大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用_彭程
铜绿假单胞菌的群感效应及大环内酯类药物的临床治疗研究进展
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2017YFC1309702)
DOI10 3760 cmajcn131368
20191201
01694
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大环内酯类抗生素可减少细菌的生物被膜
2013.11.19生物被膜：常见病原菌：感染特点：➢参考文献12篇，选取5篇，均为回顾性研究细菌生物被膜耐药机制➢营养限制生物被膜内营养物质、氧气的消耗以及代谢废物的聚集都可促使细菌➢抗生素渗透障碍➢被膜菌独特的表型结构卢中秋、赵光举细菌生物被膜的研究进展微生物学杂志2007年1月第24卷第一期➢红霉素罗红霉素克拉霉素环丙沙星张文元、杨亚冬、唐靓（浙江省医学科学院生物工程研究所）十四元环大环内酯类对细菌生物被膜形成的影响及对环丙沙星的增效作用中国抗生素杂志2009年11月第34卷第11期A组生物被膜组（BBF组）B1组1MIC阿奇霉素BBF组B2组1/8MIC阿奇霉素BBF组C1组1MIC红霉素BBF组C2组1/8MIC红霉素BBF组D1组1MIC罗红霉素BBF组D2组1/8MIC罗红霉素BBF组结果表明：在阿奇霉素和红霉素的作用下生物被膜肺炎克雷伯菌的β-内酰胺酶活性明显降低，而罗红霉素对生物被膜肺炎克雷伯菌的β-内酰胺酶活性没有明显的影响。
高浓度的阿奇霉索是临床治疗生物被膜菌感染的理想药物选择。
李乃静、李伟、李岩、李胜岐、何平大环内酯类抗生素对生物被膜菌产β-内酰胺酶的作用中国医师进修杂志2011年第34卷第16期分组β-内酰胺酶活性值A组（BBF组）0.6534U/mgB1组1MIC阿奇霉素BBF组0.3196U/mg(1)B2组1/8MIC阿奇霉素BBF组0.4260U/mg(2) C1组1MIC红霉素BBF组0.5028U/mg(3)C2组1/8MIC红霉素BBF组0.5108U/mg(4)D1组1MIC罗红霉素BBF组0.6470U/mg(5)D2组1/8MIC罗红霉素BBF组0.6524U/mg(6)➢单独用时：➢联合其他敏感抗生素用时：张姝娜、郭生玉、李胜岐（沈阳市第六人民医院）头孢噻肟单用及与罗红霉素合用对体内肺炎克雷伯菌生物被膜的作用中华医院感染学杂志2005年第15卷第9期➢➢贾鸣、胡晓梅、胡福泉（第三军医大学基础部微生物教研室）细菌生物被膜的耐药机制及控制策略生命的化学2008年第28卷第3期。
铜绿假单胞菌生物被膜形成的调控及治疗对策研究进展
ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｂｉｏｆｉｌｍ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｉｍｉｔａｔ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｓｅｖｅｒａｌ ａｎｔｉ—ｂｉｏｆｉｌｍ
及菌细胞外ＤＮＡ也参与“帽子”形成与生物被 膜结构的成熟¨－。 １．２．３ 调控生物被膜基质形成的分子及其基 因细菌形成蘑菇状结构后，大量分泌多聚 物——菌细胞外基质包绕在蘑菇状结构之外， 形成稳固的生物被膜。基质主要由蛋白、多糖 和核酸组成，其中藻酸盐是胞外摹质多糖的主 要成分之一。基质多糖在细菌定植形成微菌落 时已开始分泌，在蘑菇状结构形成后分泌才大 量增加。藻酸盐能清除自由基，保护细菌免受 吞噬细胞的清除作用，影响牛物被膜的抵抗 性【８ Ｊ。藻酸盐产生受ａｌｇ基因的调节。铜绿假 单孢菌的ａｌｇ基因根据功能分成３种，即合成 基因、调节基因和基因转换基因。ａｉｇＤ、ａｌｇＧ基 因直接催化藻酸盐的合成；ａｌｇｚ、ａｌｇＲ和ａｌｇＢ基 因调节藻酸盐的合成；转换摹冈ａｌｓＴ、ｍｕｃＡ、 ｍｕｃＢ、ｍｕｃＣ和ｍｕｃＤ介导Ａｌｇ＋表型的转换。 ａｌｇＤ基因编码ＧＤＰ－＿Ｈ．露糖脱氢酶，其活化是藻 酸盐合成调节途径的关键点，受藻酸盐转换基 因和调节基因的调控。ａｌｇＴ基因编码ｓｉｇｍａ２２ 因子，正性调控自身的启动子ＰａｌｇＴ以及ａｌｇＲ 等调节基因的表达；而ｍｕｃ摹冈则编码反 ｓｉｇｍａ２２因子或类似负性调节因子，抑制ａｌｇＴ基 因的表达。调节基囚ａｌｇＲ与ａｌｇＴ结合后上调 ａｌｇＤ的转录和下游的合成基因∽Ｊ。产藻酸盐 黏液型菌株的增加主要是由于ｍｕｃ负性调节 基凶的突变，引起转换基因ａｌｇＴ表达增加，并 导致调节基因ａｌｇＲ和合成基因ａｌｇＤ的高水平 的转录，从而引起细菌由非黏液型向黏液表型 的转变。
大环内酯类作用原理
大环内酯类作用原理
大环内酯类药物是一类广泛应用于临床的抗菌药物。
这类药物的作用原理主要是通过抑制细菌的蛋白质合成来发挥抗菌作用。
大环内酯类药物通过与细菌的核糖体结合，阻止其进行蛋白质的合成。
在细菌的细胞内，核糖体是负责将mRNA上的遗传
信息转化为蛋白质的主要机构。
大环内酯类药物通过与核糖体上的23S rRNA结合，阻断其与mRNA的结合，从而阻止细
菌进行蛋白质的合成。
由于细菌的生长和繁殖过程中需要合成大量的蛋白质，而且蛋白质在细菌的代谢和功能中扮演着重要的角色，因此抑制蛋白质的合成会导致细菌无法正常生长和繁殖，从而达到抗菌的效果。
不同的大环内酯类药物对细菌的作用机制略有不同，但总的来说，它们都可以通过与核糖体结合来抑制蛋白质的合成，从而达到抗菌的效果。
这类药物对革兰阳性菌和某些革兰阴性菌均有较好的抗菌活性，广泛用于治疗呼吸道、皮肤软组织和泌尿系统感染等细菌感染疾病。
总而言之，大环内酯类药物通过抑制细菌的蛋白质合成来发挥抗菌作用，从而阻止细菌的生长和繁殖，达到治疗感染疾病的目的。
大环内酯类药物对铜绿的影响
大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物被膜的影响文献内容简介：1、大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的形成有抑制作用，研究不同结构的大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物被膜的影响，为临床合理应用大环内酯类药物治疗细菌生物被膜病提供理论依据。
2、大环内酯类药物通过抑制藻酸盐生成，减少藻酸盐复合物，并减少藻酸盐复合物引起的抗原抗体反应以及抑制鞭毛、菌毛的生成、活性等作用来抑制细菌生物膜生成，而且在抑制细菌生物膜形成的同时，也减少了PA对其他抗生素的耐药性，能帮助其他抗生素渗入到菌体，增强杀菌能力。
文献分析与评论：多种细菌(如铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌等)可粘附于生物医学材料或有机腔道表面，分泌多糖蛋白复合物，并将自身克隆包裹起来，形成细菌生物被膜(BBF)。
由于细菌生物被膜的存在，抗菌药物不易与细菌直接接触，导致被膜下细菌不易被抗菌药物杀灭，从而产生耐药性，并由此引起细菌潜伏，感染反复发作，使细菌对机体的损害进一步加重。
有研究显示[1]，不同结构的大环内酯类药物对细菌生物被膜产生作用不完全相同。
十四、十五元环的大环内酯类药物克拉霉素、阿齐霉素与加替沙星联合应用与单用加替沙星被膜存活菌数相比显著下降，对铜绿假单胞菌生物被膜有协同作用，而铜绿假单胞菌对大环内酯类药物并不敏感，此协同作用并非通过杀菌作用叠加而产生的，可能主要是通过减少细菌粘附，抑制生物被膜的形成，从而使抗菌药物容易透过被膜接触到细菌，杀菌效果增强。
而十六元环大环内酯类螺旋霉素对细菌粘附性无明显影响，同时螺旋霉素与加替沙星未产生协同作用。
生物膜的主要成分是胞外黏多糖，黏多糖的主要成分是藻酸盐，鞭毛和Ⅳ型菌毛也是生物膜的构成成分。
另有研究显示[2]，十四、十五元环大环内酯类药物可通过抑制藻酸盐合成所必需的甘露糖脱氢酶，减少藻酸盐的合成，而十六元环大环内酯类并无此作用。
有实验证明[3]，红霉素、阿奇霉素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成。
有实验表明[4]，红霉素治疗明确为铜绿假单胞菌感染的病例10d后，取得患者痰中铜绿假单胞菌标本，用比色法测铜绿假单胞菌产生的藻酸盐量明显减少，并发现红霉素治疗组患者对其他抗生素的耐药性降低。
抗铜绿假单胞菌生物膜药物研究进展
[13] Furiga A, Lajoie B, et al. Impairment of Pseudomonas
aeruginosa Biofilm Resistance to Antibiotics by Combining the
Drugs with a New Quorum-Sensing Inhibitor[J].Antimicrob Agents
Pseudomonas Aeruginosa Lectins As Targets for Novel Antibacterials
凝集素抑制剂
[2]A.V. Grishin, M.S.Krivozubov, et al. Pseudomonas Aeruginosa L1e9ctins As Targets for Novel Antibacterials[J].Acta Naturae, 2015,7 (25):28-41.
（quorum sensing system，QS system）
11
[5]饶敏,魏维,等. 铜绿假单胞菌的群体感应系统与其致病及耐药机制[J]. 世界临床药物,2011,32(6):337-341+351.
铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展
[6]曾莉莉,史道华,等. 铜绿假单胞菌群体感应系统及其抑制剂的研究进展[J]. 中国抗生素杂志,2014,39(9):70112-705+714.
Impairment of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Resistance to Antibiotics by Combining the Drugs with a New Quorum-Sensing Inhibitor
大环内酯类药物在铜绿假单胞菌治疗中的作用
大环内酯类在铜绿假单胞菌治疗中的作用铜绿假单胞菌属假单胞菌属，是一种需氧革兰阴性杆菌，广泛分布于自然界(空气、土壤、水)及正常人的皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。
铜绿假单胞菌可以可粘附于生物医学材料或有机腔道表面，分泌多糖蛋白复合物，并将自身克隆包裹起来，形成细菌生物被膜[1]。
由于细菌生物被膜的存在，抗菌药物不易与细菌直接接触，细菌生物被膜下细菌代谢率也降低，导致被膜下细菌不易被抗菌药物杀灭，从而产生耐药性，当铜绿假单胞菌在呼吸道定植形成感染后，其产生的藻酸盐会在呼吸道局部与藻酸盐抗体产生抗原抗体反应，介导炎症反应，造成气道周围炎性细胞渗出，从而在感染基础上进一步引起呼吸道的免疫病理损伤。
另外细菌生物被膜本身可抑制和阻止机体的免疫反应，产生免疫逃逸，并导致抗原一抗体复合物沉积，发生变态反应，使细菌对机体的损害进一步加重[2]。
对铜绿假单胞菌不敏感的大环内酯类药物临床上对PA感染病例的有效性，使人们对大环内酯类药物的作用得以重新认识。
大量的证据显示，大环内酯类药物对PA有效，但是其作用机制仍不甚清楚。
推测大环内酯类药物对PA感染的作用不是通过经典的核糖体途径(与细菌核糖体的50S亚基结合，从而抑制细菌蛋白质合成)，而是通过免疫调节、抗炎作用和抑制细菌毒力[3]。
小林宏行等认为十四、十五元环大环内酷类药物可通过抑制藻酸盐合成所必需的甘露糖脱氢酶(GMD)减少藻酸盐的合成[2]，从而使抗菌药物容易透过被膜接触到细菌，杀菌效果增强而十六元环大环内酯类并无此作用。
多项体外研究试验已经证明了这一点[4]。
国内也有人进行了试验。
将阿奇霉素、克拉霉素、螺旋霉素分别于加替沙星合用。
实验中，克拉霉素、阿齐霉素、螺旋霉素分别为十四、十五、十六元环大环内酯药物，其中克拉霉素、阿齐霉素可降低细菌对硅胶片的粘附性，而螺旋霉素对细菌粘附性无明显影响。
克拉霉素、阿齐霉素与加替沙星对铜绿假单胞菌生物被膜有协同作用[5]。
创伤后铜绿假单胞菌生物膜感染的治疗进展
创伤后铜绿假单胞菌生物膜感染的治疗进展摘要：铜绿假单胞菌感染在创伤后常见，且治疗效果不佳，近年来对铜绿假单胞菌的不断研究，发现在其生物膜形成后，对药物有明显的抵抗作用，对于伤后感染来说治疗显得很棘手，因此如何消除生物膜在抗菌治疗中显得尤为重要。
本文就从铜绿假单胞菌生物膜的定义、特性及目前治疗进展方面进行综述，进而为创伤后感染的治疗提供新方法。
关键词：创伤；铜绿假单胞菌；生物膜及其特性；治疗进展Abstract：Pseudomons aeruginosa infection is common after trauma and hard for treatment.The study about Pseudomons aeruginosa，in recent years，found that it has obvious effect on drug resistence to injury and the treatment after infection is very difficult in the biological membrane.so it is particularly important to eliminate the biofilm in antimicrobial therapy.This paper reviewed the definition，from Pseudomons aeruginosa biofilm characteristics andcurrent treatment progress，and provide new methods for the treatment of traumatic infection.Key words：Trauma；Pseudomons aeruginosa；Biologicalmembrane and properties；Progress of treatment 1创伤后铜绿假单胞菌的特性及其生物膜的临床意义铜绿假单胞菌原名绿脓杆菌，革兰阴性杆菌，是院内最严重的条件致病菌之一[1]，致病因子包括：TypeⅢ分泌系统、鞭毛、菌毛、脂多糖等，其耐药性包括产生抗菌活性酶、改变抗菌药物作用靶点、外通透性改变、主动泵出系统及生物膜形成等。
《大环内酯类药物的抗菌外作用与临床应用专家共识》要点
《大环内酯类药物的抗菌外作用与临床应用专家共识》要点大环内酯类药物是具有大环内酯环基本结构的一类药物，代表性药物为红霉素，自1952年发现并应用到临床以来，在抗感染领域发挥了重要的作用，并且具有抗菌外作用。
其抗菌外作用包括了对细菌的作用、对炎症和免疫细胞的调节作用、对机体的其他作用以及其他不明机制的作用。
越来越多的基础和临床研究结果表明，大环内酯类药物的抗菌外作用在慢性呼吸疾病的治疗中具有重要或潜在的价值。
于大环内酯类抗菌药物抗菌外作用和应用价值尚有诸多有待深入研究的地方，期待我国学者予以关注，结合我国实际情况开展基础和临床研究，特别是多中心协作研究，以提高我国在该领域的临床应用和研究水平。
一、大环内酯类药物概述大环内酯类家族根据其功能可分为4类：(1)大环内酯类抗生素；(2)酮内酯类抗菌药：结构类似于大环内酯类抗生素，通常用于治疗对大环内酯类抗生素耐药菌引起的呼吸道感染，主要有泰利霉素、塞红霉素、螺旋霉素(用于弓形虫病)等；(3)非抗菌性大环内酯类：如他克莫司、吡美莫司和西罗莫司，用作免疫抑制剂或免疫调节剂，与环孢素作用相似；(4)毒性大环内酯类，是由细菌产生的毒性产物，主要用于分枝杆菌的治疗。
大环内酯类的抗菌活性主要是通过两种机制来抑制细菌蛋白质的合成。
第一种机制是大环内酯类不可逆地结合细菌核糖体50S亚基上，阻断转肽位移作用。
第二种机制是使肽酰tRNA在肽键延长阶段较早地从核糖体上解离。
环内酯类抗生素常用于治疗肺炎链球菌等革兰阳性菌及流感嗜血杆菌等引起的呼吸道感染和软组织感染。
大环内酯类抗生素对嗜肺军团菌、支原体、非典型性分枝杆菌、幽门螺杆菌（克拉霉素）、及部分立克次体也有效。
二、大环内酯类的抗菌外作用及其机制（一）抗炎效应1. 细胞因子：2. 黏附分子：3. 炎性细胞：4. 气道上皮细胞：5. 血管内皮细胞：（二）调节气道分泌1. 调节离子转运：2. 黏液分泌：（三）免疫调节相关抗微生物效应1. 抑制微生物黏附：2. 阻断毒性因子：3. 抑制生物膜形成：4. 抑制细菌群体效应：（四）激素节省效应（五）抗病毒效应三、抗菌外作用的临床应用（一）弥漫性泛细支气管炎（DPB）1. DPB是存在于两肺细支气管和呼吸性细支气管的一种气道慢性炎症性疾病。
大环内酯类药物治疗铜绿假单胞菌慢性感染机制的研究进展
大环内酯类药物治疗铜绿假单胞菌慢性感染机制的研究进展【摘要】近年来大量研究表明长期应用大环内酯类药物或大环内酯类药物与其它抗生素联用均能有效控制铜绿假单胞菌所致的慢性感染。
大环内酯类在治疗铜绿假单胞菌慢性感染方面主要具有：①抑制铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的产生；②影响铜绿假单胞菌III型分泌系统，减少毒力因子的产生；③破坏铜绿假单胞菌表而结构，抑制细菌对宿主的黏附；④抑制细菌QS系统，减少自身信号诱导分子的合成；⑤增加炎症细胞聚集，减少炎性细胞调亡，对抗机体的炎症反应；⑥增加呼吸道痰液的清除，降低痰液粘稠度；⑦对铜绿假单胞菌具有暴露时间依从性杀菌活性等方面的功能，能最终达到对铜绿假单胞菌慢性感染的有效控制。
【关键词】大环内酯类；铜绿假单胞菌；感染ABSTRACT Recent years, plenty of experiments have demonstrated that long term use of macrolide or combined with other antibioticstherapy in chronic Pseudomonas aeruginosa infections have hadpositive results. The mechanisms of macrolides to chronic Pseudomonas aeruginosa infections is likely attributable to seven predominanteffects:① inhibition of production of Pseudomonas aeruginosaalginate and exopolysaccharide;②modulation of bacterial type III secretion, reduction of bacterial virulence factors; ©impairingbacterial cell surface structures and surpressing adherence to hostcells;④inhibition of quorum sensing in Pseudomonas aeruginosa,reduction of quorum sensing signal molecule synthesis; ©increasing inflammatory cell collection, reduction of inflammatory cellapoptosis;⑥suppressing sputum production, decreasing viscosity and improving sputum clearance, and ⑦exposuring time dependent killing Pseudomonas aeruginosa acticity.KEY WORDS Macrolide; Pseudomonas aeruginosa; Infection1大环内酯类药物对铜绿假单胞菌藻酸盐和表多糖的影响生物膜的形成是一个动态的过程，包括细菌黏附、微菌落的形成和细胞外多聚基质的包裹等三个过程。
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大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的作用彭 程 肖永红[摘要] 目的:研究大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜的影响。
方法:用高分子膜片制备铜绿假单胞菌生物膜,计数滤膜菌落与扫描电镜观察,观察大环内酯类药物对铜绿假单胞菌生物膜形成前后的影响及对已形成生物膜的清除作用。
结果: 2mg/L阿奇霉素、2mg/L红霉素可抑制生物膜的形成,生物膜菌落计数由对照10.0×109cfu/cm2,分别降至1.9×103cfu/ cm2、5.0×103cfu/cm2。
麦迪霉素作用不明显;单用阿奇霉素、红霉素及麦迪霉素不能清除已形成的生物膜,但阿奇霉素、红霉素与环丙沙星协同作用,可使已形成生物膜中细菌下降至0.9%～2.2%。
电镜观察与上述结果一致。
结论:红霉素、阿奇霉素能抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,增强环丙沙星对生物膜的渗透性,增强其杀灭生物膜内细菌的作用,清除生物膜;麦迪霉素对生物膜的形成及清除均无影响。
[关键词] 大环内酯类药物; 铜绿假单胞菌; 生物膜中图分类号:R978.1+5 文献标识码:A 文章编号:1009-7708(2001)01-0007-03Effects of macrolides on Pseudomonas aeru ginosa biofilmsPENG Cheng,X IAO Yong-hong(Department of In fectious Diseases,the First A ffiliated Hospital, Chongqing U niversity of Medical Scienc es Chongqing 400016,China)[Abstract]Purpose:T o investig ate the effects of macrolides on Pseudomonasmol aeruginosa biofilms.Methods:Pseudomonas aerugi-nos a bio film was prepared using high malecular membrane,the number of colonies in biofilm were counted,then observed by scanning electron microscopy.Results:The number of colonies in biofilms w ere reduced from10×109cfu/cm2in co ntrolled biofilmm to1.9×103cfu/cm2treated with2mg/L azithromycin,and to5.0×103cfu/cm2treated with2mg/L ery thromycin.T he number of colonies in biofilms treated with azithromy cin,ery thromy cin or medemycin alone had no significant effect on biofilm,however w hen treated w ith azithromycin or erythromycin in combination with ciproflo xacin,the number of colonies decreased to0.9%-2.2%of the orig i-nal.N o sig nificant change was observed when medemycin combined with ciprofloxacin.Similar results were obtained when observed w ith scanning electron microcopy conclusions.C onclusions:T hese results indicate that azithromy cin and erythromycin can inhibit the formation of biofilm by P.aerugino sa;enhance the bactericidal actio n of ciproflox acin on bacteria within the bio film.M idecamycin has no such effect.[Key words] M acrolides; Ps eudomonas aeruginos a; Biofilm 生物膜(biofilm,BF)是一种膜样结构,是由细菌通过胞外多糖复合物或(和)纤毛共同作用粘附在生物材料或人体组织表面,不断分裂繁殖,分泌大量胞外多糖复合物(主要成分为藻酸盐)而共同形成的。
由于BF内细菌代谢、繁殖缓慢,其对抗生素不敏感;BF基质胞外多糖通过吸附与机械阻滞抗生素分子进入BF;BF表层细菌被杀灭后,释放出抗生素灭活酶,如β内酰胺在体内不易被人体的免疫系统清除等[1～3],使BF清除十分困难,常致顽固性感染。
能形成BF的细菌主要有铜绿假单胞菌、克雷伯菌属、肠杆菌属、沙雷菌属、肺炎链球菌、葡萄球菌属等,相关感染尤以铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌多见。
本工作通过菌落计数测定铜绿假单胞菌BF 作者单位:400016重庆医科大学附属第一医院感染科中细菌量及扫描电镜观察BF的变化来研究大环内酯类药物对BF形成的影响及对BF的清除作用。
材料与方法一、药物红霉素(ery thromy cin,EM)标准品购于重庆市药品检测所,阿奇霉素(azithromy cin,AZ)为山东齐鲁制药厂产品,麦迪霉素(midecamy cin,MDM)为日本明治制药厂产品,环丙沙星(ciprofloxacin,CPFX)为重庆制药六厂产品。
二、培养基与菌株所用培养基为Mueller-Hinton肉汤(MHB)与Mueller-Hinton琼脂(MHA),菌株为粘液型铜绿假单胞菌(编号970558-26),为本院临床分离。
三、抗生素对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度(M IC)的测定采用试管二倍稀释法稀释,测定上述药物对铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度M IC值。
四、铜绿假单胞菌BF的制备按文献[4]方法,将隔夜培养的铜绿假单胞菌调制菌液浓度至0.1×106cfu/ml,取0.25ml加入5 ml MHB中,同时加入已高温蒸气灭菌的聚碳酸酯膜片(0.2μm孔径,购于Sigma公司)或硅胶片(两种膜片均用打孔器制成直径0.7cm的圆片),置于37℃下孵育24h,即得已形成BF的膜片。
五、铜绿假单胞菌BF细菌计数已形成BF的聚碳酸酯膜片用无菌生理盐水1 ml冲洗游离菌后,放入3ml无菌生理盐水中,用匀浆器(ZS83-1型,浙江机械厂)粉碎后,用连续稀释法进行菌落计数,制备生物膜同时加入不同抗菌药物以观察药物对生物膜形成的抑制作用。
实验重复3次,计算平均值,以不加药物所形成的BF为对照[4]。
已形成BF的硅胶片用无菌生理盐水1ml冲洗游离菌后,放入5ml MHB中(其中分别含有1/16 M IC大环内酯类药物、3M IC环丙沙星或两类药的两两组合),置于37℃下孵育,每隔1h取出1枚硅胶片,冲洗后,放入3ml无菌生理盐水中,用涡漩振荡器充分振荡3min后,用连续稀释法进行菌落计数,以不加药物MHB中BF的变化为对照[5],观察药物对BF的清除作用。
六、扫描电镜观察BF以聚丙烯酰胺膜片(0.2μm孔径,北京化工学校附属工厂,制成面积0.7cm2的方片)按上述方法制备BF标本,以生理盐水冲洗掉表面游离菌后,置于2.5%戊二醛中,4℃前固定2h,再用1%四氧化锇后固定30min,脱水、置换、干燥、喷金,通过扫描电镜观察BF形态。
以上述细菌计数法,在生物膜制备的不同阶段加入抗菌药物,观察药物对生物膜形成的抑制与清除作用。
结 果一、抗生素对铜绿假单胞菌的MIC值各种抗生素对铜绿假单胞菌970558-26的M IC值分别为,EM32mg/L,AZ32mg/L,M DM 512mg/L,CPFX0.0625mg/L。
二、大环内酯类药物对铜绿假单胞菌BF形成的抑制作用1/16M IC EM(2mg/L)及AZ(2mg/L)能显著抑制BF的形成,而1/16M IC M DM(32mg/L)对BF形成无确切影响;与无药对照菌落数10×109 cfu/cm2比较,三者所得菌落数分别为1.99×103、5.01×103与7.94×109cfu/cm2。
由图1及图2可见,扫描电镜图像结果与菌落计数一致。
图1 未加药形成的铜绿假单胞菌BF大量的细菌粘附在膜片上,呈凹凸不平的网状,菌体典型,细菌外被较多的粘液状物质(×2500)图2 1/16M IC AZ对铜绿假单胞菌BF形成的影响细菌(→)少见,散在分布于膜片(■)上,未见粘液状物质(×3040)三、大环内酯类药物对铜绿假单胞菌BF的清除作用单用1/16MIC大环内酯类药物或是3M IC-CPFX对已形成的铜绿假单胞菌BF清除作用不明显。
但1/16M IC EM或AZ与3M IC CPFX联用后对已形成的铜绿假单胞菌BF有明显的清除作用,而MDM与CPFX联用后作用不明显(表1,图3)。
表1 大环内酯类药物与环丙沙星联用对铜绿假单胞菌BF的清除作用药 物＊BF菌量改变(%)0h1h2h3h4h5h无药对照10099.787.575.0110.5117.0阿奇霉素/环丙沙星10022.48.53.41.20.9红霉素/环丙沙星10037.610.24.82.52.2麦迪霉素/环丙沙星100107.095.3106.077.654.1 ＊大环内酯类药物浓度为1/16M IC,环丙沙星浓度为3M IC图3 3M IC CPFX合用1/16M IC AZ对已形成的铜绿假单胞菌BF的影响药物与BF作用5h;残留细菌相互连接成稀疏的网状结构(→),可见少量块状或丝状的粘液物质 (×200)讨 论本研究中,1/16MIC AZ(2m g/L)、EM(2mg/ L)可使铜绿假单胞菌BF菌落计数由对照组10.0×109cfu/cm2降为1.9×103cfu/cm2、5.0×103cfu/ cm2预先制备的BF置入含有1/16M IC大环丙酯类药物或3M IC CPFX中孵育5h,BF菌落计数为用药前的79.4%～158.5%,3M IC CPFX和1/16 M IC的AZ或EM联用作用则可使其菌量下降至0.9%和2.2%,为单用3M IC CPFX的1.0%和2.5%。