对有机生物体的遗传特性造成的影响。
突变试验有助于研究突变与遗传的关系，并在诸多领域中有着广泛的应用。
突变试验的重要性突变试验在科学研究中具有重要作用：1. 突变频率研究通过突变试验，我们能够确定特定条件下突变发生的频率。
这对于评估化学物质、辐射等因素对基因组的影响至关重要。
突变频率研究有助于评估环境中的潜在危害物质，为人类健康和环境保护提供科学依据。
2. 突变机理研究突变试验可以帮助我们探索突变机理。
无论是通过人工诱发突变还是检测自然突变，我们都能够分析突变的形成原因和过程，从而更好地理解基因组的稳定性和突变的遗传效应。
3. 新物种培育突变试验也被广泛应用于农业和畜牧业领域。
通过诱发或筛选出特定突变体，我们可以培育出具备重要经济价值的新品种。
比如在小麦育种中，突变试验为生产高产量、耐逆性强的种子提供了有效的方法。
4. 肿瘤治疗研究突变试验在肿瘤治疗研究中发挥着关键作用。
通过检测肿瘤细胞的突变特征，我们可以选择最有效的治疗方案。
突变试验为个体化治疗提供了基础，有助于提高肿瘤治疗的准确性和疗效。
突变试验的类型突变试验可以分为几类，每一类都有其特定的目的和应用：1. 诱变试验诱变试验是通过外界因素的诱导来诱发一定范围内的突变。
例如，使用化学物质或辐射来处理基因组样本，观察突变频率和类型的变化。
诱变试验常用于评估新药物、新材料等的遗传毒性以及评估环境中的突变危险性。
2. 随机突变试验随机突变试验是在自然条件下观察和检测突变。
通过对大量有机生物样本的遗传物质进行分析，我们可以获取突变的频率和类型信息。
外源化学物致突变作用
? 染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。
第三节 化学毒物致突变作用的机制及后果
3.碱基类似物（Base analogs ）取代
影响细胞分裂过程的因素：
纺锤体
微管蛋白的合成与聚合
微管结合蛋白的合成与功能发挥
2)碱基切除修复
(base excision repair, BER)
? DNA糖基酶识别、水解受损碱基→受损碱基脱落→AP位点→AP内切酶切断与受损碱基连接的脱氧核糖→聚合酶、连接酶完成修复
3.错配修复（mismatch repair, MMR）
? 识别、去除错配的碱基对（G：T，A：C）
个体对致突变物敏感性差异的原因有:
1)代谢酶的遗传多态性;
2)修复能力差异;
3)宿主因素.
直接修复和切除修复
1.直接修复
1).光复活
光裂合酶切除紫外线产生的胸腺嘧啶二聚体；进化程度越高此功能越弱
2)“适应性”反应（O6-甲基鸟嘌呤修复）
O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（胱氨酸残基接受甲基），修复烷基化的鸟嘌呤，可阻止DNA交链形成，在修复过程中不可逆性失活，但该酶具诱导性
无义突变:mRNA上的密码子由氨基酸编码密码子变成非编码的终止密码(UAG、UGA、UAA)。基因产物是不完全或是无功能的
2.移码突变（frameshift mutation）
? 指发生一对或几对（3对除外）的碱基增加或减少，以致从受损点开始碱基系列（阅读框架）完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸
(一) 代谢酶遗传多态性
遗传多态性(genetic polymorphysm )
致突变作用
v 受 试 物 如 不 溶 于 水 ， 可 用 二 甲 基 亚 砜 （DMSO）或乙醇作溶剂，DMSO用量每皿不 超过0.5ml，乙醇不超过0.1ml。
36
v 对照组
v 用溶媒作阴性对照，已知致突变原作阳性对照。 v 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行设
加S9与不加S9的对照，以证实其为间接诱变物。
z 本身不引起突变，必须在体内经过代谢活化 后才具有致突变作用的外源化合物，则称为 间接致突变物(indirect mutagen)。
20
突变的不良后果
突变的不良后果
体细胞突变
生殖细胞突变
癌致 变畸
配
自先
衰
子死发天
老
死胎流畸
亡
产形
21
药物致突变作用的检测方法
z 用短期致突变试验来预测化学物质潜在致癌性 的设想，自70年代以来逐步得到证实，并为世 界所公认。据不完全统计，70年代发展和建立 起来的短期致突变方法多达100多种，但均各有 优缺点，需要不同检测方法的互相补充和引证。
23
z 优点： 1.可用来作为诱变指示物的微生物有噬菌体、
细菌和真菌等。 2.微生物具有繁殖快、个体数量多、容易观察
检出等特点，而且方法较为敏感、检出率较高、 试验周期短、费用也较低。
24
缺点：
1.微生物是单细胞生物，与哺乳动物及人类有 较大的差别，例如核结构不同、DNA裸露而且 数量少、分子小、对化学诱变原不能进行代谢 活化或降解以及缺乏免疫系统等。
v 同法滴加四环素溶液，可鉴定PAQ1质粒。
33
⑤ 自发回变数测定：受试菌株在保存或培养 过程中，能产生自发回变。
v 不 同 菌 株 的 自 发 回 变 数 有 一 定 范 围， T A97( 9 0 ~ 1 8 0 ) 、 T A98( 1 5 ~ 6 0 ) 、 TA100(75~200)、TA102 (240~360)。
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v 对照组
v 用溶媒作阴性对照，已知致突变原作阳性对照。 v 对需使用间接诱变物作对照时，应注意平行设
加S9与不加S9的对照，以证实其为间接诱变物。
z 本身不引起突变，必须在体内经过代谢活化 后才具有致突变作用的外源化合物，则称为 间接致突变物(indirect mutagen)。
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突变的不良后果
突变的不良后果
体细胞突变
生殖细胞突变
癌致 变畸
配
自先
衰
子死发天
老
死胎流畸
亡
产形
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药物致突变作用的检测方法
z 用短期致突变试验来预测化学物质潜在致癌性 的设想，自70年代以来逐步得到证实，并为世 界所公认。据不完全统计，70年代发展和建立 起来的短期致突变方法多达100多种，但均各有 优缺点，需要不同检测方法的互相补充和引证。
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z 优点： 1.可用来作为诱变指示物的微生物有噬菌体、
细菌和真菌等。 2.微生物具有繁殖快、个体数量多、容易观察
检出等特点，而且方法较为敏感、检出率较高、 试验周期短、费用也较低。
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缺点：
1.微生物是单细胞生物，与哺乳动物及人类有 较大的差别，例如核结构不同、DNA裸露而且 数量少、分子小、对化学诱变原不能进行代谢 活化或降解以及缺乏免疫系统等。
v 同法滴加四环素溶液，可鉴定PAQ1质粒。
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⑤ 自发回变数测定：受试菌株在保存或培养 过程中，能产生自发回变。
v 不 同 菌 株 的 自 发 回 变 数 有 一 定 范 围， T A97( 9 0 ~ 1 8 0 ) 、 T A98( 1 5 ~ 6 0 ) 、 TA100(75~200)、TA102 (240~360)。
Ames试验
Ames试验原理
S9是什么
• 因为许多外源化学物是间接诱变剂，需经过代谢活化转变为亲电子的终致突 变物才能与DNA反应，引起突变。鼠伤寒沙门氏菌缺乏哺乳动物的代谢酶， 微量检测直接及间接诱变剂，在进行Ames试验时，应分别进行不加及加代 谢活化系统的检测。而在生物体内参与代谢活化的主要酶系是混合功能氧化 酶系，所以，在Ames试验中加入的代谢活化系统应主要是混合功能氧化酶 系，一般是加入S9混合液。S9即经多氯联苯诱导的大鼠肝匀浆，经 9000r/min离心得到的上清液。在S9中再加入一些辅助因子，如辅酶Ⅱ （NADP+）、葡萄糖-6-磷酸，K+、Mg2+及缓冲液等组成S9混合液（S9mix）
• 为使受试物在体外测试中受到同活体类似 的代谢活化作用，在试验中采用将哺乳动 物的肝细胞微粒体（微粒体酶）及受氢系 统一并加入培养基中，进一步提高实验方 法的灵敏度。
• 标准试验菌株（配套菌株）：有四种 • TA98 、TA97：检测移码突变 • TA100：检测碱基置换突变 • TA102：对醛、过氧化物及DNA交联剂较敏感 • 只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物。 • 只有在四种试验菌株得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物。
• 不加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物。 • 加S9混合液得到阳性结果，说明受试物是间接致突变物。 • 突变型菌株的某些特征有可能会在贮存过程中丢失或变异，所以在Ames试
验前必须对所有菌株进行基因型鉴定、自发回变数鉴定及对鉴别性致突变物 的反应鉴定。鉴定合格后才能用于试验，否则应重新挑选菌种。 • Ames试验的方法分为点试验法、平板掺入法及预培养平板掺入法。
• 不足之处 • 微生物的遗传信息仅为哺乳动物的1/6； • 微生物的DNA修复系统没有哺乳动物复杂而精巧； • 微生物无免疫功能，而哺乳动物则具有复杂的免疫监视机能。 • 少数不在肝脏中进行代谢转化的外来化合物，本法不能检出其突变性，如苏
昆虫药物A-L12种提取粗蛋白对小鼠的致突变作用实验
蛋白质提取
※ 蛋白质 精确称取一定量的试虫部分，加入胰蛋白酶 和蒸馏水(酶的质量和固液比各设5个梯度)，在 10000r/min下匀浆3min。用0.25mol/L的NaOH溶 液调至pH为7.0，经过一定的酶解时间(设5个梯度)， 一定的酶解温度(设5个梯度)。然后升温至70℃杀 酶0.5h，置冰箱中冷藏过夜。最后将虫渣过滤，在 80℃下烘干，得到酶法提取的粗蛋白质。（胰蛋 白酶溶解法），12个部分提取得A-L号供试粗蛋白。
小鼠实验
※ 小鼠致突变作用
精子畸形
腹腔注射 A-L 腹腔注射 生理盐 水（阴性对照） 腹腔注射 环磷酰胺 （阳性对照）
骨髓细胞 微核
实验室研究
※ 实验室研究方案 2014/5/28---2014/10/28 五种昆虫身体各部分分离期
头部[带触角]
肢脚部[6只]
身体部[带翅膀]
2014/10/29---2015/10/28 A-L蛋白质提取和致突变试验时期 2015/10/29---2016/05/30 试验数据统计及论文撰写发表期
白僵蚕
分割:头部（带触角），肢脚部（6只），身体部（带翅膀）
美洲大蠊
※ 身体各部分
合计：12个部分 喙尾琵琶甲
不分割
分割:头部（带触角），肢脚部（6 只），身体部（带翅膀）
蚕蛹
分割:头部，肢脚部（6只），身体部（带翅膀）
白蜡虫
分割:胸部（前3节，胸足3对），腹部（后10节，腹足4对，尾足1对）
白僵蚕
研究目的及成果、意义
预期研究成果：公开发表论文3-4篇。 本课题研究出科学数据做为依据，五种 昆虫进行抗惊厥、抗凝、催眠、抗癌、 降糖、抗菌、消炎、解毒、调节机体免 疫功能、提高抗病能力、降脂、等药理 作用的机制更深一步的阐述和各部分的 开发应用提供遗传毒性资料。
第六章致突变作用及其评价
第六章致突变作用及其评价一、物理致突变作用物理致突变作用包括辐射和高温等。
辐射致突变作用主要有电离辐射和非电离辐射两类。
电离辐射直接作用于DNA分子，产生切割和离子化，导致碱基的改变和突变；非电离辐射通过激发态分子产生自由基，再与DNA发生反应，引起碱基缺失、骨架断裂等突变。
高温致突变作用主要通过破坏DNA的双螺旋结构，导致碱基的改变和突变。
评价物理致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和克隆肥大度等。
突变频率是指单位时间和单位器官细胞中突变细胞的比例，可以通过突变频率实验来测定。
突变谱则是指突变细胞中各类突变的比例，可以通过分子生物学技术和测序方法来分析。
克隆肥大度是指突变细胞在培养基上形成的克隆的大小和数量，可以通过克隆形成试验来测定。
二、化学致突变作用化学致突变作用包括化学射击和化学诱变剂两类。
化学射击是指化学物质直接与DNA发生反应，引起碱基改变和突变。
化学诱变剂则是通过诱导DNA产生加合法或错配法复制，导致突变。
常见的化学诱变剂有碱基类似物、交联剂和DNA切割剂等。
评价化学致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和鉴定突变基因等。
突变频率的测定方法与物理致突变作用的评价方法相同。
突变谱的分析和鉴定突变基因的方法则需要借助生物学、分子生物学和遗传学等多种技术手段，如突变谱分析和基因克隆。
三、生物致突变作用生物致突变作用是指生物体内的内源性或外源性因素引起的突变。
内源性因素包括细胞自身的突变机制和DNA复制错误等，外源性因素则包括病毒、细菌和真菌等微生物的感染。
评价生物致突变作用的方法主要有突变频率、突变谱和鉴定突变基因等。
突变频率和突变谱的测定方法与物理致突变作用和化学致突变作用的评价方法相似。
鉴定突变基因的方法则需要借助生物学、分子生物学和遗传学等多种技术手段，如基因进行克隆和功能验证。
综上所述，对致突变作用的评价可以通过突变频率、突变谱和鉴定突变基因等多种方法来进行。
不同的致突变作用可能对生物体产生不同的影响，因此在评价致突变作用时需要综合考虑不同评价指标的结果。
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6
v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
25
七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
20
v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
21
v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
7
v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
4
常用于染色体畸变分析的细胞株
细胞株代号 CHO V79 L5178Y W138 细胞来源 二倍体染 色体数 22(18-22) 核型 不稳定 不稳定 不稳定 稳定 稳定
中国仓鼠 卵巢 中国仓鼠 22(21-22) 肺组织 小鼠淋巴 40(38-40) 细胞 人体肺组织 46 46
人淋巴细胞 人外周血液
12
v 先 用低倍镜、高倍镜粗检，以有核细胞形态 完好作为判断制片优劣的标准，选择细胞分 散均匀、细胞完整、染色好的区域，再换成 油镜计数。每只动物至少观察计数1000个嗜 多染红细胞，观察其微核出现的频率及嗜多 染红细胞和成熟红细胞的比例。微核率一般 以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现两 个或更多个微核，仍按一个微核细胞计算。
18
v 观察与解剖: 雌雄同笼后，小鼠以阴栓（鼠 于交配后，精液在阴道内凝固，如一白色栓 塞堵在阴道中，叫做阴栓。小鼠的阴栓比较 牢固，可在阴道内存留1~2天；大鼠的阴栓 不牢固，容易脱落。检查大鼠的阴栓时，还 应在笼底寻找阴栓）的出现作为妊娠第1天， 若未检出阴栓，则从同笼的第三天记为妊娠 第1天。于妊娠第14天处死雌鼠，观察双角 子宫内着床数，吸收胎，晚期死胎及活胎数。
22
v （ 5 ）突变指数（ M1 ）＝总死胎数／总 着床数×100 v （6）显性致死率（DL, ％）＝（1－实 验组的平均生存胎仔数/阴性对照妊娠鼠 的平均生存胎仔数）×100
23
v 结果判断: 根据上述结果综合评价，生 存胎仔总数减少，死亡胎仔总数增加; 胚胎总着床数（活胎、早期死亡胚胎和 晚期死亡胚胎的总和）减少或未着床胚 胎数增加。 v 结 果有统计学意义并有剂量反应关系时 记为阳性显性致死效应。
24
六、程序外DNA合成试验(unschedule DNA synthesis UDS)
正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行 DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复 合成可发生在S期以外的时期，这种合成称为 程序外DNA合成。 基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的 量，这一掺入量可反映 DNA 损伤后修复合成 的量。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细 胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则 就需要人为地将细胞阻断于 G1 期，使增殖同 步化。
3
v 整 体动物染色体畸变分析常用大鼠、小鼠或中 国地鼠的骨髓细胞、肝细胞或精原细胞作分裂 中期染色体分析。但由于整体动物实验操作繁 琐 、 试 验 时 间 长 、 工 作 量 较 大 、 又 不 够 灵 敏， 所以目前多使用包括人在内的哺乳类细胞株的 体外实验代替整体动物实验。 v 其 优点是取材于哺乳动物或人类，在一定程度 上能反映哺乳动物的实际情况，并能对结果进 行定量的、统计学处理，能在较短的时间内得 出结果，缺点是试验离开整体动物在试管内进 行，一般较易诱发突变。
17
n
v 对照: 设阳性和阴性（溶剂）对照 v 剂量: 一般采用3个剂量组，最高剂量应导 致毒性症状或减低繁殖力。 v 交配方法 （1）在最后一次给药当天开始与雌鼠交配. （2）每只雄鼠单独饲养，与2～3只未交配过 的雌鼠同笼，5天后取出雌鼠，间隔1～2天后， 再放入第二批雌鼠，如此持续6～8周。
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v 对照组: 用溶媒作为阴性对照；已知能诱发微核 率升高的药物作为阳性对照。常用的阳性药物为 环磷酰胺。 v 骨髓采样 涂片 固定 染色 镜检
v 典型的微核是单一的，呈圆形，边缘光滑整齐， 嗜色性与核质一致，直径相当于红细胞直径的 1/20～1/5。偶有肾形、环形、马蹄形、椭圆形 等。用 Giemsa 染色后，微核呈紫红色或蓝紫 色。
5
实验步骤：
v １.细胞: 中国仓鼠肺细胞(CHL) 。 v ２.剂量: 至少应用三种不同剂量，高剂量以 50％细胞生长抑制浓度为基准，但最高不要 超过10mmol/L。中、低剂量则采用倍量稀释 法。 v 3.代谢活化: 在加S9混合液和不加S9混合液平 行的条件下测试。 v 4.药物作用时间: 药物和细胞接触,非活化组 分别作用24和48小时收获细胞，代谢活化组 作用6小时以上。 Nhomakorabea8
三、微核试验
微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有 关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺 锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂 后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内， 因比主核小，故称微核。
9
10
v 动物: 一般用小鼠，首推NIH小鼠，每组10 只性成熟动物（雌雄各半）或至少6只性成熟 雄性动物。 v 给药剂量及途径: 至少采用三种剂量，最高 剂量以1/2 LD50为基准，目的是为了尽可能 发现药物本身可能具有的毒性作用；低剂量 的设计则应结合药效学试验及临床拟用剂量 进行考虑，在高、低剂量之间按一定比例关 系插入一个中间剂量。 v 给药途径尽可能与临床拟用途径相同。
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13
MN
NCE
14
四、果蝇伴性隐性致死试验（Sex-linked recessive lethal test, SLRL）
v 是 利用隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征 而设计的。雄性果蝇 X 染色体的突变传给 F1 代 雌性果蝇， F1 代雌性果蝇为杂合性，不能表达； F1代雌性果蝇又传给F2代雄性果蝇，F2代雄性 果蝇为半合性，能表达出来。 v 如果亲代雄性果蝇接触受试物后X染色体出现隐 性致死突变，则F1代雌性果蝇中不表达，而F2 代雄性果蝇中因有一半接受了这个已发生突变 的 X 染色体，结果 F2 代雄性果蝇数目比雌性果 蝇少了一半。
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v 实验动物果蝇是现代遗传毒理学上常用的 实验昆虫，对化学物的代谢酶与哺乳动物相似， 且世代周期短，繁殖率高，饲养简单是该法的 优点；但蝇类的生殖腺和循环系统的结构与哺 乳动物差异较大，所以，其结果在外推到哺乳 动物或人时要慎重。
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五、啮齿类动物显性致死试验
n
原理: 显性致死试验是观察哺乳动物生殖细 胞染色体损伤的一种方法。生殖细胞在减数 分裂期和受精期最易发生突变，突变后失去 与异性生殖细胞结合的能力，或者结合后会 出现发育不正常的胚胎，以致造成总着床数 减少或早期胚胎死亡及畸胎等现象。 动物: 性成熟小鼠。每组至少15只雄鼠，20 只以上孕鼠。
结果判断
（1）掺入法：计数每皿生长的回变菌落数，以 Rt/Rc比值表示，>2为阳性（Rt/Rc=诱发回变菌 落数/自发回变菌落数）。 v 当 受试物浓度达到5 mg/ 皿仍为阴性者，可以 认为是阴性。 v 更 为可靠的是观察剂量-反应关系，随受试物 剂量的增加，诱发的回变菌落数增加为阳性结 果。
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本试验系一种特异性的“β-半乳糖苷酶诱 导试验”，一旦测试菌株DNA受损伤，即可 使其产生SOS反应，组成该反应系统的RecA 蛋白即转化为RecA蛋白水解酶。此酶可分解 阻遏蛋白，使受阻遏的 sfiA 基因去阻遏，并 启动 lacZ 基因翻译、转录、表达，其表达产 物即为半乳糖苷酶。此酶可分解邻硝基苯 β D- 半乳糖苷 (ONPG) ，产生黄色可溶性物质， 根据其颜色的深浅对被诱导酶的数量进行定 量测定，从而判断DNA是否受损伤及损伤的 程度。
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（2）点试法： v 凡在滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落，该 受试物即为致突变物质。 v 如 只在平皿上出现少数散在的自发回变菌落， 则为阴性。如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明 受试物具有细菌毒性。
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二、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
v 生殖细胞和体细胞都可发生染色体畸变，因此 染色体畸变试验应分别在这两种细胞中进行。 v 一般以骨髓细胞或外周血细胞代表体细胞，睾 丸精原细胞代表生殖细胞。
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v 活 胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、 晚期死亡胚胎的鉴别方法：
（1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自 然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色 泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的 长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎 形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全， 呈紫红色，无自然动作。
v 5. 标本制作时间: 分别在药物与细胞接触后 24和48小时收获细胞制作标本，代谢活化组在 24小时收获细胞制作标本。 v 6. 对照: 设空白对照、溶剂对照、阳性对照 和S9对照。 v 7. 镜检: 每种浓度至少观察100个中期分裂相 细胞的染色体结构，在油镜下分别记录结构畸 变及多倍体的出现率。
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七. SOS显色试验(SOS chromotest)
由法国巴斯德研究所 Quillardet 等于1982 年首先提出的一种遗传毒性检测方法, 通过直 接监测细胞 DNA 受损后的 SOS 修复反应来检 测化合物的生物遗传毒性。 DNA 分子在受到 外因引起大范围损伤、其复制又受到抑制的 情 况 下 ， 会 导 致 一 种 容 易 发 生 错 误 的 修 复。 所有这些在遗传毒物处理后大肠杆菌中出现 的一系列反应统称为SOS应答。
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v 早期死亡的胚胎逐步吸收，既看不到胎鼠外 观，也分不清胚胎和胎盘，仅在子宫内膜上 隆起如一小瘤，故有人称它为胎膜瘤；如已 完全被吸收，则可称为吸收点，即为最早的 早期死胎。 （3）晚期死亡胚胎：胚胎完整成形，并有明 显胎盘，但色泽灰暗，无光泽，无自然运动， 机械刺激后亦无运动反应。
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v 结果观察: 以给药组雄鼠为单位，交配后 1~8周分别统计下列指标。 （1）平均受孕数（％）＝受孕母鼠总数/同 笼母鼠总数×100％ （2）平均着床数＝总着床数（早死、迟死、 活胎数）/ 受孕母鼠总数 （3）平均活胎数＝活胎总数/受孕母鼠总数 （4）平均死胎数＝死胎总数/受孕母鼠总数
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v 结果判定
（1）受试物所诱发的染色体畸变数的增加与剂量相 关，CHL系统判定如下： 畸变率<5％ 阴性（－） 畸变率>5％ 可疑（±） 畸变率>10％ 阳性（＋） 畸变率>20％ 阳性（＋＋） 畸变率>50％ 阳性（＋＋＋） （2）某一测试点呈现可重复的并有统计学意义地增 加：符合上述一条即可判为阳性。
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常用于染色体畸变分析的细胞株
细胞株代号 CHO V79 L5178Y W138 细胞来源 二倍体染 色体数 22(18-22) 核型 不稳定 不稳定 不稳定 稳定 稳定
中国仓鼠 卵巢 中国仓鼠 22(21-22) 肺组织 小鼠淋巴 40(38-40) 细胞 人体肺组织 46 46
人淋巴细胞 人外周血液
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v 先 用低倍镜、高倍镜粗检，以有核细胞形态 完好作为判断制片优劣的标准，选择细胞分 散均匀、细胞完整、染色好的区域，再换成 油镜计数。每只动物至少观察计数1000个嗜 多染红细胞，观察其微核出现的频率及嗜多 染红细胞和成熟红细胞的比例。微核率一般 以千分率表示。一个嗜多染红细胞中出现两 个或更多个微核，仍按一个微核细胞计算。
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v 观察与解剖: 雌雄同笼后，小鼠以阴栓（鼠 于交配后，精液在阴道内凝固，如一白色栓 塞堵在阴道中，叫做阴栓。小鼠的阴栓比较 牢固，可在阴道内存留1~2天；大鼠的阴栓 不牢固，容易脱落。检查大鼠的阴栓时，还 应在笼底寻找阴栓）的出现作为妊娠第1天， 若未检出阴栓，则从同笼的第三天记为妊娠 第1天。于妊娠第14天处死雌鼠，观察双角 子宫内着床数，吸收胎，晚期死胎及活胎数。
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v （ 5 ）突变指数（ M1 ）＝总死胎数／总 着床数×100 v （6）显性致死率（DL, ％）＝（1－实 验组的平均生存胎仔数/阴性对照妊娠鼠 的平均生存胎仔数）×100
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v 结果判断: 根据上述结果综合评价，生 存胎仔总数减少，死亡胎仔总数增加; 胚胎总着床数（活胎、早期死亡胚胎和 晚期死亡胚胎的总和）减少或未着床胚 胎数增加。 v 结 果有统计学意义并有剂量反应关系时 记为阳性显性致死效应。
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六、程序外DNA合成试验(unschedule DNA synthesis UDS)
正常细胞在有丝分裂过程中，仅在S期进行 DNA复制合成。当DNA受损后，DNA的修复 合成可发生在S期以外的时期，这种合成称为 程序外DNA合成。 基本方法是测定S期以外3H-胸苷掺入胞核的 量，这一掺入量可反映 DNA 损伤后修复合成 的量。一般使用人淋巴细胞或啮齿动物肝细 胞等不处于正在增殖的细胞较为方便，否则 就需要人为地将细胞阻断于 G1 期，使增殖同 步化。
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v 整 体动物染色体畸变分析常用大鼠、小鼠或中 国地鼠的骨髓细胞、肝细胞或精原细胞作分裂 中期染色体分析。但由于整体动物实验操作繁 琐 、 试 验 时 间 长 、 工 作 量 较 大 、 又 不 够 灵 敏， 所以目前多使用包括人在内的哺乳类细胞株的 体外实验代替整体动物实验。 v 其 优点是取材于哺乳动物或人类，在一定程度 上能反映哺乳动物的实际情况，并能对结果进 行定量的、统计学处理，能在较短的时间内得 出结果，缺点是试验离开整体动物在试管内进 行，一般较易诱发突变。
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v 对照: 设阳性和阴性（溶剂）对照 v 剂量: 一般采用3个剂量组，最高剂量应导 致毒性症状或减低繁殖力。 v 交配方法 （1）在最后一次给药当天开始与雌鼠交配. （2）每只雄鼠单独饲养，与2～3只未交配过 的雌鼠同笼，5天后取出雌鼠，间隔1～2天后， 再放入第二批雌鼠，如此持续6～8周。
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v 对照组: 用溶媒作为阴性对照；已知能诱发微核 率升高的药物作为阳性对照。常用的阳性药物为 环磷酰胺。 v 骨髓采样 涂片 固定 染色 镜检
v 典型的微核是单一的，呈圆形，边缘光滑整齐， 嗜色性与核质一致，直径相当于红细胞直径的 1/20～1/5。偶有肾形、环形、马蹄形、椭圆形 等。用 Giemsa 染色后，微核呈紫红色或蓝紫 色。
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实验步骤：
v １.细胞: 中国仓鼠肺细胞(CHL) 。 v ２.剂量: 至少应用三种不同剂量，高剂量以 50％细胞生长抑制浓度为基准，但最高不要 超过10mmol/L。中、低剂量则采用倍量稀释 法。 v 3.代谢活化: 在加S9混合液和不加S9混合液平 行的条件下测试。 v 4.药物作用时间: 药物和细胞接触,非活化组 分别作用24和48小时收获细胞，代谢活化组 作用6小时以上。 Nhomakorabea8
三、微核试验
微核(Micronucleus)的产生与染色体损伤有 关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺 锤丝受损伤而丢失的整个染色体，在细胞分裂 后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一 个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质内， 因比主核小，故称微核。
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v 动物: 一般用小鼠，首推NIH小鼠，每组10 只性成熟动物（雌雄各半）或至少6只性成熟 雄性动物。 v 给药剂量及途径: 至少采用三种剂量，最高 剂量以1/2 LD50为基准，目的是为了尽可能 发现药物本身可能具有的毒性作用；低剂量 的设计则应结合药效学试验及临床拟用剂量 进行考虑，在高、低剂量之间按一定比例关 系插入一个中间剂量。 v 给药途径尽可能与临床拟用途径相同。
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MN
NCE
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四、果蝇伴性隐性致死试验（Sex-linked recessive lethal test, SLRL）
v 是 利用隐性基因在伴性遗传中的交叉遗传特征 而设计的。雄性果蝇 X 染色体的突变传给 F1 代 雌性果蝇， F1 代雌性果蝇为杂合性，不能表达； F1代雌性果蝇又传给F2代雄性果蝇，F2代雄性 果蝇为半合性，能表达出来。 v 如果亲代雄性果蝇接触受试物后X染色体出现隐 性致死突变，则F1代雌性果蝇中不表达，而F2 代雄性果蝇中因有一半接受了这个已发生突变 的 X 染色体，结果 F2 代雄性果蝇数目比雌性果 蝇少了一半。
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v 实验动物果蝇是现代遗传毒理学上常用的 实验昆虫，对化学物的代谢酶与哺乳动物相似， 且世代周期短，繁殖率高，饲养简单是该法的 优点；但蝇类的生殖腺和循环系统的结构与哺 乳动物差异较大，所以，其结果在外推到哺乳 动物或人时要慎重。
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五、啮齿类动物显性致死试验
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原理: 显性致死试验是观察哺乳动物生殖细 胞染色体损伤的一种方法。生殖细胞在减数 分裂期和受精期最易发生突变，突变后失去 与异性生殖细胞结合的能力，或者结合后会 出现发育不正常的胚胎，以致造成总着床数 减少或早期胚胎死亡及畸胎等现象。 动物: 性成熟小鼠。每组至少15只雄鼠，20 只以上孕鼠。
结果判断
（1）掺入法：计数每皿生长的回变菌落数，以 Rt/Rc比值表示，>2为阳性（Rt/Rc=诱发回变菌 落数/自发回变菌落数）。 v 当 受试物浓度达到5 mg/ 皿仍为阴性者，可以 认为是阴性。 v 更 为可靠的是观察剂量-反应关系，随受试物 剂量的增加，诱发的回变菌落数增加为阳性结 果。
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本试验系一种特异性的“β-半乳糖苷酶诱 导试验”，一旦测试菌株DNA受损伤，即可 使其产生SOS反应，组成该反应系统的RecA 蛋白即转化为RecA蛋白水解酶。此酶可分解 阻遏蛋白，使受阻遏的 sfiA 基因去阻遏，并 启动 lacZ 基因翻译、转录、表达，其表达产 物即为半乳糖苷酶。此酶可分解邻硝基苯 β D- 半乳糖苷 (ONPG) ，产生黄色可溶性物质， 根据其颜色的深浅对被诱导酶的数量进行定 量测定，从而判断DNA是否受损伤及损伤的 程度。
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（2）点试法： v 凡在滤纸片周围长出一圈密集的回变菌落，该 受试物即为致突变物质。 v 如 只在平皿上出现少数散在的自发回变菌落， 则为阴性。如在滤纸片周围见到抑菌圈，说明 受试物具有细菌毒性。
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二、哺乳动物培养细胞染色体畸变试验
v 生殖细胞和体细胞都可发生染色体畸变，因此 染色体畸变试验应分别在这两种细胞中进行。 v 一般以骨髓细胞或外周血细胞代表体细胞，睾 丸精原细胞代表生殖细胞。
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v 活 胎、早期死亡胚胎（包括吸收胚胎）、 晚期死亡胚胎的鉴别方法：
（1）活胎：胚胎已完整成形，色鲜红，有自 然运动，机械刺激后有运动反应。 （2）早期死亡胚胎：胚胎的大小、外形和色 泽可因死亡时间的相对迟早及死后自溶时间的 长短变化很大，一般胎盘较小或不明显，胚胎 形体较小，外形不完整，各部位发育尚未完全， 呈紫红色，无自然动作。