铜绿假单胞菌生物膜体外模型
铜绿假单胞菌解析ppt课件
ห้องสมุดไป่ตู้麦芽 15%
其他 13%
不动杆菌 16%
铜绿假单胞 菌 56%
非发酵菌分离率
2019 21
假单胞菌属Pseudomonas
• 共同特点： G-b 菌体细长 单端鞭毛 无芽胞 专性需O2 营养要求不高 35℃生长，少数4℃、42 ℃生长 葡萄糖O/－ 动力+ 氧化酶+ 可产多种色素：绿脓素 荧光素 脓玉红素
• 书本P163 5.26
-
9
样 品 10g
10 ml
BL
100 ml
缓冲液
供试 液
10ml
BL 阳性
BL 阴 性 十六烷基三甲基溴化铵平板
培养温度： 36℃
营养琼脂斜面
培养时间： 十六烷基三甲基溴化铵平板 18~24h （必要时可 2019 延长至48h）
-
增菌培养
10
供试品
供试液
胆盐乳糖增菌液
铜绿假单胞菌
• 抗原： O抗原(外膜蛋白-保护性抗原 脂多糖-型特异性) H抗原 血清学分型 • 抵抗力： 抵抗力强 耐干燥 不耐热 多重耐药 在室温水中长期生存 4℃不生长
2019 27
铜绿假单胞菌
致病性
• 广泛存在环境中的条件致病菌，是院内感染 主要病原菌 • 可引起皮肤感染、呼吸道感染、泌尿道感染、 烧伤感染、囊性纤维变性等 • 有多种毒力因子：包括菌毛、荚膜多糖、内 毒素、外毒素、绿脓菌素、蛋白酶、磷脂酶 等 2019 28
常见非发酵菌初步分群鉴定
试验 假单胞 不动杆 产碱杆 黄杆 莫拉 菌属 菌 属 菌 属 菌属 菌属 氧化酶 + + + + 葡萄糖O/F O/O/O/F 动力 + + MAC平板生长 + + + +/-
氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜的干预作用及机制研究的开题报告
氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌生物膜的干预作用及机制研
究的开题报告
1. 研究背景与意义：粘液型铜绿假单胞菌是一种常见的致病菌，它常常通过形成生物膜来逃避机体免疫系统和常规抗生素的攻击，导致感染难以治愈和复发。
氨溴索
作为一种广泛应用于临床的抗蕈菌、抗细菌药物，对粘液型铜绿假单胞菌的生物膜形
成是否有干预作用还需进一步探究。
2. 研究内容：本研究将采用体外培养模型，以粘液型铜绿假单胞菌为对象，探究氨溴索对菌体生长和生物膜形成的影响，同时研究氨溴索是否能够调控粘液型铜绿假
单胞菌生物膜相关基因的表达，并从分子水平上探究其作用机制。
3. 研究方法：采用体外培养方法培养粘液型铜绿假单胞菌，通过浓度梯度法确定氨溴索对菌体生长的影响，利用普通染色法以及荧光素标记技术观察生物膜形成的遗
传学特征，使用实时荧光定量PCR技术检测关键基因的表达情况，并进一步通过蛋白质组学技术分析氨溴索对生物膜形成的影响。
4. 研究预期结果：本研究预计可以明确氨溴索对粘液型铜绿假单胞菌的生物膜形成的干预作用和机制，为粘液型铜绿假单胞菌的临床治疗提供新思路和新方式。
同时，本研究对氨溴索等类似类抗生素的抗菌特性和抗生素作用机制也有一定的参考价值。
5. 研究难点：本研究的难点主要在于建立可靠的体外培养模型，探究粘液型铜绿假单胞菌的生物膜形成机理，并从分子水平上研究可选用药物的作用机制，同时也需
要在实验过程中避免一些方法学上的误差和实验结果的随机性。
6. 研究意义：本研究对粘液型铜绿假单胞菌的生物膜形成和有效治疗提供了新思路和新方向，有望为防治此类感染提供有效的药物参考和临床指导。
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究
铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性相关性探究铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种常见的致病菌，可以导致各种感染，尤其在医疗机构和免疫功能低下的人群中特别常见。
其中，铜绿假单胞菌的生物膜形成和抗菌药物耐受性是该菌引起感染并导致治疗困难的重要原因之一。
本文将探究铜绿假单胞菌的生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的相关性。
生物膜是铜绿假单胞菌在环境中常见的生存形式，它是由菌落中的细菌通过分泌胞外多糖以及其他黏附因子形成的一层黏稠的聚集体。
生物膜在菌落内提供了保护和致病的优势。
在生物膜内，铜绿假单胞菌形成了一种高度结构化的矩阵，其中包括细菌细胞本身、胞外多糖、蛋白质以及DNA等物质。
铜绿假单胞菌生物膜的形成是一个复杂的过程，涉及多个遗传和环境因素的调控。
首先，一些遗传因素可以促进生物膜的形成。
例如，细菌生物膜有关的基因簇（pel和psl）会编码产生胞外多糖的酶以及其他黏附因子。
此外，铜绿假单胞菌还可以通过调节某些转录因子（例如vqsR和lasR）的表达来控制生物膜的形成。
其次，环境条件对生物膜形成也有重要影响。
铜绿假单胞菌通常生长在潮湿和富含养分的环境中，例如人体上的生化硝化滤池、人体创口和医疗设备表面等。
在这些环境中，菌落周围的水分和营养素可以促进细菌的黏附并形成生物膜。
此外，一些物理和化学参数，例如温度、pH值和氧气浓度，也会影响生物膜的形成。
铜绿假单胞菌生物膜的形成对抗菌药物的耐受性具有重要意义。
一方面，生物膜提供了一种物理屏障，使得抗菌药物难以通过，从而减少了其对菌落内细菌的杀菌效果。
另一方面，生物膜内的细菌通常处于生长缓慢或处于休眠状态，这使得它们对抗菌药物的杀菌作用更加耐受。
此外，生物膜中的细菌群体也通过细菌间的相互作用和基因共享等方式共同抵抗抗菌药物的作用。
为了解铜绿假单胞菌生物膜形成与抗菌药物耐受性之间的关系，研究人员开展了大量的实验和研究。
通过研究发现，生物膜相关基因的突变和缺失会导致菌落内生物膜的形成受到抑制。
头孢他啶体外诱导铜绿假单胞菌敏感株产生耐药的实验研究
头孢他啶体外诱导铜绿假单胞菌敏感株产生耐药的实验研究沈佳丽【摘要】目的体外诱导敏感的铜绿假单胞菌产生耐药,为临床合理使用抗菌药物提供实验室依据.方法以临床分离的敏感的铜绿假单胞菌为研究对象,以头孢他啶为诱导剂,先测定实验菌株对头孢他啶的MIC值,以1/4MIC为起始诱导浓度,共诱导25代,对诱导后的菌株进行耐药性分析,并观察其稳定性.结果实验菌株经诱导后对头孢他啶的MIC值均上升,经全自动细菌鉴定仪分析后发现所有菌株对头孢菌素类呈耐药,部分菌株对碳青霉烯类也呈耐药,但对氨基糖苷类及喹诺酮类未耐药.结论合理选择抗菌药物的剂量可作为预防细菌耐药的重要措施.【期刊名称】《中国继续医学教育》【年(卷),期】2017(009)017【总页数】3页(P61-63)【关键词】铜绿假单胞菌;头孢他啶;体外诱导;细菌耐药【作者】沈佳丽【作者单位】常州市武进人民医院检验科,江苏常州 213161【正文语种】中文【中图分类】R378铜绿假单胞菌是医院感染的常见病原菌之一，也是免疫功能低下、严重创伤、长期住院患者合并感染的常见病原菌，可引起呼吸科、烧伤科、重症监护病房等病区的暴发流行。
对于铜绿假单胞菌的感染，临床常规选择三代头孢菌素作为经验用药，但在治疗过程中极易出现耐药，给临床治疗带来问题[1-2]。
本文主要研究在体外用头孢他啶诱导铜绿假单胞菌产生耐药，观察诱导过程中铜绿假单胞菌的变化以及诱导后的稳定性，为临床合理用药，防治细菌耐药提供新的思路。
20株铜绿假单胞菌敏感菌株均收集自我院2016年7—12月住院患者标本，标本种类包括痰、血、分泌物、中段尿、咽拭子等，初筛药敏实验由Vitek 2 Compact及BD Phonenix 100全自动细菌鉴定仪完成，受试菌株对常规监测的11种抗菌药物均为敏感，包括阿米卡星（AMK）、环丙沙星（CIP）、左旋氧氟沙星（LEV）、氨曲南（ATM）、头孢他啶（CAZ）、头孢吡肟（FEP）、亚胺培南（IPM）、美洛培南（MEM）、哌拉西林（PIP）、哌拉西林/他唑巴坦（TZP）、庆大霉素（GEN）。
药学毕业论文--盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究
盐酸氨溴索联合环丙沙星抗铜绿假单胞菌成熟生物膜作用研究作者：李芳余加林杨华李禄全陈波曼【摘要】目的构建铜绿假单胞菌发光菌株，建立铜绿假单胞菌生物膜(biofilm，BF)模型，研究盐酸氨溴索对铜绿假单胞菌成熟BF的影响及与环丙沙星合用是否具有协同杀菌作用。
方法将携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的质粒转染铜绿假单胞菌，平板培养法培养铜绿假单胞菌BF，建立铜绿假单胞菌BF体外模型，经盐酸氨溴索作用后，扫描电镜(scanning electron microscope，SEM)观察盐酸氨溴索对BF形态结构的影响，荧光显微镜定性观察盐酸氨溴索对BF内活菌的作用，通过发光菌株荧光强度定量分析盐酸氨溴索单独作用以及与环丙沙星联用后BF内活菌量。
结果盐酸氨溴索作用后电镜观察可见黏液样物变稀疏，不规则。
盐酸氨溴索浓度大于0.49mg/mlBF内活菌数减少(F=18，P<0.05)；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用(F=15.1，P<0.05)，且随着盐酸氨溴索浓度升高协同作用增强。
结论盐酸氨溴索破坏铜绿假单胞菌成熟BF 形态结构，减少其内活菌数；盐酸氨溴索与环丙沙星存在协同作用，增强其杀菌能力。
【关键词】盐酸氨溴索；环丙沙星；铜绿假单胞菌；生物膜ABSTRACT Objective To establish a biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro and observe the effect of ambroxol on biofilm of Pseudomonas aeruginosa, and study the synergistic effect with ciprofloxacin on tested specimens. Method Plasmids carried with green fluorescent protein (GFP) was tansfected to the strain of Pseudomonas aeruginosa. Plate culture method was used to establish biofilm model of Pseudomonas aeruginosa in vitro. After ambroxol was added to the biofilm, the appearance of the biofilm was detected by scanning electron microscope (SEM), and the viable counts of bacterial in biofilm after treated by ambroxol alone and together with ciprofloxacin were determined by bio-fluorescence method. Result After adding ambroxol, the biofilm was thin and abnormal compared with the control by SEM detection. Further detection with fluorescence microscope showed the viable bacteria in biofilm was reduced significantly (F=18, P<0.05) when its concentration was higher than 0.49 mg/ml, destroyed furthermore, there was the synergistic effect between ambroxol and ciprofloxacin (F=15.1, P<0.05). The effect enhanced with the increasing concentration of ambroxol. Conclusion Ambroxol destroyedfurthermore the biofilm shape of Pseudomonas aeruginosa, restrained its growth, and had the synergistic effect on bactericidal activity with ciprofloxacin.KEY WORDS Ambroxol; Ciprofloxacin; Pseudomonas aeruginosa; Biofilm生物膜(biofilm，BF)是细菌黏附在物体表面上形成的一种具有高度结构性的膜状复合物，其主要成分是细菌分泌的胞外基质和细菌菌体［1］。
EDTA-2Na联合抗菌药物对铜绿假单胞菌的体外抑菌及生物膜抑制作用研究
EDTA-2Na 联合抗菌药物对铜绿假单胞菌的体外抑菌及生物膜抑制作用研究廖文丽1 孙瑶1 陈涛1 喻凯航2 徐雯雅1 林婕1 周铁丽1,*(1 温州医科大学附属第一医院医学检验中心，温州 325000；2 温州医科大学检验医学院 生命科学学院，温州 325000)摘要：目的 探讨乙二胺四乙酸二钠(ethylenediaminetetraacetic acid disodium ，EDTA-2Na)联合抗菌药物对铜绿假单胞菌的体外抑菌及生物膜抑制作用。
方法 对临床分离的10株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌、8株黏菌素耐药铜绿假单胞菌和8株阿米卡星耐药铜绿假单胞菌，通过微量肉汤稀释棋盘法检测EDTA-2Na 分别与亚胺培南、黏菌素和阿米卡星联用以及各自单用时对相应耐药菌株的最小抑菌浓度(minimal inhibititory concentration ，MIC)，并通过计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index ，FICI)评价联合抑菌效果；结晶紫生物膜试验检测EDTA-2Na 分别与亚胺培南、黏菌素和阿米卡星联用及各自单用时对相应耐药菌株生物膜的抑制作用，通过测量A 595值评价抑制生物膜效果。
结果 EDTA-2Na 与亚胺培南、黏菌素和阿米卡星联用后对相应耐药菌株的抑菌作用表现为协同或相加，对生物膜也具有明显的协同抑制作用。
结论 EDTA-2Na 联合抗菌药物对铜绿假单胞菌具有良好的体外抑菌作用及抑制生物膜作用。
关键词：铜绿假单胞菌；EDTA-2Na ；微量肉汤稀释棋盘法；结晶紫生物膜试验中图分类号：R978.1 文献标志码：AIn vitro inhibitory activity and biofilm inhibition effects of EDTA-2Na combinedwith antibacterial agents against Pseudomonas aeruginosaLiao Wen-li 1, Sun Yao 1, Chen Tao 1, Yu Kai-hang 2, Xu Wen-ya 1, Lin Jie 1 and Zhou Tie-li 1(1 Laboratory Medicine Center, the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000;2 School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000)Abstract Objective To evaluate the inhibitory and biofilm inhibitory effects of ethylenediaminetetraacetic acid disodium (EDTA-2Na) combined with antibacterial agents against Pseudomonas aeruginosa isolates in vitro . Methods Ten clinical isolates of imipenem-resistant P . aeruginosa , eight colistin-resistant P . aeruginosa isolates, and eight amikacin-resistant P . aeruginosa isolates were collected from different specimens of different inpatients from the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University from 2015 to 2017. Minimal inhibitory concentrations (MICs) of EDTA-2Na combined with imipenem, colistin or amikacin, and the four drugs used alone against P. aeruginosa were detected by the checkerboard dilution method, and the fractional inhibitory concentration index (FICI) was calculated to evaluate antibiotic effects. The inhibitory effect of EDTA-2Na combined with imipenem, colistin or amikacin, and the latter three drugs used alone against P . aeruginosa were detected by the crystal violet biofilm test, and the A 595 values were measured to evaluate biofilm inhibitory effects. Results The inhibitory effects of the收稿日期：2020-03-20基金项目：国家自然科学基金(No. 81971986)；浙江省教育厅一般科研项目(No. Y201942275)作者简介：廖文丽，女，生于1993年，在读硕士研究生，研究方向：临床检验诊断学，E-mail:**********************通讯作者，E-mail:**************文章编号：1001-8689(2021)02-0137-06药理与临床铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)是医院获得性感染的常见病原菌。
绿色荧光蛋白标记铜绿假单胞菌生物膜形成的动态观察及结构定量分析
ＡＢＳ ＴＲＡＣＴ Ｏｂ ｅ ｔｖ Ｔｏ ｑ ａ ｔ ｙ ｔ ｅ ｓ ｑ ｅ ｔａ ｅ ｅｏ ｍｅ ｔｏ ｉｆｌ ｓ ａ ｉｌｓ ｒ ｃ ｕ ｅ ｉ ｉｆ ｍ ｊ ｃｉｅ ｕ ｎ ｉ ｈ ｅ ｕ ｎ ｉｌｄ ｖ ｌｐ ｎ ｆｂｏ ｉ ｆ ｍ ｐ ｔａ ｔｕ ｔ ｒ ｎ ｂｏ ｉ ｌ
关 键 词 ： 生 物 膜 ； 铜 绿 假 单 胞 菌 ； 定 量 分 析 ； 结 构
中围 分 类 号 ： ７ ． ９ Ｒ３ ８ ９ １ 文献标识码 ： Ａ
Ｔｈ ａ ｔｔｖ ｎ ｌ ｓ ｓ ｏ ｅ ｕ ｎ ｉ ｌｄｅ ｅ ｏ ｅ ｑｕ ｎ ｉｉ ｅ ａ ａ ｙ ｉ ｆ ｓ ｑ ｅ ｔａ ｖ ｌ ｐｍ ｅ ｆ ｂ ｏ ｉｍ ｐ ｔａ ｔ ｕ ｔ ｒ ｆ ｎｔｏ ｉ ｆ ｌ ｓ ａ ｉ ｌｓ ｒ ｃ ｕ ｅ ｏ Ｐ． ｒ ｉ ｓ ａ ｇ ｄ ｗｉｈ ｇ ｅ ｎ ｆ ｕ ｒ ｓ ｅ ｅ ｐ ｏ ｅ ｎ ａｅ ｕｇ ｎｏ ａ ｔ ｇ ｅ ｔ ｒ ｅ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎｃ ｒ ｔ ｉ
ＡＤ 和结 构 熵 （ ｘｕａ ｅ ｔ ｐ ， Ｅ） Ｂ Ｄ） ｔ ｔｒｌ ｎｒ ｙ Ｔ 在 Ｆ形 成 的 ６ ｅ ｏ ｈ和 ６ ｄ分 别 为 ： ．８ ００ ０ ９ 士 ． １和 ０ ９ 士 ０ ０ ， 现 下 降 趋 势 ；． ０ ００ ９和 ．２ ．２呈 １０ 土 ． ０
１Ｏ 士００７虽 变化 幅度不 大 ， 亦呈 现逐 渐增 加趋势 ；．土００ ． ６ ．２ ， 但 ０ ７ ． ８和 ４ ３ ． ９ 呈 明 显 上 升 趋 势 。结 论 ＩＡ 程 序 可 以 表 征 ． 士０ ０ ， Ｓ Ｐ ＡＯ１菌株 Ｂ 的空 间结 构 特 征 ， 细 菌 Ｂ Ｆ 对 Ｆ结构 的定 量 化 分析 也 有 助 于 探 索 Ｂ Ｆ形 成 过 程 与 其 生 物 学 行 为 之 间 的 相 互 联 系 。
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展
铜绿假单胞菌生物被膜研究进展摘要:铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是最严重的医院内获得性感染的病原菌之一,生物被膜(Biofilm,BF)多粘附在生物材料和植入的各种导管及人体组织表面,它的形成使得铜绿假单胞菌生物被膜相关感染不断上升,致使慢性感染性疾病反复发作且难以控制,给治疗增加更大的难度。
临床上已有许多被证实可用于治疗PA生物被膜感染的药物,藻酸盐、密度感应系统对PA生物被膜形成的作用也为治疗生物被膜病提供了新思路。
关键词:铜绿假单胞菌生物被膜藻酸盐感应密度系统生物被膜(Biofilm,BF)是细菌为适应自然环境,在生长过程中附着于固体表面而形成的特殊存在形式,是由多细菌组成的膜状结构,而并非单一细菌的膜成分。
细菌生物被膜的生存方式不仅可以保护其中的细菌抵抗临床抗生素和工业设施中杀菌剂的作用,而且还可以对抗人体的免疫清除作用,对人类的健康造成了很大的危害,从而导致严重的临床问题。
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)是医院内感染最常见的细菌之一,其生物被膜形成常给临床治疗带来许多困难。
本文就铜绿假单胞菌生物被膜的研究情况进行综述。
1 生物被膜的形成生物被膜的形成过程包括3个方面:①浮游细菌粘附到表面形成单细胞层;②细菌通过群落生长或聚集形成微菌落,进而形成蘑菇状结构;③细菌分泌细胞外多聚物,形成基质,细菌深埋于基质内,成为成熟的生物被膜。
细菌生物被膜结构坚实稳定,不易受到破坏,是细菌为了适应环境、维持自身发展所发生的形态变化。
2 藻酸盐对生物被膜形成的作用据报道,铜绿假单胞菌会在活体内产生藻酸盐,而且在铜绿假单胞菌感染住院的病人的体内也检测到藻酸盐抗体的存在。
这些多糖藻酸盐结构主要成分是甘露糖醛酸和古洛糖醛酸。
研究表明铜绿假单胞菌可以分成粘液型及非黏液型两种表型,粘液型铜绿假单胞菌可借助其表面分泌的藻酸盐,而粘附于异物表面。
Sauer K 等在流动的介质中建立的铜绿假单胞菌生物被膜模型,发现黏液型菌株的生物被膜为塔状或蘑菇状,非黏液型菌株的生物被膜为薄膜状[1]。
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一、改良平板法建立铜绿假单胞菌生物膜体外模型
（扫描电镜观察）
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次
3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌
4、2.5%戊二醛预固定2小时（戊二醛能通过固定核蛋白来固定组织和细胞中的DNA和RNA，能保存糖原，也可以固定和蛋白质有关联的或含有氨基和亚氨基的脂类。
但是只使用戊二醛固定的样品无法阻止后面的脱水、渗透和包埋过程对样品脂类的抽提，因而对细胞膜的固定效果不理想。
）
5、0.1mol/LPBS漂洗三次，再用1%锇酸固定2小时（经锇酸固定后，又能防止用酒精脱水时所产生的沉淀作用。
也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂）
6、40-100%系列浓度酒精脱水（1、酒精可以置换组织内的水，最终脱水用的是无水乙醇。
高浓度的酒精（95%以上）对细菌有强烈的收缩和脆化的缺点，因此洗后不能立即投入高浓度酒精中。
脱水时为了避免细菌萎缩、僵硬，应在不同浓度的酒精里逐渐脱水。
2、如果使用高浓度酒精，对细菌蛋白脱水过于迅速，这时细菌表面蛋白质首先变性凝固，形成了一层坚固的包膜，酒精反而不能很好的深入细菌内部）
7醋酸乙戊酯置换（醋酸乙戊酯的极性较弱,临界点干燥时可以更好的与co2置换,从而更加完整的保持生物样品的表面形态.）
8将盖玻片装入样品盒中置HCP-2临界点干燥仪中干燥2小时（扫描电镜在观察样品要求在高真空中进行。
无论是水还是脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈的汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构，因此，样品在用电镜观察前必须要干燥。
）
9喷金三分钟，电镜扫描（生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。
用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。
因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。
）
二、激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入无菌盖玻片，37°培养，每24小时换培养液一次
3、分别在24小时，3天，6天取出盖玻片，PBS漂洗三次，除去浮游细菌
4、SYTO9/PI荧光探针标记生物膜：将上述盖玻片加入等体积混合配置好的染料，室温避光孵育15min，PBS三次冲洗未结合染料。
5、用激光共聚焦显微镜观察铜绿假单胞菌生物膜：活菌具有完整细胞壁而死菌不具备。
SYTO9可以穿越任何细胞壁与DNA结合，PI不能穿越完整细胞壁，但透过不完整细胞壁后对DNA有更大的亲和力，故在死菌中PI可取代SYTO9与DNA 结合。
在488nm激光的激发SYTO9呈亮绿色，代表活菌；PI 呈红色，代表死菌。
三、银染法
1、取单克隆培养过夜的菌液，LB培养基1：200稀释
2、取3ml置于6孔平底组织培养板中，每孔放入医用硅胶膜，37°培养，每24小时换培养液一次
3、灭菌生理盐水多次漂洗，去掉浮游菌
4、25%戊二醛PBS溶液固定1小时
5、蒸馏水清洗一分钟
6、饱和氯化钙溶液结合15分钟
7、蒸馏水清洗15分钟
8、5%硝酸银溶液反应15分钟
9、1%对苯二酚反应2分钟
10、蒸馏水漂洗1分钟
11、5%硫代硫酸钠溶液固定2分钟
12蒸馏水漂洗1分钟
13普通光学显微镜即可观察，黑染部分为生物被膜，空白处为生物被膜“孔道”，空白硅胶片银染后呈散落的黑点或黑斑。
（1硝酸银溶液需要过滤2漂洗应该轻重过度）。