第三章+细胞融合与单克隆抗体

2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一 营养互补筛选系统： 营养互补筛选系统 种或几种营养成分时，不能生长繁殖， 种或几种营养成分时，不能生长繁殖， 即营养缺陷型细胞。 即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细 胞营养互补作用原理可以筛选杂种细 胞。 亲本A 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸 的培养基上培养，而亲本细胞均会死 的培养基上培养， 亡。
动物细胞的筛选方式：
1）利用抗药性筛选系统：利用生物细 利用抗药性筛选系统： 利用抗药性筛选系统 胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 胞对药物敏感性差异筛选杂种细胞。 亲本A 对氨苄青霉素敏感， 亲本A：对氨苄青霉素敏感，对卡娜霉 素不敏感 亲本B 对卡娜霉素敏感， 亲本B：对卡娜霉素敏感，对氨苄青霉 素不敏感 杂种细胞可以在含有两种抗生素的培 养基上Cell Fusion and Monoclonal Antibodies
6.1细胞融合 6.2杂种细胞的遗传 特性和应用 6.3淋巴细胞杂交瘤 和单克隆抗体技术
6.1细胞融合
6.1.1细胞融合概念 6.1.2人工诱导融合及其机制 6.1.3杂种细胞的筛选
6.1.1 细胞融合
甜菜原生质体电融合过程
A 在高频电流电场 下的相互接触。 B 脉冲刺激后30s C 50秒后 E 1.5分钟后 F 6分钟后 G 15分钟后，原生 质体融合完成。
电融合优点： 电融合优点：
融合率高， 70％－80％，甚至100％ 融合率高，达70％－80％，甚至100％ ％－80％，甚至100 融合率＝（融合组多核细胞的核数－ ＝（融合组多核细胞的核数 融合率＝（融合组多核细胞的核数－对 照组多核细胞的核数/对照组的全部细 照组多核细胞的核数/ 胞数） 100％ 胞数）×100％ 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞
6.1.2.2 细胞电融合
原理： 原理：
使细胞在正弦电场下 极化成偶极子， 极化成偶极子，并向 两极靠近； 两极靠近；在向两极 靠近的过程中， 靠近的过程中，有些 细胞彼此吸引连接在 一起， 一起，成串排列在两 极之间；然后， 极之间；然后，施加 以高强度、 以高强度、短时程的 电波刺激， 电波刺激，把相互连 接的两个或更多细胞 的质膜击穿而导致细 胞融合。 胞融合。
可以直接转入培养
6.1.2.3 细胞融合机制
细胞凝集→质膜融合 胞质融合→细胞核融合 细胞凝集 质膜融合→ 胞质融合 细胞核融合 质膜融合
6.1.3 杂种细胞的筛选
原理： 原理：两种亲本细胞融合的 混合物中可能有多种类型细 胞，筛选的目的是获得优良 的杂种细胞。 的杂种细胞
植物细胞筛选方式
1）遗传互补筛选法：利用每一亲本贡献一个 遗传互补筛选法： 遗传互补筛选法 功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷， 功能正常等位基因，纠正另一亲本的缺陷， 令杂种细胞表现正常。 令杂种细胞表现正常。 如亲本1 如亲本1：叶绿体缺陷型 亲本2 亲本2：光致死型 两亲本在光照下一种死亡， 两亲本在光照下一种死亡，另一种呈白 融合细胞长成植株呈绿色， 色，融合细胞长成植株呈绿色，并能成长
4）利用生长特性筛选法：利用原生质 利用生长特性筛选法： 利用生长特性筛选法 体对培养基成分要求与反应的差异选 择杂种细胞。 择杂种细胞。 例如粉兰烟草与朗氏烟草细胞原生质 体均需外源激素才能生长， 体均需外源激素才能生长，但其融合 细胞可以产生内源激素， 细胞可以产生内源激素，在培养基上 不需加激素。 不需加激素。
6.2 杂种细胞的遗传特性和应用 6.2.1杂种细胞在细胞生物学研究 杂种细胞在细胞生物学研究 中的应用 6.2.2杂种细胞在植物育种中的应用 杂种细胞在植物育种中的应用
6.2.1 杂种细胞在细胞生物学研究中的应 用
1）基因定位 不同种属的细胞融合时， 不同种属的细胞融合时，常会出现一个亲本细 胞的染色体被优先排除， 胞的染色体被优先排除，而另一个亲本的染色 体被选择性留下， 染色体分离的现象 由此， 的现象。 体被选择性留下，即染色体分离的现象。由此， 可根据表型和与表型特征相对应的基因在特定 染色体上。 染色体上。 人细胞与TK 例如 ：HGPRT－人细胞与TK－的小鼠细胞融合 可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E HAT培养基分离得到一种仅含一条人 后，可用HAT培养基分离得到一种仅含一条人E 组染色体的杂种细胞，具有TK活性， TK活性 组染色体的杂种细胞，具有TK活性，由此得到 人的TK基因是在E组染色体上的。 TK基因是在 人的TK基因是在E组染色体上的。
2）遗传缺陷的基因互补 基于杂种细胞的基因互补作用， 基于杂种细胞的基因互补作用，可分为基 因间和基因内的互补作用， 因间和基因内的互补作用，即杂种细胞可 以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。 以具有两种亲本在遗传上缺陷的基因表型。 通过这种基因互补， 通过这种基因互补，可以用正常基因来治 疗由于基因突变或基因缺失的疾病。 疗由于基因突变或基因缺失的疾病。
单抗的制备过程
动物免疫与亲本细胞的选 择 细胞融合：淋巴细胞杂交 细胞融合： 瘤的制备 杂交瘤细胞的筛选： 杂交瘤细胞的筛选：有限 稀释法等 单克隆抗体的制备和冻存 单克隆抗体的纯化
亲本细胞的选择
骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体， 骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁 殖和连续继代培养，且为HPRT 殖和连续继代培养，且为HPRT－或TK－。多用 小鼠的骨髓瘤细胞。 BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。
6.1.2 人工诱导细胞融合
病毒诱导细胞融合 疱疹病毒、牛痘病毒和副粘液病毒 化学方法诱导细胞融合 物理方法诱导细胞融合
6.1.2.1 聚乙二醇（PEG）介导的细胞融 聚乙二醇（PEG） 合
原理：PEG带有大量的 原理：PEG带有大量的 负电荷, 负电荷,和原生质体表 面的负电荷在钙离子 的连接下， 的连接下，形成静电 键，促使异源的原生 质体间的粘着和结合， 质体间的粘着和结合， 在高pH, pH,高钙离子的溶 在高pH,高钙离子的溶 液的作用下， 液的作用下，将钙离 子和与质膜结合的PEG 子和与质膜结合的PEG 分子洗脱， 分子洗脱，导致电荷 平衡失调并重新分配， 平衡失调并重新分配， 使两种原生质体上的 正负电荷连接起来， 正负电荷连接起来， 进而形成具有共同质 膜的融合体。 膜的融合体。
3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一 温度敏感突变型杂种细胞的筛选： 温度敏感突变型杂种细胞的筛选 般的培养细胞能在32度到40 32度到40度的范围内 般的培养细胞能在32度到40度的范围内 生长， 生长，但温度敏感突变型的细胞能在高 温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37 亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37 度左右生长。 度左右生长。 亲本二：高温敏感突变型， 亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡 娜霉素。 娜霉素。 杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养 基上生长。 基上生长。
淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠 淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞， 或小鼠。 或小鼠。 免疫方法：体内法或体外法。 免疫方法：体内法或体外法。 体内法： 体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠 体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂 体内， 混合乳化后，注入到动物体内。 天后， 混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无 菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液， 菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率 95％以上的可以用于融合。 在95％以上的可以用于融合。 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为10 体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107 /ml，加适当浓度抗原， 天后， 个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激 的淋巴细胞。 的淋巴细胞。
6.2.2 杂种细胞在 植物育种中的应用
杂种细胞是一条 杂种细胞是一条新的育种途 是一条新的育种途 径，可以产生新经济性状的 良种。 良种。 一些近亲植物、 一些近亲植物、有性不亲和 的组合，如马铃薯× 的组合，如马铃薯×番茄等 都得到了再生植株。 都得到了再生植株。
6.3 单克隆抗体
6.3.1抗体的结构与功能 抗体的结构与功能 6.3.2单克隆抗体的制备和生产 单克隆抗体的制备和生产 6.3.3单克隆抗体的改造和应用 单克隆抗体的改造和应用
6.3.1 抗体的结构与功能
抗体是由 抗体是由B细胞受抗 是由B 原刺激后所分泌的 蛋白质。 蛋白质。 抗体分子： 抗体分子： 由四条 肽链所组成， 肽链所组成，两条 重链（ 重链（H链）两条轻 链（L链）。 结 合 区： 抗体分 子上有两个抗原结 合区 可变区（ 可变区（V区） 稳定区（ 稳定区（C区）
图6-1 两种亲本细胞融合后得到两种同核体(AA和BB)、 一种异核体(AB)和两种未融合的亲本细胞(A和B)
6.1.1 细胞融合
细胞杂交(cell hybridization)特指用人工方法把 细胞杂交(cell hybridization)特指用人工方法把 不同类型的两个或两个以上细胞合并成一个细胞 的技术。 的技术。细胞杂交所得到的融合细胞叫杂交细胞 (hybrid cell)或细胞杂交体(cell hybrid) 。 cell)或细胞杂交体 或细胞杂交体(cell 种内杂交细胞 种间杂交细胞
2）抗性互补筛选法：利用亲本细胞 抗性互补筛选法： 抗性互补筛选法 原生质体对抗生素、 原生质体对抗生素、除草剂及其它有 毒物质抗性差异选择杂种细胞。 毒物质抗性差异选择杂种细胞。 如： 亲本1 对放线菌素D抗性，但在MS MS培 亲本1：对放线菌素D抗性，但在MS培 养基上不能超过50 50个世代 养基上不能超过50个世代 亲本2 对放线菌素D很敏感， 亲本2：对放线菌素D很敏感，但能在 MS上生长 MS上生长 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养 杂种细胞能在含有放线菌素的MS培养 MS 基上生长， 基上生长，而亲本和其它细胞死亡
3）利用物理特性筛选法：根据亲本 利用物理特性筛选法： 利用物理特性筛选法 的原生质体大小、颜色、 的原生质体大小、颜色、漂浮密度 及电泳迁移率、形成的愈伤组织的 及电泳迁移率、 差异筛选杂种细胞。 差异筛选杂种细胞。 亲本1 亲本1：用异硫氰酸荧光素染色原 生质体 亲本2 亲本2：叶肉细胞原生质体 在荧光显微镜下，亲本1为红色， 在荧光显微镜下，亲本1为红色， 亲本2为绿色， 亲本2为绿色，杂种细胞可以区分