铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究_谢红梅
铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究
复旦大学硕士学位论文铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素及相关基因的研究姓名：谢红梅申请学位级别：硕士专业：临床检验诊断学指导教师：胡必杰20040518中文摘要背景细菌生物膜（Ｂｉｏｆｉｌｍ，ＢＦ）是细菌粘附于物体表面，并分泌大量多糖、蛋白和ＤＮＡ等多聚物质，将自身包裹于其中而形成的复杂膜状结构。
生物膜是细菌的～种保护性生长模式，广泛存在于自然界。
细菌也可定植于植入物、留置导管或人体组织表面形成生物膜。
生物膜内的细菌生物学特性与普通浮游细菌有显著差异，它具有极强的对外界化学物质的耐受性和抵抗宿主免疫系统的能力，是临床上难治性感染的一个重要原因。
近年来随着医学的发展，各种人工器官和留置导管使用的Ｒ益增多，生物膜相关感染也在不断增加，因此，研究生物膜形成影响因素及机理对于生物膜相关感染的防治具有重要意义。
第一部分铜绿假单胞菌生物膜分析方法的研究目的筛选一种有效且简单易行的生物膜分析方法方法分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型，用４种不同的方法分析：共聚焦激光扫描显微镜（ＣＬＳＭ）法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡一活菌计数法分析生物膜的形成情况，ＣＬＳＭ观察生物膜的形态结构和厚度，扫描电镜法观察生物膜的形态结构，结晶紫染色法检测吸光度值，超声振荡一活菌计数法计数生物膜内的活细菌数。
分别将扫描电镜法、结晶紫染色法、超声振荡一活菌计数法所反映生物膜形成情况与ＣＬＳＭ结果相比较。
结果ＣＬＳＭ观察显示２４ｈ生物膜内微菌落呈稀疏散在分布，７２ｈ生物膜内细菌己形成微菌落，且许多微菌落已融合，形成稳定成熟的生物膜结构；２４ｈ和７２ｈ生物膜厚度分别为２７．６¨ｍ、６４．６ｐｒｏ。
扫描电镜法显示７２ｈ生物膜表面有大量形状不规则的基质成分，细菌被包裹于其中。
结晶紫染色法测得８ｈ、１６ｈ、２４ｈ、４８ｈ和７２ｈ的吸光度值分别为０．０８土０．０４、０．２０土０．０７、０．４１士０．３３、Ｏ．４７士０．３３和０．６８＋０．３４，结果有统计学差异（Ｐ＜０．００１）。
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｍｉｔａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｓｅｖｅｒａｌ ａｎｔｉ—ｂｉｏｆｉｌｍ
及菌细胞外ＤＮＡ也参与“帽子”形成与生物被 膜结构的成熟¨－。 １．２．３ 调控生物被膜基质形成的分子及其基 因细菌形成蘑菇状结构后，大量分泌多聚 物——菌细胞外基质包绕在蘑菇状结构之外， 形成稳固的生物被膜。基质主要由蛋白、多糖 和核酸组成，其中藻酸盐是胞外摹质多糖的主 要成分之一。基质多糖在细菌定植形成微菌落 时已开始分泌，在蘑菇状结构形成后分泌才大 量增加。藻酸盐能清除自由基，保护细菌免受 吞噬细胞的清除作用，影响牛物被膜的抵抗 性【８ Ｊ。藻酸盐产生受ａｌｇ基因的调节。铜绿假 单孢菌的ａｌｇ基因根据功能分成３种，即合成 基因、调节基因和基因转换基因。ａｉｇＤ、ａｌｇＧ基 因直接催化藻酸盐的合成；ａｌｇｚ、ａｌｇＲ和ａｌｇＢ基 因调节藻酸盐的合成；转换摹冈ａｌｓＴ、ｍｕｃＡ、 ｍｕｃＢ、ｍｕｃＣ和ｍｕｃＤ介导Ａｌｇ＋表型的转换。 ａｌｇＤ基因编码ＧＤＰ－＿Ｈ．露糖脱氢酶，其活化是藻 酸盐合成调节途径的关键点，受藻酸盐转换基 因和调节基因的调控。ａｌｇＴ基因编码ｓｉｇｍａ２２ 因子，正性调控自身的启动子ＰａｌｇＴ以及ａｌｇＲ 等调节基因的表达；而ｍｕｃ摹冈则编码反 ｓｉｇｍａ２２因子或类似负性调节因子，抑制ａｌｇＴ基 因的表达。调节基囚ａｌｇＲ与ａｌｇＴ结合后上调 ａｌｇＤ的转录和下游的合成基因∽Ｊ。产藻酸盐 黏液型菌株的增加主要是由于ｍｕｃ负性调节 基凶的突变，引起转换基因ａｌｇＴ表达增加，并 导致调节基因ａｌｇＲ和合成基因ａｌｇＤ的高水平 的转录，从而引起细菌由非黏液型向黏液表型 的转变。
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制
铜绿假单胞菌的生物膜形成及其致病机制铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的革兰氏阴性杆菌，它产生的生物膜在其致病机制中起着重要的作用。
本文将探讨铜绿假单胞菌生物膜的形成机制以及致病机制的相关内容。
生物膜是由微生物聚集在生物界面上形成的一种复杂的结构。
它由多种微生物、水分、有机物质和矿物质组成，形成了一种稳定的生态系统。
在铜绿假单胞菌中，生物膜的形成是通过一系列复杂的步骤完成的。
首先，菌体附着在生物界面上，形成团块。
接着，菌体在团块之间建立起一种可以将细胞聚集在一起的基质。
这种基质通常由多糖、DNA以及蛋白质等分泌物组成，在保护细菌免受外界环境的侵害方面起到了重要的作用。
最后，菌体在这种环境中继续增殖，形成三维的生物膜结构。
生物膜的形成使得铜绿假单胞菌具有了许多特殊的性质，这些性质有助于其在致病过程中的适应和存活。
首先，生物膜提供了一种有效的保护罩，使得菌体免受抗生素和宿主免疫系统的攻击。
这也是为什么铜绿假单胞菌常常引起慢性感染的原因之一。
其次，生物膜提供了菌体相互作用和信号传递的平台，从而增强了菌体的适应能力和生存能力。
此外，生物膜还为菌体提供了营养物质，以支持其生长和繁殖。
铜绿假单胞菌生物膜形成的致病机制主要与其产生的一些分泌物有关。
其中，腺嘌呤环化酶是铜绿假单胞菌生物膜形成的关键酶之一。
腺嘌呤环化酶能够将腺嘌呤转化为二鸟苷酸（c-di-GMP），从而促进生物膜的形成。
c-di-GMP是一种重要的信号分子，能够调控一系列与生物膜形成相关的基因表达。
除了腺嘌呤环化酶，铜绿假单胞菌还能产生一些胞外信号分子，如N-3-氧代十二碳烯酰-L-丙氨酸（3O-C12-HSL）和N-但酰-L-丙氨酸（C4-HSL）。
这些信号分子能够介导菌体之间的相互作用和协调菌群行为，进一步促进生物膜的形成。
铜绿假单胞菌的生物膜形成和致病机制还与许多其他因素有关。
例如，菌体与宿主细胞表面的相互作用以及细胞外基质的组成都会影响生物膜的形成和稳定性。
铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究
铜绿假单胞菌及其生物被膜影响A549细胞分泌细胞生长因子的实验研究王非;赵玮;王媛;夏永良【期刊名称】《浙江中西医结合杂志》【年(卷),期】2011(021)012【摘要】目的:通过观察经铜绿假单胞菌及其生物被膜作用后,肺泡上皮细胞A549分泌细胞生长因子水平的变化,探讨其在成纤维细胞活化和增殖及分化中的作用.方法:采用体外诱导铜绿假单胞菌形成生物被膜,应用乙醇沉淀法提取细菌被膜并纯化;选用人肺泡Ⅱ型上皮细胞株A549为靶细胞、采用ELISA法分别定量检测经铜绿假单胞浮游菌及其生物被膜藻酸盐作用后上皮细胞分泌生长因子TGF-B1、FGF-2、CTGF、IGF-1表达量.结果:受铜绿假单胞生物被膜藻酸盐作用后,A549细胞表达TGF-B1、FGF-2、CTGF和IGF-1能力明显增强,CTGF在藻酸盐作用后24h达到高峰后缓慢下降,其余3种生长因子均在在藻酸盐作用后48 h内持续升高,与对照相比较,差异有统计学意义(P<0.05);浮游菌作用后4种生长因子表达量无明显增加.结论:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐可增强A549细胞对TGF-β1、FGF-2、CTGF和IGF-1分泌能力.【总页数】3页(P837-839)【作者】王非;赵玮;王媛;夏永良【作者单位】浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006;浙江中医药大学附属第一医院,杭州,310006【正文语种】中文【相关文献】1.铜绿假单胞菌生物被膜诱导肺泡上皮细胞分泌炎性细胞因子的研究 [J], 王非;王媛;赵玮;骆仙芳2.胞壁酰二肽对烟曲霉孢子刺激A549细胞分泌细胞因子的影响及其可能机制 [J], 张辉军;王葆青;瞿介明3.铜绿假单胞菌生物被膜对抗菌药物作用影响的实验研究 [J], 冯星火;赵广福;崔连东;关欣;王宏达4.生物被膜铜绿假单胞菌相关肺感染的实验研究 [J], 关欣;郑红光5.亚胺培南联合阿奇霉素治疗铜绿假单胞菌生物被膜感染的实验研究 [J], 方向群;刘又宁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
铜绿假单胞菌生物被膜形成能力与基因型的相关性分析
铜绿假单胞菌生物被膜形成能力与基因型的相关性分析程曦;杨维青;石磊;尹晓琳;谢轶;曾蔚;李心晖;苏建裕;寇亚丽;贾文祥【期刊名称】《四川大学学报：医学版》【年(卷),期】2006(37)5【摘要】目的探讨铜绿假单胞菌(PA)临床分离株的粘附性、生物被膜形成能力及其与基因型的相关性。
方法采用改良的微量平板法对临床分离的48株PA生物被膜的形成进行定量分析;通过肠杆菌基因间重复一致序列-PCR(ERIC-PCR)技术绘制48株PA的指纹图谱,应用计算机软件建立遗传相似性系数矩阵及聚类分析树状图。
结果48株临床分离PA菌株生物被膜的形成能力不同。
生物被膜形成能力不同的PA在基因型上表现出多态性,PA在17%遗传相似性系数上分为A、B、C、D、E五个基因型,生物被膜形成能力强的PA大都属于D型,其遗传相似性系数为42%。
结论绝大多数临床分离的PA株具有较强的生物被膜形成能力;生物被膜形成能力不同的PA在基因型上表现出多态性;生物被膜形成能力较强的PA在基因型上表现出一定的相似性。
【总页数】4页(P666-669)【关键词】铜绿假单胞菌;生物被膜;基因指纹图谱;基因型【作者】程曦;杨维青;石磊;尹晓琳;谢轶;曾蔚;李心晖;苏建裕;寇亚丽;贾文祥【作者单位】四川大学华西基础医学与法医学院微生物学教研室;华南理工大学食品与生物工程学院;河北医科大学基础医学院【正文语种】中文【中图分类】R387.991【相关文献】1.铜绿假单胞菌基因型与生物被膜形成能力的分析 [J], 石磊;寇娅丽2.连翘苷对铜绿假单胞菌黏附功能及生物被膜形成能力的影响 [J], 王业梅;程惠娟3.密度感应对铜绿假单胞菌运动能力及其生物被膜形成调控的研究 [J], 温红侠;陈一强;宋志军;吴红;王恒壮;闫萍;孔晋亮4.60例医院获得性肺炎患者铜绿假单胞菌生物被膜形成能力的分析 [J], 李镛;张柏膺;严峻海5.痰热清对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响作用分析 [J], 刘佳; 王钧; 孙聪因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的致病菌，可以导致各种感染，尤其在医疗机构和免疫功能低下的人群中特别常见。
其中，铜绿假单胞菌的生物膜形成和抗菌药物耐受性是该菌引起感染并导致治疗困难的重要原因之一。
本文将探究铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的相关性。
生物膜是铜绿假单胞菌在环境中常见的生存形式，它是由菌落中的细菌通过分泌胞外多糖以及其他黏附因子形成的一层黏稠的聚集体。
生物膜在菌落内提供了保护和致病的优势。
在生物膜内，铜绿假单胞菌形成了一种高度结构化的矩阵，其中包括细菌细胞本身、胞外多糖、蛋白质以及DNA等物质。
铜绿假单胞菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多个遗传和环境因素的调控。
首先，一些遗传因素可以促进生物膜的形成。
例如，细菌生物膜有关的基因簇（pel和psl）会编码产生胞外多糖的酶以及其他黏附因子。
此外，铜绿假单胞菌还可以通过调节某些转录因子（例如vqsR和lasR）的表达来控制生物膜的形成。
其次，环境条件对生物膜形成也有重要影响。
铜绿假单胞菌通常生长在潮湿和富含养分的环境中，例如人体上的生化硝化滤池、人体创口和医疗设备表面等。
在这些环境中，菌落周围的水分和营养素可以促进细菌的黏附并形成生物膜。
此外，一些物理和化学参数，例如温度、pH值和氧气浓度，也会影响生物膜的形成。
铜绿假单胞菌生物膜的形成对抗菌药物的耐受性具有重要意义。
一方面，生物膜提供了一种物理屏障，使得抗菌药物难以通过，从而减少了其对菌落内细菌的杀菌效果。
另一方面，生物膜内的细菌通常处于生长缓慢或处于休眠状态，这使得它们对抗菌药物的杀菌作用更加耐受。
此外，生物膜中的细菌群体也通过细菌间的相互作用和基因共享等方式共同抵抗抗菌药物的作用。
为了解铜绿假单胞菌生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的关系，研究人员开展了大量的实验和研究。
通过研究发现，生物膜相关基因的突变和缺失会导致菌落内生物膜的形成受到抑制。
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是最严重的医院内获得性感染的病原菌之一,生物被膜(Biofilm,BF)多粘附在生物材料和植入的各种导管及人体组织表面,它的形成使得铜绿假单胞菌生物被膜相关感染不断上升,致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制,给治疗增加更大的难度。
临床上已有许多被证实可用于治疗PA生物被膜感染的药物,藻酸盐、密度感应系统对PA生物被膜形成的作用也为治疗生物被膜病提供了新思路。
关键词:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐感应密度系统生物被膜(Biofilm,BF)是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构,而并非单一细菌的膜成分。
细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用,而且还可以对抗人体的免疫清除作用,对人类的健康造成了很大的危害,从而导致严重的临床问题。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染最常见的细菌之一,其生物被膜形成常给临床治疗带来许多困难。
本文就铜绿假单胞菌生物被膜的研究情况进行综述。
1 生物被膜的形成生物被膜的形成过程包括3个方面:①浮游细菌粘附到表面形成单细胞层;②细菌通过群落生长或聚集形成微菌落,进而形成蘑菇状结构;③细菌分泌细胞外多聚物,形成基质,细菌深埋于基质内,成为成熟的生物被膜。
细菌生物被膜结构坚实稳定,不易受到破坏,是细菌为了适应环境、维持自身发展所发生的形态变化。
2 藻酸盐对生物被膜形成的作用据报道,铜绿假单胞菌会在活体内产生藻酸盐,而且在铜绿假单胞菌感染住院的病人的体内也检测到藻酸盐抗体的存在。
这些多糖藻酸盐结构主要成分是甘露糖醛酸和古洛糖醛酸。
研究表明铜绿假单胞菌可以分成粘液型及非黏液型两种表型,粘液型铜绿假单胞菌可借助其表面分泌的藻酸盐,而粘附于异物表面。
Sauer K 等在流动的介质中建立的铜绿假单胞菌生物被膜模型,发现黏液型菌株的生物被膜为塔状或蘑菇状,非黏液型菌株的生物被膜为薄膜状[1]。
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
王文敏;徐志豪
【期刊名称】《浙江大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2010(039)001
【摘要】铜绿假单胞菌是医院内感染重要的致病菌.该菌易形成生物被膜,常给临床治疗带来很多困难.在生物被膜形成的细菌早期定植、蘑菇状结构形成以及细胞外基质生成的各个阶段均受多种分子及基因的调控,而密度感知信号系统整体调控生物被膜的形成.根据生物被膜的形成过程及调控机制,多种针对生物被膜的治疗对策已应用于临床,一些新药物和新方法也在研究之中.
【总页数】6页(P103-108)
【作者】王文敏;徐志豪
【作者单位】浙江大学医学院附属第二医院、浙江大学呼吸疾病研究所,浙江,杭州,310009;浙江大学医学院附属第二医院、浙江大学呼吸疾病研究所,浙江,杭州,310009
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.LuxS/AI-2型群体感应系统调控细菌生物被膜形成研究进展 [J], 刘蕾;桂萌;武瑞赟;李平兰
2.群体感应对铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控 [J], 黄媛媛;宋水山
3.单核细胞增生性李斯特菌生物被膜形成调控机制研究进展 [J], 张辉;崔焕忠;郑鑫
4.SarA调控金黄色葡萄球菌生物被膜形成的研究进展 [J], 郑艳阳;曹凤娇;明迪;母丹;向华
5.鲍曼不动杆菌生物被膜形成与调控的研究进展 [J], 蔺飞; 余彬; 袁明勇; 凌保东因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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・论 著・铜绿假单胞菌生物膜形成影响因素的研究谢红梅,胡必杰,周昭彦,何礼贤(复旦大学附属中山医院,上海200032)摘要:目的 检测各种因素对铜绿假单胞菌(PA E)生物膜形成的影响。
方法 采用恒化器结合改良Robbins装置培养铜绿假单胞菌生物膜,用超声振荡2活菌计数法检测不同条件下形成的生物膜内的活细菌数。
结果 固定其他条件不变,8、24、72h的生物膜内活菌数分别为4.01±0.26、4.59±0.49、5.20±0.47log10CFU/引导片, P<0.01;固定其他条件不变,23、37℃形成的生物膜内活菌数分别为5.12±0.43、5.30±0.42log10CFU/引导片,P<0.05;固定其他条件不变,分别以玻璃和硅胶为生物膜引导片所形成生物膜内活菌数分别为5.49±0.59、6.21±0.40log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以30、90ml/h的培养基流速,其生物膜内活菌数依次为5.44±0.58、5.83±0.52log10CFU/引导片,P<0.01;固定其他条件不变,分别以M63、M2H和LB 作为培养基,生物膜内活菌数依次为6.01±0.75、6.24±0.42、6.66±0.12log10CFU/引导片,P<0.01。
结论延长培养时间、培养温度为37℃、粗糙的黏附材料、高流速和营养丰富的培养基均有利于铜绿假单胞菌生物膜的形成。
关键词:生物膜;铜绿假单胞菌;影响因素;超声振荡;活菌计数中图分类号:R378.99+1 文献标识码:A 文章编号:100524529(2007)1221475204Impact F actors of Pseudomonas aer ugi nosa Biof ilms FormationXIE Hong2mei,HU Bi2jie,ZHOU Zhao2yan,H E Li2xian(Zhon gs han Hos pit al,Fu d an Universit y,S hang hai200032,Chi na) Abstract:OB JECTIVE To compare the difference of Pseudomonas aeruginosa(PA E)biofilms formation in different conditions including incubated time,temperature,attaching materials,and flowing speed.METH ODS PA E biofilms were established in a chemostat2coupled MRD and detected with the method of viable bacteria counting.The number of CFU/disc was measured in different culture time(8h,24h or72h),different temperature(23℃or37℃),different adherent materials(glass or silicone),different flow velocities(30ml/h or 90ml/h)and different culture media(M63medium,M2H broth or LB broth).RESU LTS Keeping the other conditions invariable,the log10CFU/disc of viable bacteria in8h,24h or72h biofilms were4.01±0.26,4.59±0.49or5.20±0.47,respectively(P<0.01),the log10CFU/disc of the viable bacteria in biofilms in23℃or37℃were5.12±0.43or5.30±0.42,respectively(P<0.05),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown on the surfaces of glass or silicone were5.49±0.59or6.21±0.40,respectively(P<0.001),the log10CFU/disc of viable bacteria in biofilms grown in the flow velocities of30ml/h or90ml/h were5.44±0.58or5.83±0.52, respectively(P<0.01),and the log10CFU/disc of viable bacteria in the biofilms grown in M63,M H broth or LB broth were6.01±0.75,6.24±0.42or6.66±0.12,respectively(P<0.01).CONC L USIONS Prolonging the incubating time,at the temperature of37℃,coarse surface material and high flow velocities and rich nutritious culture medium do good for PA E biofilms formation.K ey w ords:Biofilms;Pseudomonas aeruginosa;Impact factors;Viable bacteria counting 细菌生物膜(B F)可定植于植入物、留置导管或人体组织表面引起机体的慢性难治性感染。
随着近年来各种人工器官和留置导管的广泛使用,生物膜相关感染在迅猛地增多[1,2]。
生物膜在形成过程中易受许多因素的影响,而恒化器结合改良Robbins收稿日期:2007208205; 修回日期:2007210215装置这一体外生物膜形成模型的出现,使上述问题得到了有效地解决,它可在维持其他因素恒定的条件下,研究一种因素对生物膜形成的影响。
本研究采用恒化器结合改良Robbins装置研究不同的培养时间、培养温度、生物膜引导材料、培养基流经速度和培养基种类对生物膜形成的影响。
・5741・中华医院感染学杂志2007年第17卷第12期1 材料与方法1.1 材料 黏液型铜绿假单胞菌,为复旦大学附属中山医院临床微生物中心临床分离株。
改良Rob2 bins装置,恒化器(4孔烧瓶),贮液瓶(2000ml单孔烧瓶)均于中科院上海有机所定制。
超声细胞粉碎机为宁波科生公司产品。
生物膜引导片,分别为直径6mm的硅胶片和玻璃片,硅胶片自制,玻璃片在中科院上海有机所定制。
营养肉汤培养基购自上海市疾病预防控制中心。
LB肉汤:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,完全溶解后用5mol/L NaO H(约0.2ml)调节到7.0,加双蒸水至总体积1000ml,121℃高压蒸汽灭菌20min。
M63培养基:KH2PO43g、K2HPO47g,(N H4)2SO42g, FeSO40.0005g,MgSO40.2464g,甘油20ml, 5mg/ml维生素B120ml,加水至总体积1000ml, 121℃高压蒸汽灭菌20min。
1.2 方法1.2.1 生物膜流动培养装置的建立 挑取纯培养的铜绿假单胞菌菌落溶于10ml生理盐水中,使菌液浓度为(2～3)×108CFU/ml,再将其稀释至(2～3)×105CFU/ml。
取7ml稀释液加入含700 ml无菌培养基的恒化器中,至终浓度为(2～3)×103CFU/ml。
连接贮液瓶和已加入菌液的恒化器, 35℃培养8h至对数生长期,检测此时的细菌浓度;接入营养肉汤,调节蠕动泵使流速为120ml/h,经过一定的时间后恒化器中的细菌浓度达到稳定状态,约为(2～3)×108CFU/ml。
将含有无菌引导片的改良Robbins装置与恒化器连接,调节蠕动泵,使菌液以恒定速度流入改良Robbins装置。
每间隔8h测定菌液浓度及维持恒化器的稳定状态[3]。
1.2.2 超声振荡2活菌计数法 将培养一定时间的生物膜引导片从改良Robbins装置中取出,于20ml 无菌生理盐水中轻轻漂洗3次,去除浮游菌,置于含20ml无菌生理盐水的培养瓶中,超声波振荡1.5min,输出功率为180W(超声时间和强度均为实验获得的最佳时间和强度),旋涡振荡5min,使生物膜细菌混合均匀。
将此菌液以10倍梯度连续稀释3次,分别取每个稀释度菌液0.1ml加入血琼脂平皿中,涂布均匀,35℃孵育20～24h;计数活菌数,计算每个膜片上生物膜内的细菌数。
1.2.3 统计分析 数据输入SPSS11.5,采用随机区组方差分析进行统计和分析。
2 结 果2.1 培养时间 在培养过程中,当培养温度为23℃,流经速度为60ml/h,生物膜引导片为玻璃及培养基为营养肉汤时,不同培养时间的生物膜活菌数,差异有统计学意义(F=38.916,P<0.01),生物膜活菌的比较见表1。
表1 不同培养时间、温度、黏附材料和培养基流速的生物膜活菌(log10CFU/引导片)的比较项 目 实验次数(次)1234x±s时间(h)8 4.08±0.10 4.11±0.16 3.86±0.13 3.94±0.54 4.01±0.26 24 4.16±0.66 4.63±0.51 4.74±0.23 4.90±0.13 4.59±0.4972 5.51±0.53 5.42±0.36 4.75±0.28 5.29±0.40 5.20±0.47温度(℃)23 5.01±0.16 4.82±0.30 5.51±0.40… 5.12±0.43 37 5.50±0.23 4.79±0.16 5.62±0.19… 5.30±0.42黏附材料玻璃 5.90±0.26 5.07±0.53…… 5.49±0.59硅胶 6.57±0.09 5.85±0.11…… 6.21±0.40培养基流速(ml/h)30 4.69±0.08 5.96±0.14 5.60±0.22… 5.44±0.58 90 5.51±0.59 6.29±0.12 5.67±0.39 5.83±0.52…2.2 培养温度 当流经速度为60ml/h,生物膜引导片为玻璃,培养基为营养肉汤及培养时间为72h, 37℃较23℃更适于生物膜的形成,前者活菌数高于后者(F=4.559,P<0.05)(表1)。