两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌生物被膜厚度的影响
铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究
复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518中文摘要背景细菌生物膜（Ｂｉｏｆｉｌｍ，ＢＦ）是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和ＤＮＡ等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。
生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。
细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。
生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是临床上难治性感染的一个重要原因。
近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的Ｒ益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。
第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用４种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，ＣＬＳＭ观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。
分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。
结果ＣＬＳＭ观察显示２４ｈ生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，７２ｈ生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；２４ｈ和７２ｈ生物膜厚度分别为２７．６¨ｍ、６４．６ｐｒｏ。
扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。
结晶紫染色法测得８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的吸光度值分别为０．０８土０．０４、０．２０土０．０７、０．４１士０．３３、Ｏ．４７士０．３３和０．６８＋０．３４，结果有统计学差异（Ｐ＜０．００１）。
2种培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的影响
2种培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的影响摘要目的：评估低氨基酸培养基和MH培养基对碳青霉烯类药物抗非发酵菌体外药敏检测结果的区别。
方法：采用琼脂稀释法分别使用MH和低氨基酸培养基测定亚胺培南、美罗培南、帕尼培南等10种抗菌药物对我院临床分离60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌的最低抑菌浓度（MIC），比较其结果的差异。
结果：使用MH琼脂作为药敏培养基时，60株铜绿假单胞菌和140株鲍曼不动杆菌对亚胺培南、美罗培南和帕尼培南的敏感率分别为90%、85%和68.3%和15.7%、23.6%和15%；使用低氨基酸琼脂作为药敏培养基时，它们的敏感性分别上升到100%（P=0.272）、96.7%（P=0.053）、93.3%（P=0.001）和90.7%（P=0.001）、98.6%（P=0.001）和91.4%（P=0.001），其中铜绿假单胞菌对帕尼培南的敏感率上升有显著差异，而鲍曼不动杆菌对三者的敏感率上升均有显著差异。
结论：我院分离的鲍曼不动杆菌对临床常用抗菌药物的耐药率较高。
碳青霉烯类药物对铜绿假单胞菌和鲍曼不动杆菌的抗菌活性高于其它类抗菌药物。
低氨基酸培养基，由于其碱性氨基酸浓度降低至与人血清中相近的浓度，适宜用于帕尼培南体外敏感性测定。
ABSTRACT Objective：To evaluate the effects of low-amino-acid agar and Mueller-Hinton （MH）agar on the susceptibility of clinical non-fermentative isolates to three carbapenems. Methods：The activities of imipenem，meropenem，panipenem and so on were tested against 40 Pseudomonas aeruginosa and 160 Acinetobacter baumannii strains isolated from our hospital. The minimum inhibitory concentration （MIC）of each antimicrobial agent against these strains was determined by a standard agar dilution procedure on the MH and low-amino-acid agars，respectively. Results：The susceptibility of P. aeruginosa and A. baumannii to imipenem，meropenem，panipenem was 90%，85%，68.3% and 15.7%，23.6% ，15%，respectively when they were incubated on MH agar，however，their susceptibility was enhanced to 100% （P=0.272），96.7% （P=0.053），93.3% （P=0.001）and 90.7% （P=0.001），98.6% （P=0.001）and 91.4% （P=0.001）on low-amino-acid agar，respectively，which were statistically significant. Conclusion：Carbapenems had good antibacterial activity in vitro against P. aeruginosa and A. baumannii. Low concentrations of basic amino acid medium should be used in order to get consistent result between in vitro susceptibilities and clinical effect of panipenem against P. aeruginosa..KEY WORDS carbapenems；non-fermentative isolates；in vitro susceptibilities；low-amino-acid agar碳青霉烯类抗菌药物于20世纪90年代初开始用于临床，由于其对β内酰胺酶较强的稳定性，对几乎所有的肠杆菌科细菌具强大的抗菌作用，是治疗产超广谱β内酰胺酶（ESBLs）、头孢菌素酶（AmpC）等多重耐药革兰阴性杆菌包括某些非发酵菌所致感染的重要药物[1]。
两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生物被膜的研究的开题报告
两种植物多酚体外抑制希瓦氏菌和假单胞菌及抗生
物被膜的研究的开题报告
一、研究背景和意义
希瓦氏菌和假单胞菌是两种常见的口腔微生物，它们常常聚集在口腔表面形成牙菌斑，是口腔疾病的主要病因。
同时，希瓦氏菌和假单胞菌也是耐药性较强的细菌，其引发的感染不易被治愈。
因此，寻找新的药物来对抗这两种细菌及其形成的生物膜是十分重要的。
多酚是一种广泛存在于植物中的天然产物，具有多种生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌等。
现有研究表明，许多植物多酚具有抑制细菌生长的能力，但其对希瓦氏菌和假单胞菌的影响尚不明确。
因此，本研究将选取两种植物多酚，探讨其对希瓦氏菌和假单胞菌的抑制作用及对其形成的生物膜的影响，旨在为口腔微生物感染的治疗提供新的方向和思路。
二、研究内容和方法
本研究将选取两种植物多酚进行体外抗菌实验。
首先，采用菌落计数法测定细菌在不同浓度的多酚处理下的生长状况。
进一步，利用聚合酶链式反应（PCR）技术检测多酚对细菌生物膜的影响，观察其对生物膜形成的影响及抗生素穿透的情况。
三、研究预期成果
通过本研究的实验结果，预计能够找到在体外体系中对希瓦氏菌和假单胞菌具有较强抑制作用的植物多酚，并探讨其对这些细菌生物膜的影响。
同时，本研究将为寻找新的口腔微生物感染治疗药物提供新的思路和方向。
细菌耐药——挑战与对策
细菌耐药——挑战与对策自19 世纪晚期德国科学家Robert Koch 证实了感染性疾病的细菌起源学说起，人类一直致力于与细菌感染性疾病的斗争。
以青霉素为代表的抗生素的发现和发明，曾一度有效控制了细菌感染性疾病。
人们在庆幸一代又一代新型广谱高效抗菌药物出现的同时，也惊叹越来越多的耐药菌株种类和越来越高的耐药比例。
细菌耐药已经成为严重的公共卫生问题，而且其发展速度远远超过抗菌药物研制，有专家预言，长此以往，人类将再次陷入对细菌感染无药可治的困境，即进入“后抗生素时代”。
通过对细菌耐药机制的研究来研发新的抗菌药物、正确合理应用现有抗菌药物是应对这种挑战的关键。
一、细菌耐药机制细菌耐药的原因很复杂，抗菌药物滥用所造成的压力使细菌产生获得性耐药，如产生各种灭活酶或钝化酶、抗生素结合位点改变、细胞膜通透性改变、泵出机制。
研究者和临床工作者近年来发现细菌表现为生物被膜的多细胞结构群体也是临床上抗菌药物治疗无效的重要原因。
美国疾病预防与控制中心（CDC）的研究结果表明，约65％的感染性疾病与细菌生物被膜有关，这也是抗感染治疗面临的新挑战。
细菌生物被膜是指附着在有生命或无生命物体表面的由细菌自身产生的胞外多聚基质包裹的菌细胞结构群体。
与浮游细菌相比，生物被膜细菌对抗菌药物的抗性可提高10－1000 倍，现有药物难以清除生物被膜，造成感染反复发作。
本课题组曾对铜绿假单胞菌生物被膜的胞外多糖主要成分之一——藻酸盐做过深入研究，并从临床一位反复肺部感染的老年患者的痰标本中分离出一株含新的mucA 基因突变的黏液型铜绿假单胞菌。
本课题组通过同源重组对改突变基因的功能进行了研究，目前的结果表明该新型突变的mucA 基因通过藻酸盐以外的途径影响铜绿假单胞菌生物被膜的形成和耐药。
进一步的深入研究还在进行中。
二、中国细菌耐药流行趋势根据中国CHINET 2005 年度的调查结果，甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRS A）与甲氧西林耐药凝固酶阴性葡萄球菌（MRCNS）的检出率分别为69%与82%，明显高于2002－2003 年度的调查结果（分别为41.0%与29.1%）。
pH值对铜绿假单胞菌耐药特征的影响及机制研究
pH值对铜绿假单胞菌耐药特征的影响及机制研究研究背景和目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)属于革兰氏阴性菌,它在自然界的分布十分广泛,是导致人类疾病的最重要的条件致病菌之一。
尤其在呼吸系统感染疾病中最为常见,而且是呼吸机肺炎和获得性感染的重要病原体。
由于目前抗生素滥用问题十分严重,铜绿假单胞菌的耐药率呈现逐年提高的趋势,由于铜绿假单胞菌极易生成生物被膜(Biofilm)从而逃避免疫系统攻击,也降低了抗生素疗效;并可通过基因突变、获得外源耐药基因、外排泵等多种方式导致对青霉素类、先锋霉素类、碳青霉烯类、单菌霉素、氨基糖甙类、多粘菌素类和氟喹诺酮类抗生素耐药甚至是泛耐药。
面对严峻的耐药形势,除了开发新型抗生素以外,目前研究方向有“老药新用”和“利用共生菌抑制致病菌”等方法,但存在新药开发周期长、新技术应用范围窄等缺点,因此急需简便易行有效的方法来改善抗生素疗效。
我们发现,致病菌感染部位的内环境在感染控制与治疗过程中起到了关键作用。
然而,以往的耐药研究多集中在体外,而人体内环境对致病菌耐药性的影响却知之甚少。
由于感染部位的表面性质、基础疾病以及pH值都会对细菌生理活动甚至是耐药性产生影响。
为了达到通过改变感染部位内环境提高抗生素治疗效果,因此必须在感染环境中研究致病菌耐药性和致病性的影响及并探讨其分子机制。
pH值对维持人体正常生理活动至关重要,为了维持组织的正常生理功能,内环境一般具有稳定的pH值。
在临床上多种疾病能够导致气道内及体液中的pH 值发生改变,这种改变将会对定植在气道表面的病原微生物产生作用,影响抗生素的抑菌活性、生物被膜生成以及毒力因子的分泌,但pH值的改变如何影响以上致病性相关表型?这一过程中有哪些关键基因或蛋白参与?如何通过改变环境pH 提高感染状态下抗生素疗效?对于以上问题目前尚无明确结论。
为了揭示铜绿假单胞菌在不同pH值条件下耐药特征的一般规律,发现不同pH值对影响铜绿假单胞菌耐药与生物被膜生成的关键调控分子,进而通过改善内环境来提高抗生素治疗效果,本研究利用微生物学、分子生物学以及RNA-seq 等现代技术,通过模拟呼吸道中的pH值,对铜绿假单胞菌耐药特征与基因背景的相关性进行深入分析与研究,10揭示pH值对铜绿假单胞菌毒力分泌、被膜生成等致病因素的作用规律,为提高抗生素治疗效果、延缓或逆转铜绿假单胞菌耐药及抑制生物被膜生成提供重要理论支持。
大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究
大肠埃希菌生物膜两种检测方法对比研究耿朝萌;刘林波;郭瑞林;苏冰;张晓雪【摘要】目的：刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验检测大肠埃希菌生物膜的敏感性和特异性比较。
方法：对临床分离的83株大肠埃希菌进行生物膜形成实验，分别经刚果红-阿利新蓝联合染色和半定量粘附实验，随机抽取25株进行激光共聚焦显微镜（CLSM ）观察。
结果：临床分离的83株大肠埃希菌经刚果红-阿利新蓝联合染色阳性率37．3％，敏感性81．8％，特异性100％；半定量粘附实验阳性率45．8％，敏感性100％，特异性78．6％；两种检测方法比较差异无统计学意义。
结论：刚果红-阿利新蓝联合染色、半定量粘附实验均可用于大肠埃希菌生物膜的检测。
【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2016(000)003【总页数】2页(P364-365)【关键词】大肠埃希菌;生物膜/细胞学;刚果红-阿利新蓝联合染色;细菌粘附;染色与标记;显微镜检查 ,共焦;比较研究【作者】耿朝萌;刘林波;郭瑞林;苏冰;张晓雪【作者单位】陕西中医药大学医学技术系咸阳712000;陕西中医药大学医学技术系咸阳712000;陕西中医药大学第二附属医院检验科;陕西中医药大学第二附属医院检验科;陕西中医药大学第二附属医院检验科【正文语种】中文【中图分类】R446.5·临床检验·主题词@大肠埃希菌生物膜/细胞学刚果红-阿利新蓝联合染色细菌粘附染色与标记显微镜检查，共焦比较研究细菌生物膜形成在细菌感染中的作用已引起广泛关注，对生物膜的检测也得到了越来越高的重视，出现了各类不同的检测方法[1-5]。
本文对我院临床分离的83株大肠埃希菌在体外能否形成生物膜进行实验，并分别采用刚果红-阿利新蓝联合染色，半定量粘附实验，比较其阳性检出率、敏感性和特异性，对其临床意义进行探讨，现报告如下。
1 实验菌株、主要试剂与仪器收集2014年8～11月陕西中医药大学第二附属医院临床标本中分离的83株大肠埃希菌，删除同一患者相同感染部位分离的重复分离菌株，所有菌株均经临床鉴定。
铜绿假单胞菌解析
发酵型
氧化型
产碱型
分离培养
• 本菌生长对营养要求不高。对有正 常菌群存在的临床标本或采自环境 中的标本应接种选择性培养基如麦 康凯琼脂培养基（MAC）；对无正 常菌群存在的临床标本如血液、脑 脊液、穿刺液等可接种普通或血琼 脂培养基。
• 在普通琼脂培养基上生长18~24h可 以见到扁平、湿润的菌落，该菌所 产生的带荧光的水溶性青脓素与绿 脓素相结合将使得培养基呈亮绿色； 在血琼脂平板上生长时可以见到在 菌落的周围有溶血环，菌落呈金属 光泽；如果是在液体培养基中则呈 浑浊状生长，在液体表面形成菌落， 而在培养基底部细菌的生长不良。
绿或灰绿 有溶血环 • MACc平：微小无光泽半透明 48h后菌落 呈棕色
鉴定
• 初步鉴定 菌体形态 菌落特征 产色素 气味 氧化酶 • 最终鉴定 非发酵菌生化鉴定系统 API-NE试条
• 细菌耐药机制
–外膜通透性降低 –产生灭活酶或钝化酶 –主动外排系统将抗生素泵出胞外 –抗菌药物作用靶位改变 –膜孔蛋白突变 –生物膜屏障作用
• 绿脓杆菌是医院内感染的重要病原菌之一。
培养基成分：
• • • • •
胆盐乳糖培养基（BL）
胨 20. 0g 磷酸二氢钾 1.3g 乳糖 5. 0g 牛胆盐 2.0g 氯化钠 5.0g (或去氧胆酸钠） （0.5g) 磷酸氢二钾 4. 0g 水 1000ml 除乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠外，取上述成分，混合，微温溶 解，调节P H值使灭菌后为7 . 4 ± 0 . 2，煮沸，滤清，加入 乳糖、牛胆盐或去氧胆酸钠，分装，灭菌。
培养基成分：
PDP斜面，是否有色素，有， 用氯仿3-5ml萃取，用无菌 玻璃棒搅碎培养基、混匀， 色素完全在氯仿层。吸管 把氯仿层移到另一试管， 加入盐酸1M1ml，静置后， 盐酸出现粉红为阳性，无 粉红为阴性，阴性斜面培 养1-2天再重新做一遍。如 果仍是阴性。做下一步试 验。 绿脓菌素从有机相转到酸性 水相中会由蓝绿色变为粉 红色。
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是最严重的医院内获得性感染的病原菌之一,生物被膜(Biofilm,BF)多粘附在生物材料和植入的各种导管及人体组织表面,它的形成使得铜绿假单胞菌生物被膜相关感染不断上升,致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制,给治疗增加更大的难度。
临床上已有许多被证实可用于治疗PA生物被膜感染的药物,藻酸盐、密度感应系统对PA生物被膜形成的作用也为治疗生物被膜病提供了新思路。
关键词:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐感应密度系统生物被膜(Biofilm,BF)是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构,而并非单一细菌的膜成分。
细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用,而且还可以对抗人体的免疫清除作用,对人类的健康造成了很大的危害,从而导致严重的临床问题。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染最常见的细菌之一,其生物被膜形成常给临床治疗带来许多困难。
本文就铜绿假单胞菌生物被膜的研究情况进行综述。
1 生物被膜的形成生物被膜的形成过程包括3个方面:①浮游细菌粘附到表面形成单细胞层;②细菌通过群落生长或聚集形成微菌落,进而形成蘑菇状结构;③细菌分泌细胞外多聚物,形成基质,细菌深埋于基质内,成为成熟的生物被膜。
细菌生物被膜结构坚实稳定,不易受到破坏,是细菌为了适应环境、维持自身发展所发生的形态变化。
2 藻酸盐对生物被膜形成的作用据报道,铜绿假单胞菌会在活体内产生藻酸盐,而且在铜绿假单胞菌感染住院的病人的体内也检测到藻酸盐抗体的存在。
这些多糖藻酸盐结构主要成分是甘露糖醛酸和古洛糖醛酸。
研究表明铜绿假单胞菌可以分成粘液型及非黏液型两种表型,粘液型铜绿假单胞菌可借助其表面分泌的藻酸盐,而粘附于异物表面。
Sauer K 等在流动的介质中建立的铜绿假单胞菌生物被膜模型,发现黏液型菌株的生物被膜为塔状或蘑菇状,非黏液型菌株的生物被膜为薄膜状[1]。
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带来了困难。
因此临床上应给予足够的重视:一方面要紧密结合实验室药敏试验结果,合理选用抗生素;另一方面临床实验室和医院感染管理部门要注意监控感染病原菌和质粒动态,及时切断传播途径,减小医院感染的流行和暴发。
作者简介:李从荣(1969-),女,副教授,硕士生导师,研究方向:细菌耐药机制的研究。
参考文献:[1]牟立东,张立平.产超广谱β内酰胺酶细菌的检测及耐药性分析[J ].中国现代应用药学杂志,2005,1(22):77.[2]C oudron PE ,M oland ES ,T h om os on K S.Occurrence and detection of Am pC β2lactam ases Escherichia coli ,K lebsiella Pneum oniae and Proteus m irabilis is o 2late at a veteranis m edical center[J ].J C lin M icrobiol ,2000,38:1791.[3]National comm ittee for clinical laboratory standards.Performance standardsfor antim icrobial susceptbility testing.NCC LS ,2002.[4]K im BN ,W oo J H ,K im M N ,ect.Clinical im plications of extended 2spec 2trum β2lactamases 2producing K lebsiella Pneum oniae bacteraem ia[J ].Jour 2nal of H ospital In fection ,2002,52:99.[5]张永标,张扣兴,唐英春,等.产质粒介导Am pC 酶和ES BLs 细菌的耐药性及β2内酰胺酶基因型研究[J ].中华微生物和免疫学杂志,2004,24(7):577.[6]Li CR ,Li Y,Zhang PA.Dissem ination and S pread of CTX 2M Extended 2S pstrum beta 2lactamases am ong Clinical Is olates of K lebsiella Pneum oniae in Centre China[J ].International Journal of Antim icrobial Agents ,2003,22(5)532.[7]Brad ford PA.Extended 2spectrum beta 2lactamases in the 21st century :characterization ,epid 2em icology and detection of im portant resistance threat[J ].Clin M icrobiol Rev ,2001,14(4):933.(收稿日期:2006-05-31)3通讯作者文章编号:1007-4287(2007)05-0613-06两种培养基对铜绿假单胞菌和大肠埃希菌生物被膜厚度的影响严 岩1,2,李 彤1,刘树林13(1.北京大学医学部病原生物学系,北京100083;2.北京大学第一医院检验科)摘要:目的 探讨营养成分不同的两种培养基对临床分离的铜绿假单胞菌和大肠埃希菌形成生物被膜形态的影响。
方法 使用电击转化将pS MC21转入临床分离的3株铜绿假单胞菌和3株大肠埃希菌体内,构建表达绿色荧光蛋白的菌株。
在Luria 2Bertani (LB )和M9葡萄糖基础培养基中以盖玻片为支持表面,进行细菌生物被膜的连续培养。
经过12天的培养周期,使用共聚焦激光扫描显微镜检测盖玻片上生物被膜的厚度。
使用方差分析检验每个样本5个测量值的重复性,并用配对T 检验来分析同一株细菌在两种培养基中生物被膜的厚度变化。
结果 pS MC21可以在6株临床分离株中稳定表达绿色荧光蛋白;每个样本5个测量值重复性好,其差异无统计学意义(P =0.46);大肠埃希菌在LB 和M9培养基中形成生物被膜平均厚度的差异无统计学意义(t =-0.42,P >0.7),而铜绿假单胞菌在LB 培养基中形成的生物被膜更厚,其差异有统计学意义(t =3.46,P <0.02)。
结论 铜绿假单胞菌所形成生物被膜的平均厚度因培养基成分的不同而有显著差异,而大肠埃希菌所形成生物被膜的平均厚度则不受培养基成分不同的影响。
关键词:细菌生物被膜;绿色荧光蛋白;共聚焦激光扫描显微镜中图分类号:R372文献标识码:AE ffects of tw o culture media on the thickness of biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli Y AN Yan ,LI Tong ,LIU Shu 2lin.(Department o f Microbiology Peking Univer sity Health Science Center ,Beijing 100083,China )Abstract :Objective T o study the effects of different levels of nutrient abundance on the thickness of biofilms formed by bacte 2ria.Methods Three G FP 2tagged clinical strains of P.aeruginosa and 3G FP 2tagged clinical strains of E.coli were constructed with the plasmid pS MC21,and bacterial biofilm culture was carried out for 12days.Thicknesses of biofilms in 144sam ples were measured with con focal laser scanning microscopy (C LS M )and analyzed by variance and pair T test.R esults pS MC21expressed green fluo 2rescent protein in all 6bacterial strains.In the cultures ,P.aeruginosa formed thicker biofilms with Luria 2Bertani (LB )than with M9(t =3.46,P <0.02),but no statistically significant differences were observed in the thickness of biofilms formed by E.coli in the tw o culture media (t =-0.42,P >0.7).Conclusion Thickness of biofilms was affected by the kinds of culture media for P.aeruginosa but not for E.coli.K ey w ords:Bacterial biofilm;G reen Fluorescent Protein;C on focal Laser Scanning M icroscopy(Chin J Lab Diagn,2007,11:0613) 细菌生物被膜(Bacterial biofilm)是细菌粘附于物体或宿主细胞表面,与细菌代谢产物和外源物质共同构成的结构特异的生物群体[1-2]。
越来越多的证据表明,一些细菌性感染疾病与细菌生物被膜有关[3-6]。
例如,感染性肾结石、牙周炎、原发性心内膜炎及肺囊性纤维化均牵涉到细菌形成的生物被膜,在其治疗当中,使用常规化学药物疗效往往不显著。
因此,对生物被膜生物学性状的研究至关重要,它有利于人们进一步理解生物被膜现象,以寻找切实可行的控制生物被膜相关感染的策略。
细菌生物被膜是细菌表现出的一种特殊的生长方式,是细菌自身和外界多种因素相互作用的结果。
在研究生物被膜生长发育的过程中,人们通过显微镜直接观察发现,细菌生长的微环境中很多因素,例如营养成分[7]、代谢所需的碳源[8]、pH、渗透压以及流体切力等,都会影响细菌生物被膜的结构和形态。
其中营养成分的作用尤为重要。
丰富的营养物质是细菌形成生物被膜的物质基础,然而低营养状态也可以激活一些细菌基因的表达,启动生物被膜的发生[9]。
当营养极度耗竭的时候,细菌会从生物被膜上脱落下来并寻找适合生存的新环境。
当环境中碳源相同而浓度不同时,生物被膜结构不均一性的特征非常明显[10]。
Heydorn观察到在一定浓度的枸橼酸钠基础培养基中四种假单胞菌可以形成形态不同的生物被膜[11],这些研究结果表明细菌生物被膜的结构是复杂多样的,需要建立不同的研究模型来反映在外界环境压力变化时细菌生物被膜各种生物学性状相应改变的真实情况。
目前,应用最广泛的细菌生物被膜的研究模型有改良R obbins装置(M odified R obbins Device, MRD)[12]和流室系统(Flow Chamber System)[13]。
这两种方法都提供了稳定、流动的营养条件,样本检测前处理步骤少,有利于生物被膜形态学的观察,但是仪器成本高和一次研究菌株数量少也限制了方法的使用范围。
我们发现国外在研究生物被膜形成机制和结构特点时多采用实验室菌株和缺陷株,无论在种系发育还是在对环境压力的适应性方面它们与临床分离细菌都存在很大不同。
因此,此前的实验数据无法完全反映导致感染的细菌生物被膜的真实特征。
然而临床分离细菌生物学性状的多样性可能影响到结果的重复性,所以使用批量培养及适当的统计方法来减少实验中出现的偶然因素是一个不错的选择。
本实验使用细胞培养板建立了一个简易模型,利用共聚焦激光扫描显微镜检测表达绿色荧光蛋白的细菌在盖玻片上形成生物被膜的厚度,比较从临床分离的大肠埃希菌(Escherichia coli,E.coli)和铜绿假单胞菌(Pseudom onas aeruginosa,P.aeruginosa)在Luri2 a2Bertani(LB)和M9培养基中形成生物被膜厚度的变化,并探讨这种变化的内在规律,为寻找控制细菌生物被膜感染策略提供数据准备。