腹水-辛酸硫酸铵沉淀法纯化
抗体纯化技术
25℃时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L，定义为100%饱和度。通常情况下，在24%硫酸铵饱 和度以下很少有蛋白质沉淀下来，而在55%硫酸铵饱和度时会有多数蛋白质沉淀，当硫酸铵饱 和度达到80%以上时，几乎所有的蛋白质都会沉淀下来。
硫酸铵溶解度高，溶于水时产生的热量少，高浓度时可抑制微生物和蛋白酶的活性。
亲和层析法
概念
利用蛋白质分子对其配体分子的特异识别和可逆结合的特性建立起来的一种有效的分离纯化方 法。
蛋白A/G亲和层析
Protein A/G是金黄色葡萄球菌的细胞壁蛋白，含有5个可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合 的结构域，可结合多种免疫球蛋白的Fc部分，特异性结合非常牢固，但其亲和力对pH的变化 敏感，会随pH的降低而急剧下降，因此可用于纯化不同来源的抗体及抗体亚型。该法具有极 高的选择性，通常一步层析就可达到超过95%的纯度。
其他沉淀方法
有机溶剂沉淀
概念：利用与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇、丙酮等)能使蛋白质在水中的溶解度显著降低 而沉淀的方法，称为有机溶剂沉淀.
原理：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。 特点：沉淀蛋白质分辨力比盐析法好，溶剂容易除去；易影响蛋白质的活性，故应在低温下操
作并注意搅拌。
聚乙二醇沉淀
概念：在一定盐浓度条件下向溶液加入亲水性极强的聚乙二醇(PEG)引起大分子溶质非特异性 凝聚沉淀的方法。
其他沉淀方法-续
辛酸-硫酸铵沉淀
原理：在酸性条件下（pH4.8）向血清中加入一定量的短链脂肪酸，使血浆蛋白中的清蛋白、 α 及β免疫球蛋白成分沉淀，取以IgG成分为主的上清液再经硫酸铵沉淀得到进一步纯化。
等电点沉淀
概念：利用蛋白质在等电点(pI)时溶解度最低而各种蛋白质又具有不同等电点的特点进行分离 的方法。
辛酸硫酸铵纯化方法
所需溶液配制：1.0.06mol/L pH=4.8醋酸盐缓冲液：无水醋酸钠0.29g，冰醋酸0.141mL，纯水定容至100mL。
2.2mol/L氢氧化钠溶液：16g氢氧化钠固体用于200ml纯水中。
3.2mol/L盐酸溶液：取33m L36.4%的浓盐酸定容至200mL纯水中。
4.0.1mol/L PBS缓冲液：80.0 NaCl，KCl 2.0g，Na2HPO4· 12H2O 29.0g，KH2PO4 2.0g，加超纯水定容至1L。
单克隆抗体采用辛酸-硫酸铵方法纯化，具体步骤如下：（1）将腹水从-20°C冰箱拿出室温解冻。
腹水用双层滤纸过滤，初步除去杂质、脂肪及细胞碎片。
4°C,12000r/min，离心15min，收集上清，弃沉淀。
精确定量腹水体积。
（2）一份体积的腹水与2-4份体积的醋酸盐缓冲液磁力搅拌混匀，用2mol/L HCL 调PH至4.5-4.8。
（3）磁力搅拌下缓慢加入正辛酸，33μL/mL腹水，加完后室温磁力搅拌半小时，后置4°C静置2h以上。
（4）4°C ,12000r/min，离心5min，收集上清，双层滤纸过滤，收集滤液。
（5）量取滤液体积，加入1/10体积的0.1M pH=7.4 的PBS,用2mol/L NaOH（记录NaOH 体积）调pH至7.4。
（6）将上清冰浴预冷，加硫酸铵固体至0.277g/mL，边加边搅拌，并于30min内加完，置4°C过夜。
（7）12000r/min，离心15min，弃上清。
用一定体积的0.01mol/LPBS溶解沉淀。
用PB 透析两天后换0.01mol/LPBS 透析两天。
收集透析液，12000r/min，离心15min，取上清，置-20°C预冻后真空冻干成粉保存。
张道宏师姐版本：用1/10原腹水体积的0.01mol/L pH值7.4 PBS溶解沉淀；对0.01mol/L pH值7.4的PBS透析一天，离心去掉不溶杂质，用纯水进行透析，优球蛋白析出后离心收集澄清抗体溶液，置于-20°C预冻；冻干保存。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非lg蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将lg沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水↓辛酸沉淀（室温）↓→沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（lgG）↓硫酸铵沉淀（4度）↓→上清液沉淀↓溶解沉淀↓透析（4度）实验操作：原料：待纯化的血清（-20度长期保存，实验前4度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、50ml离心管、透析袋、透析夹。
试剂：1.乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol/L,pH4.02.10×磷酸盐-NaCl缓冲液（PBS）：100mmol/LPBS，pH7.4。
称NaCl 80g、Na2HPO412H2O 29g、KCl 2g、KH2PO42g,加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一）辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍(2-4倍)体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终PH为4.5）（PH4.5-4.8）2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的1%）（25ul/33ul辛酸：1ml血清稀释液），滴加完后继续搅拌30min3.离心（10000r/min，30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二）硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10×PBS，用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液(4度按277g/L硫酸铵粉末)，边加边搅拌，加完后继续搅拌2小时以上或者4度过夜7.离心（8000r/min、20min），弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂2）（原血清体积的1/10）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9‰ NaN3硫酸铵溶液能使蛋白质胶体脱水并中和其电荷而使之沉淀下来（称为盐析）。
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
应用辛酸硫酸胺法提取小鼠腹水和血清中的IgG抗体
白丽;钱金;王晶
【期刊名称】《大理学院学报（医学版）》
【年(卷),期】2000(009)004
【摘要】目的:从小鼠腹水和血清中纯化IgG抗体.方法:首先用辛酸沉淀小鼠腹水和血清中的非免疫球蛋白,然后用固体硫酸胺提取抗人T和B细胞白血病单克隆抗体(IgG1和Ig2b)和多克隆IgG抗体.结果:经SDS-PAGE和活细胞免疫荧光法鉴定,获得了纯度高、活性好的抗体,腹水中单抗的回收率达80%以上.结论:本方法是一种简单、价廉且有效的纯化小鼠腹水和血清IgG抗体的方法.
【总页数】2页(P3-4)
【作者】白丽;钱金;王晶
【作者单位】大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000;大理医学院微生物学及免疫学教研室云南大理 671000
【正文语种】中文
【中图分类】R392.11
【相关文献】
1.辛酸-硫酸铵联合沉淀法在单克隆抗体纯化中的应用 [J], 陈丹;孙广瑞;柳增善
2.改良的紫外荧光光度计法检测小鼠血清中多巴胺β羟化酶活性的方法 [J], 刘林林;孙宝胜;杨巍;刘晓岚
3.ELISA法检测囊尾蚴虫病IgG抗体中弱阳性质控血清的制备及应用 [J], 杨柳莹;孙黎;赵仪;陈曦阳;王晓凤;凌攀
4.应用辛酸硫酸铵法提取纯化兔IgG [J], 马贵军;韩素娟;剡根强;周霞
5.辛酸-硫酸铵法在纯化血清旋毛虫特异性IgG抗体中的应用 [J], 刘俊琴;申丽洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
抗血清纯化
辛酸-硫酸铵沉淀法原理简介：辛酸-硫酸铵法分两步进行。
第一步用辛酸沉淀杂蛋白，辛酸为短链脂肪酸，在酸性条件下可沉淀血清或者腹水中的白蛋白或者其他非 lg 蛋白质；第二步利用硫酸铵盐析将 lg 沉淀下来。
实验流程：血清或者腹水辛酸沉淀（室温）J 一沉淀（白蛋白和其他非lg蛋白质）上清液（ lgG）硫酸铵沉淀（ 4 度）J -上清液沉淀溶解沉淀透析（ 4 度）实验操作：原料：待纯化的血清（ -20度长期保存，实验前 4 度融化暂存）器材：磁力搅拌器、冷冻离心机、低温冰柜、医用纱布、 50ml 离心管、透析袋、透析夹。
试剂： 1. 乙酸- 乙酸钠缓冲液： 60mmol/L,pH4.02.10 X磷酸盐-NaCl 缓冲液（PBS： 100mmol/LPBS pH7.4。
称 NaCI 80g、NQHP02HO29g、KCI 2g、KHPO2g,加蒸馏水溶解，加入 100mmol/LEDTA 20ml，用去离子水定容至1000ml。
3.硫酸铵4.辛酸实验步骤：（一：辛酸沉淀除杂蛋白1.抗血清用6倍（2-4倍）体积乙酸-乙酸钠缓冲液稀释（确保终 PH为4.5）（PH4.5-4.8 ：2.室温下边搅拌边缓慢滴加辛酸（血清体积的 1% ：（25ul/33ul 辛酸： 1ml血清稀释液：，滴加完后继续搅拌 30min3.离心（10000r/min， 30min），收集上清液，弃去沉淀4.上清液用三层纱布过滤（二：硫酸铵沉淀得免疫球蛋白5.按1/10经过滤的上清液体积加入10X PBS用5mol/L NaOH调至PH7.46.上清液 4度预冷，加等体积的过饱和硫酸铵溶液（4 度按 277g/L 硫酸铵粉末），边加边搅拌，加完后继续搅拌 2 小时以上或者 4 度过夜7.离心（8000r/min、20min）,弃去上清液，收集沉淀8.沉淀用少量生理盐水（也可用试剂 2）（原血清体积的 1/10 ）复溶，50倍体积透析到PBS中，透析后加入0.9 %。
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体
辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体辛酸-硫酸铵法纯化单克隆抗体(一) 原理蛋白质在溶液中的溶解度取决于蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度, 以及蛋白质分子带有的电荷。
如改变这两个因素,蛋白质就容易沉淀折出。
引起蛋白质沉淀的主要方法有(1) 盐析, 即加入大量中性盐破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出, 沉淀不同蛋白质所需盐浓度及pH 值不同;(2) 生物碱以及某些酸类, 在pH 值小于等电点时可以与蛋白质形成不溶的盐使其沉淀;(3) 重金属离子如隶、铅、铜、银等, 在pH 值大于等电点时可以与蛋白质结合成不溶的盐使其沉淀;(4) 有机溶剂如酒精、甲醇、丙酮等, 对水的亲和力很大, 能破坏蛋白质水化膜, 在等电点时使蛋白质沉淀。
辛酸(caprylic acid) 在偏酸条件下能与血清或腹水中除IgG外的其他蛋白质结合并将其沉淀下来,IgG 则溶于上清液中, 再用硫酸镀盐析, 即可达到纯化IgG 的目的。
辛酸-硫酸铵法是目前实验室中较常用的纯化单克隆抗体的方法, 利用该方法纯化单克隆抗体, 回收率和纯度都可达80% 以上。
(二) 试剂和器材1. 试剂(1) 小鼠腹水。
(2) 硫酸铵或饱和硫酸铵溶液。
称(NH4)2S04(AR)400~425 克, 以50 ℃~80 ℃蒸馆水500ml溶解, 搅拌2O min, 趁热过滤。
冷却后以浓氨水(15M NH40H) 调pH 值至7.4 。
配制好的饱和硫酸铵, 瓶底应有结晶析出。
(3)0.06M pH 4.8 醋酸盐缓冲液。
贮存液: A 液,0.06M NaAc: 无水NaAc0.49218g 加蒸馆水至100mlB 液,0.06M HAc: 冰醋酸0.344ml 加蒸馆水至100ml应用液: 取上述 A 液59ml 与B 液41ml 昆合, 用5M NaOH 调pH 值至4.80.(4)0.lM pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS). 取Na2HP04 · 12H2028.94g,KH2P04 2.61g, 加蒸馆水至100Om1(5) 含137mM NaCl 2.6mM KCl 0.2mM EDTA 的pH 7.4 磷酸盐缓冲液(PBS): 取Na2HP04 12H20 28.94g KH2P04 2.61g NaC1 8.Og 、KCl 0.2g EDTA 0.06g, 加蒸馆水至100Oml2. 器材普通冰箱、低温离心机、电磁搅拌器, 紫外分光光度计、天平; 透析袋、塑料夹、精密pH 试纸; 烧杯、量桶、吸管、滴管、小瓶等。
三种方法纯化相思子毒素单抗的比较
随着人类对生命 科学研究的深入 ， 克隆抗体 ２— 核酸蛋 白检测仪 ， 单 １１ 上海青浦沪西仪器厂； Ｍ１ Ｌ ７
现 已广泛应 用 于生 命 科 学 、 疫 学 、 物 化 学 、 子 型记 录仪 ， 青示 波 器 厂 ； Ｔｒｐ Ｍ ｒｔｉ 免 生 分 永 Ｈｉ ａ Ｔ １ｍＬｐｏｅ ｎ
（ 吉林大学畜牧兽医学院 ， 吉林长春 １ ０ ６ ） ３ ０ ２
采 用硫酸铵沉淀法 、 酸一 酸铵 法和硫 酸铵一 辛 硫
１ １ 材料 ．
相思子毒索单抗腹水 由本实验室制
蛋 白 Ａ 亲和 层 析 法 三 种 方 法分 离 纯化 相 思 子 １１１ 试剂 ＿．
毒素单抗 ， 并采 用十 二 烷基 硫 酸 钠 聚 丙烯 酰 备， 蛋白检测试剂盒（ ｃ ｒｔｎＡ ｓ ｉ 自 Ｂ Ａ Ｐｏｅ ｓ ｙ ｔ ｉ ａＫ ）
维普资讯
罗胜军等 ： 三种方法纯化相思 子毒 索单抗 的比较
７ ３
淀用适 量 Ｐ Ｓ溶解 后 吸出并 装 入 透 析袋 内 ， ４＿ Ｂ 于 Ｃ 条件 下 ， １ ０倍 体积 的 Ｐ Ｓ透 析 ２ ， 对 ０ Ｂ ４ ｈ 中途 换 液
３次～４次 。取 出透 析袋 ， 出蛋 白溶 液 ， ４℃条 吸 在 产物， 分装后 于 一２ ０℃保存 ［ １ ］
酸铵 沉 淀 法较 差 ； 同 方 法 纯 化 后 的 单 抗 活 统有限公司； －４５ 不 ＷＤ ９０Ｂ型水平摇床 ， 沃德生物医学 性 未见 降低 仪器公司； 量 可调 移液 器 ， 微 芬兰 Ｅ Ｐ ＭＤ Ｆ公 ＰＥ Ｏ
：
关键词 ： 思子毒 素 ； 相 单克 隆抗体 ； 纯化
司；Ｈ ３０ Ｔ 一０ 梯度混合器， 上海青浦沪西仪器厂； Ｄ Ｈ
－ 一
小鼠单抗腹水纯化步骤
小鼠单抗腹水纯化一、初纯——辛酸—硫酸铵法【原理】在酸性条件下（pH=4.5），非IgG的蛋白成分（包括白蛋白，部分Ig），能被辛酸等短链脂肪酸沉淀，上清中剩余的蛋白主要为IgG，再用硫酸铵沉淀上清，即可获得纯度较高的IgG。
辛酸—硫酸铵法比硫酸铵法能或得更高纯度的IgG。
【溶液配制】1、60mM的醋酸缓冲液（pH4.0）200ml取0.2M醋酸缓冲液母液60ml，加ddH2O至200ml，调pH为4.04.0.2M醋酸缓冲液母液60ml：○10.2mM乙酸49.2ml，折合566μl的冰乙酸。
○20.2M乙酸钠10.8ml（0.2M乙酸钠：2.72g三水合乙酸钠（MW136.08），溶解于100ml ddH2O中）2、10*PBS (0.1M,pH7.4) 500ml取0.2M PB母液250ml加水定容到500ml，加入45gNaCl（使NaCl终浓度为9%），此时pH约为7.35，调pH至7.4.0.2M PB母液250ml：0.2M Na2HPO4202.5ml （折合14.5g Na2HPO4·12H2O）0.2M NaH2PO447.5ml （折合1.482g NaH2PO4·2H2O）3、1M Tris——Cl（pH9.0）100ml称取12.11gTris——Base（MW 121.1），加水至98ml，用HCl调pH至9.0.【步骤】1、腹水4℃，12000rpm离心15min，去除细胞碎片和大的蛋白聚集物。
2、腹水上清滤纸过滤去除脂质和大的颗粒沉淀，滤液用4倍体积的60mM醋酸缓冲液（pH4.0）稀释后，用1M NaOH调pH至4.5（一般pH刚好在4.5左右，可不再调）。
3、逐滴加入辛酸（终浓度为25μl/ml稀释腹水），待溶解后再加入另一滴，室温搅拌30min，然后4℃静置2h以上，使其充分沉淀。
注意：缓慢滴加避免局部的浓度一下子很高，这样就可能将不需要的蛋白沉淀下来。