辛酸硫酸铵纯化方法
辛酸_硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用_陈丹
５ 结束语 脂质筏结构被人们认识以来， 其确切的生理功能仍然
ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｕｂｄｏｍａｉｎｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ， １９９２， ６８（ ３） ： ５３３－ ５４４． ［７］ ＢＲＯＷＮ Ｄ Ａ， ＬＯＮＤＯＮ Ｅ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ
［９］ ＤＡＮＩＥＬＳＥＮ Ｅ Ｍ．Ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔｓ ｉｎ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｂｒｕｓｈ ｂｏｒｄｅｒｓ： ａｔｙｐｉｃａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｉｃｒｏｄｏｍａｉｎｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１７（ １－ ２） ： １－ ９．
［１３］ 杨 福 愉 ．生 物 膜 结 构 研 究 的 一 些 进 展［Ｊ］．生 物 化 学 与 生 物 物 理 进
有待大量研究， 特别是对质膜微囊和脂筏介导的内吞途径
ａｎｄ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ－ ｒｉｃｈ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｒａｆｔｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ， ２０００， ２７５（ ２３） ：
的分子细节了解， 而脂筏与微生物相互作用为这方面的研 究提供了一个非常好的实验模型。通过对病原微生物如何
１７２２１－ １７２２４． ［８］ ＳＩＬＶＩＵＳ Ｊ Ｒ．Ｒｏｌｅ ｏｆ ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ ｉｎ ｌｉｐｉｄ ｒａｆｔ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ： ｌｅｓｓｏｎｓ
ｆｒｏｍ ｌｉｐｉｄ ｍｏｄｅｌ ｓｙｓｔｅｍｓ ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ， ２００３， １６１０（ ２） ：
利用脂筏介导其内吞及内吞入胞后在胞内的转运的研究，
硫酸铵的生产工艺
硫酸铵的生产工艺
硫酸铵是一种常用的氮肥，其生产工艺主要包括硫酸法和铵洗法两种方法。
下面是硫酸铵的生产工艺的详细介绍：
硫酸法生产工艺：
1. 原材料准备：工业级纯化铵、浓硫酸、冷却水。
2. 将适量的浓硫酸注入反应釜中，同时开始加热，并保持密封状态。
3. 当温度达到一定值时，将预先称量好的工业级纯化铵缓慢地加入反应釜中，并同时进行搅拌。
4. 反应进行时，系统不断释放出大量的热量，因此需要冷却水来控制反应温度。
5. 反应进行到一定程度后，停止加入铵盐，继续搅拌反应一段时间。
6. 当反应结束后，将反应釜中的产物冷却，使其结晶。
7. 结晶完成后，将产物分离并进行干燥，得到硫酸铵成品。
铵洗法生产工艺：
1. 原材料准备：浓硫酸、氨水、冷却水。
2. 将适量的浓硫酸注入反应釜中，同时开始加热，并保持密封状态。
3. 当温度达到一定值时，将预先称量好的氨水缓慢地加入反应釜中，并同时进行搅拌。
4. 反应进行时，系统不断释放出大量的热量，因此需要冷却水来控制反应温度。
5. 反应进行到一定程度后，停止加入氨水，继续搅拌反应一段时间。
6. 当反应结束后，将反应釜中的产物冷却，使其结晶。
7. 结晶完成后，将产物分离并进行干燥，得到硫酸铵成品。
以上是硫酸铵的两种常用生产工艺，其中硫酸法和铵洗法均是在硫酸的存在下，通过反应得到硫酸铵的。
在反应过程中，由于系统释放大量热量，因此需要进行冷却来控制反应温度。
最后，通过结晶和干燥等工艺步骤，得到硫酸铵的成品。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
两种方法纯化兔抗绵羊肺炎支原体IgG的比较
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免 疫球 蛋 白尤其 ＩＧ现 己广 泛 率 ， 白质含量等方面 比较这两种纯 ｍ ） ｓ —ｃ 一１ ｇ 蛋 ａ ；ｗ Ｊ Ｆ超净工作台 （ 苏州净 化 方 法 的提 纯 效 果 ， ］ 旨在 为 抗 体 纯 化 设 备 有 限 公 司 ） Ａ １０电 子 天 平 ；Ｒ ４ 应用于生命科学的许多领域 ， 别是 特 在 医学诊 断和基础 研究 中起 着越 来 化提供一种简便实用的方法 。 （ 国 Ｏ Ａ Ｓ公 司） Ｕ ２ ０ 美 ＨＵ ；Ｖ ０ ０型 分 光 光 越重要的作用 。 随着人们对免疫球蛋 １ 材料与方法 度计 （ 尤尼 柯 （ 上海） 器有限公 司） 仪 ； 白性质 认识 的深 入 以及 蛋 白质检 测 １１ 材 料 ． ６１ ８ 型磁力加热搅拌器 （ 上海南汇 电 技术的发展 ， 免疫球 蛋 白纯化技术也 １ １１ 主要试剂 ．． 讯器材厂） ＤＹ ５型 电泳仪 （ ；Ｙ 一 北京六 在不断改进 。ＩＧ主要来源于血清和 ｇ 琼脂粉 （ｏ ａ ｂ ｏ Ｓ ｌｒ ｉ 批号 ０ ０ １） ６８５； 仪 器厂 ）Ｋ ｄ ｋ １ 胶 成像 系统 ；ｏ ａ Ｄ凝 Ｋ ｄ ｋ公 。 动物的腹水 ， 常常在不 同程度上混杂 正辛酸 （ 成都科龙化 工试剂厂 批 号 （ｏ ａ 司 ） ０６２１； 天津市 化学试 剂 １１ ３ 实验 动物 ．． 非抗体蛋 白和脂类物 质 ， 以为消 除 ２０ １０） 硫 酸铵 （ 所 ０ ６ ６８ ； Ｓ— ９ ０日龄健康 日本大耳 白兔 （ 清洁 干扰， 必须对其进行纯化 。 在提纯 ｌＧ 三 厂 批 号 ２ ０ ０ ２） 丙烯 酰胺 （ｏ ｇ 过程 中， 不但要保 证除去绝大 多数杂 ｌｒ ｉ 批 号 ０ ０ １） ＮＮ ａｂｏ ７ ６ １ ； ，一亚 甲基 双 级 ， 北京兴隆实验动物饲养厂） 。 蛋 白而且 不影响 ＩＧ生物活性 ， 就 丙烯酰胺 （ｏ ａ ｂ ｏ批号 ０ ０ １） １ ２ 方 法 ｇ 这 Ｓ ｌｒ ｉ ７ ２６ ； ． 需 要一种 好 的硫 酸铵 法提 纯兔 抗 绵 Ｅ Ｔ （ｏａ ｂ ｏ 批 号 ０ ０ １） Ｄ Ａ Ｓ ｌｒ ｉ ７９ 。 １ １２ １ 兔抗 绵羊肺 炎支原体 ＩＧ血 ．． ｇ 羊肺炎支原体 ＩＧ ｇ ，并从纯度，回收 １ １２ 主 要 仪 器 ．． 清 的制 备 按照裴艳涛 嘲 的免疫程序对兔子 透 析 袋 （ｏ ａ ｂ ｏ ；Ｄ 一 ５Ｂ台 Ｓ ｌ ｒ ｉ ）Ｔ Ｌ ０ 山 西 省 科 技 攻 关 项 目 资 助 ． 项 目 编 号 ： 式离 心机 （ 海安 亭科 学 仪器 厂） 进 行 免 疫 ， 体 效 价 合 格 后 无 菌 采 集 上 ； 抗 ２ ０ ０ １ ５ —１ Ｏ ６ ３ ８ ０ ３３ Ｋ ０型高速冷冻 离心机 离心机 （ｉ— 血 液 １ｍ ， 置 ３ ℃ 作 用 １ ，再 经 Ｓ ｇ ０Ｌ ７ ｈ
单克隆抗体制备实验过程
单克隆抗体制备实验过程一、免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。
一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。
抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B 淋巴细胞。
说明：FCA，弗氏完全佐剂；FIA，弗氏不完全佐剂；Quickantibody，北京康碧泉公司研制的佐剂。
上表中第四种免疫方法产生的抗体大部份都为IgM，存在亲和力弱等缺点，慎用。
PS：1、一般皮下注射每个注射点注射30-50ul左右混有佐剂的抗原，每只小鼠注射6-8个点为宜。
2、腹腔注射时，如果抗原混有弗氏佐剂，建议注射在左侧腹腔，如果采用右侧腹腔注射，则在免疫过程中，很容易导致小鼠脾脏与腹膜粘连的情况，造成后期取出脾脏麻烦。
3、冲击免疫完成后，应在96小时内完成细胞融合，否则相应的B细胞数量会下降到未冲击前的水平。
二、细胞融合（Cell fusion）【材料和试剂】（1）骨髓瘤细胞悬液选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞，制备细胞悬液。
（2）免疫小鼠脾细胞悬液取3天前加强免疫的小鼠，眼眶放血，•分离血清冻存备用。
拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精中3～5min。
无菌操作取出脾脏，置入盛有5ml不完全培养液的平皿中洗涤，剪去周围的结缔组织，将脾脏移入另一盛有5ml不完全培养液的平皿中的钢网上，先用剪刀剪成3～5个小块，然后用注射器内芯研磨。
将脾脏细胞悬液移至50ml离心管中，加不完全培养液50ml，1000r/min 离心5min，弃上清，再以同法洗涤离心一次。
然后将沉淀细胞重新悬浮于10ml不完全培养液中，计活细胞数，一般一只小鼠可得0.5～2×108个脾细胞。
（3）饲养细胞将小鼠致死、体表消毒和固定后，用消毒剪镊从后腹掀起腹部皮肤，暴露腹膜。
用酒精棉球擦拭腹膜消毒。
用注射器注射10ml不完全培养基至腹腔，注意避免穿入肠管。
硫酸铵工艺流程作用
硫酸铵工艺流程作用
硫酸铵的工艺流程主要包括硫酸铵的制备和纯化两个步骤，作用如下：
1. 硫酸铵制备：通过反应将硫酸与氨气在适当的温度和压力下反应生成硫酸铵。
这一步骤的作用是将硫酸与氨气充分反应，生成硫酸铵孵化晶石。
反应条件的控制可以调节硫酸铵的产率和纯度。
2. 硫酸铵纯化：硫酸铵产物中可能含有一些杂质，如重金属离子、杂质盐等。
纯化步骤的作用是通过一系列的分离和纯化操作，将这些杂质去除，使得最终产品的纯度达到要求。
常用的纯化方法包括结晶、过滤、洗涤等。
总的来说，硫酸铵工艺流程的作用是将硫酸和氨气反应生成硫酸铵，并通过纯化步骤去除杂质，获得纯度高的硫酸铵产品。
这样的工艺流程可以满足硫酸铵在不同领域的应用需求。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体??辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与 B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至 4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H20 28.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。
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所需溶液配制：
1.0.06mol/L pH=4.8醋酸盐缓冲液：无水醋酸钠0.29g，冰醋酸0.141mL，纯水定容至100mL。
2.2mol/L氢氧化钠溶液：16g氢氧化钠固体用于200ml纯水中。
3.2mol/L盐酸溶液：取33m L36.4%的浓盐酸定容至200mL纯水中。
4.0.1mol/L PBS缓冲液：80.0 NaCl，KCl 2.0g，Na2HPO4· 12H2O 29.0g，KH2PO4 2.0g，
加超纯水定容至1L。
单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下：
（1）将腹水从-20°C冰箱拿出室温解冻。
腹水用双层滤纸过滤，初步除去杂质、脂肪及细胞碎片。
4°C,12000r/min，离心15min，收集上清，弃沉淀。
精确定量腹水体积。
（2）一份体积的腹水与2-4份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL 调PH至4.5-4.8。
（3）磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4°C静置2h以上。
（4）4°C ,12000r/min，离心5min，收集上清，双层滤纸过滤，收集滤液。
（5）量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH=7.4 的PBS,用2mol/L NaOH（记录NaOH 体积）调pH至7.4。
（6）将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4°C过夜。
（7）12000r/min，离心15min，弃上清。
用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。
用PB 透析两天后换0.01mol/LPBS 透析两天。
收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20°C预冻后真空冻干成粉保存。
张道宏师姐版本：用1/10原腹水体积的0.01mol/L pH值7.4 PBS溶解沉淀；对0.01mol/L pH值7.4的PBS透析一天，离心去掉不溶杂质，用纯水进行透析，优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液，置于-20°C预冻；冻干保存。