动物细胞融合和单克隆抗体(公开课)

思考讨论：为什么细胞融合过程中使用的 思考讨论： 病毒需要灭活？不灭活行吗？ 病毒需要灭活？不灭活行吗？
因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分子和脂 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合， 质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合，不灭 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。 活的话会感染细胞，而不能诱导细胞融合。
一、动物细胞融合
1、定义：指用自然或人工方 定义： 法使两个或多个不同的细胞 融合成一个细胞的过程。 融合成一个细胞的过程。 细胞杂交： ◆细胞杂交：不同基因型的细 胞之间的融合就是细胞杂交。 胞之间的融合就是细胞杂交。 杂交细胞： ◆杂交细胞：融合后形成的具 有原来两个或多个细胞遗传 有原来两个或多个细胞遗传 信息的单核细胞成为杂交细 信息的单核细胞成为杂交细 胞。
将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能 骨髓瘤细胞融合在一起 力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。 力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交 瘤细胞既能在体外快速生长， 瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一 的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原 的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原 决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。 • 米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝 米尔斯坦(阿根廷)和科勒(德国)因此在1984年获诺贝 1984 尔奖。 尔奖。
• 化学法：聚乙二醇PEG诱导融 化学法：聚乙二醇PEG诱导融 PEG 合. • 物理法：电激融合 物理法：电激融合
细胞膜连接
细胞融合、 细胞融合、形成杂种细胞
3、动物细胞融合技术的应用
• 细胞融合技术突破了有性杂交的局限，使 细胞融合技术突破了有性杂交的局限， 远缘杂交成为可能。 远缘杂交成为可能。 • 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。 利用杂交瘤技术，制备单克隆抗体。
5.
第二次筛选： 第二次筛选：在“多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 ，每 多孔培养板上”培养杂交瘤细胞系列 孔只放一个杂交瘤细胞。 克隆化培养”每个杂交瘤细胞， 孔只放一个杂交瘤细胞。“克隆化培养”每个杂交瘤细胞，并 进行“单一抗体检测” 检测阳性” 进行“单一抗体检测”，“检测阳性”的孔内即是所需要的杂 交瘤细胞。 交瘤细胞。
下图为某同学根据杂交瘤技术的方法， 下图为某同学根据杂交瘤技术的方法，设计的生产破伤 风杆菌单克隆抗体的实验方案 A 骨髓瘤细胞 1、该实验方案的目的是__________ 、该实验方案的目的是 制备单克隆抗体 2、该方案能达到预期效果吗？为什么？ 、该方案能达到预期效果吗？为什么？ B 杂交瘤细胞
2、单克隆抗体的优点： 单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，可大量制备。 特异性强，灵敏度高，可大量制备。 3、单克隆抗体的应用
• 1、作为诊断试剂 在临床生化诊断、病理组织定位、 作为诊断试剂：在临床生化诊断 病理组织定位、 作为诊断试剂 在临床生化诊断、 体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确 高效、 准确、 体内肿瘤的定位等,与常规抗体相比,具有准确、高效、 简易、快速特点 特点. 简易、快速特点 • 2、用于治疗疾病和运载药物 用于治疗疾病和运载药物： 用于治疗疾病和运载药物 • 主要用于癌症治疗。 主要用于癌症治疗。 • 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+化学 生物导弹：抗癌细胞的单克隆抗体+放射性同位素+ 药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。 。（单克隆抗体 药物或细胞毒素。（单克隆抗体：导向。准确找到癌细 胞位置，原位杀死癌细胞。） 胞位置，原位杀死癌细胞。）
• 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ 运用已学知识，设想怎样获得单一类型的抗体？ • 能否用单个B淋巴细胞通过克隆形成的细胞群来 能否用单个B 产生单一类型的抗体呢？ 产生单一类型的抗体呢？
B淋巴细胞在体外不能无限增殖。 淋巴细胞在体外不能无限增殖。
单克隆抗体的制备—极富创造性的方案 极富创造性的方案
经免疫的小鼠 经免疫的小鼠
提取
B淋巴细胞
小鼠骨髓瘤细胞
灭活的病毒等手段
杂交 细胞
用特定的选 用特定的选 择性培养基
第一次筛选
杂交瘤细胞 杂交瘤细胞 第二次筛选 能产生特定抗体、培养条ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ 能产生特定抗体、 下能无限增殖的杂交瘤细胞
注射到小鼠腹腔
体外培养
提取单克隆抗体
1. 2. 3. 4.
动物特异性免疫 ）；找到骨髓瘤细胞 ）。注意 分离B淋巴细胞（ ）；找到骨髓瘤细胞（ ）。注意B淋巴细 分离 淋巴细胞（B）；找到骨髓瘤细胞（G）。注意 淋巴细 淋巴细胞 胞是一个系列。（ 1,B2,B3,---Bn） 胞是一个系列。（B 。（ 细胞融合——三种融合方式 （BB;BG;GG） 三种融合方式:（ 细胞融合 三种融合方式 ） 第一次筛选： 第一次筛选：在“选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞 选择培养基培养”上培养筛选杂交瘤细胞 杂交瘤细胞存活。 杂交瘤细胞也是一个系列： （只有BG杂交瘤细胞存活。但BG杂交瘤细胞也是一个系列： 只有 杂交瘤细胞存活 杂交瘤细胞也是一个系列 如B1G,B2G---BnG。而BB,GG在此培养基上不能存活。） 在此培养基上不能存活。） 。 在此培养基上不能存活
总结： 总结：比较植物体细胞杂交和动物细胞融合
比较项目 植物体细胞杂交 细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性、 植物细胞的全能性 用纤维素酶、 用纤维素酶、 果胶酶去壁 物理、化学方法 物理、 获得部分 或完整植株 动物细胞融合
原
理
细胞膜的流动性 用胰蛋白酶 使细胞分散 物理、化学、 物理、化学、 生物方法 主要用于制备 单克隆抗体
细胞融合是正常的生命活动
受精作用
两个细胞正在融合
二.动物细胞融合 动物细胞融合
2、诱导融合的因素 诱导融合的因素
• 生物法：灭活的病毒诱导融 生物法：灭活的病毒诱导融 合.(利用灭活仙台病毒是动物细
胞融合所特有的。 胞融合所特有的。 这是由于病毒 的磷脂外衣与动物细胞的膜十分 相似的缘故。 相似的缘故。病毒外壳上的某些 糖蛋白可能还有促进细胞融合的 功能。 功能。) 细胞膜被 病毒颗粒穿通 病毒颗粒黏 附细胞表面
6. 7.
选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔 选择所需要的杂交瘤克隆细胞群，体外培养或注射到小鼠腹腔 或注射到 内增殖。 内增殖。
1、单抗的制备过程要点： 、单抗的制备过程要点：
提取单克隆抗体。 提取单克隆抗体。
问题强化： 问题强化：
1）、本过程利用了哪些原理？ ）、本过程利用了哪些原理？ 本过程利用了哪些原理 免疫原理，细胞融合原理和动物细胞培养原理 免疫原理， 2）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ ）、为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与B细胞融合？ 为什么选用小鼠骨髓瘤细胞与 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质， 这样融合成的杂交瘤细胞，继承了双亲细胞的遗传物质， 不仅具有B细胞分泌抗体的能力， 不仅具有B细胞分泌抗体的能力，而且还有无限增殖的 本领， 本领，因而可以获得大量单克隆抗体 3）、为何要进行两次筛选？ ）、为何要进行两次筛选？ 为何要进行两次筛选 第1次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第2次筛选得 次筛选得到杂交瘤细胞（多种）。第 ）。 到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。 到能产生特异性抗体的杂交瘤细胞群。 4）、如何进行第2次筛选？ ）、如何进行第2次筛选？ 如何进行第 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。 培养在多孔培养板上，每孔只有一个杂交瘤细胞。
C 3、A是从小鼠的脾脏中取得 、 是从小鼠的脾脏中取得 _______,该细胞能够产生 抗体 B细胞 该细胞能够产生______ B细胞 该细胞能够产生 足够数量的细胞群 4、图中 为________过程，常用 过程， 、图中B为 细胞融合过程 灭活病毒 作为诱导剂，该细胞继 _________作为诱导剂 作为诱导剂， 双亲细胞 的遗传特性 的遗传特性， 承___________的遗传特性，既能 分泌抗体 又能 无限增殖 。 体外培养 注射到 __________,又能 又能___________。 小鼠腹腔 5、C过程指细胞培养，该过程包括 过程指细胞培养， 、 过程指细胞培养 原代 培养和 传代培养两个阶段，其 _____培养和 培养和_____培养两个阶段 培养两个阶段， 50 代以内的的细胞属于细胞株 代以内的的细胞属于细胞株。 中_____代以内的的细胞属于细胞株。
融合前处理 诱 导方法
用
途
思 考
二：动物细胞融合的成功应用 ——单克隆抗体的制备 单克隆抗体的制备
• 人们获得抗体的传统方法是? 人们获得抗体的传统方法是?
–将抗原注入动物体,然后从动物血清中提取抗体 将抗原注入动物体, 将抗原注入动物体
• 这种方法的缺点是什么? 这种方法的缺点是什么?
–效率低，产量有限，纯度低，动物抗体注入人体可 效率低，产量有限，纯度低， 效率低 能产生严重的过敏反应。 能产生严重的过敏反应。