循环肿瘤细胞(CTC)检测在肺癌中的应用
外周血循环肿瘤细胞(CTCs)分离富集检测及其临床应用
仅能揭示瞬时的基因组特征 不可行 无 58%（肺癌）
49.6%（肺癌）
97.2%（肺癌） 未见报道 不可以 不可以 数据质量较差
CTC检测助力肿瘤诊疗
2 最具潜力的液体活检---CTC检测
7
2.1 CTC概念
循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cell,CTC)指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
03 非典型形态
• CTC入血后随血液快速流动。 • 与其他细胞碰撞、受到血管壁 的挤压。 • 受机体免疫系统以及药物的攻 击。 • CTC形态有别于肿瘤组织、细 胞大小、形态及表型发生变化。
瘤标志物
Weinberg提出CTC 可作为具有临床实 践价值的诊断指标， 为临床提供重要信
息
CTC的EMT状态与 肿瘤治疗效果和复
发相关
CFDA批准叶酸受 体阳性CTC检测试
剂盒
1869 1889
1976
1982
2004
2007 2008
2011
2012
2013
2014
2016 2017
提出“种子与土壤”假说， 即肿瘤细胞可随血液在 体内循环，进入其他器 官如同种子遇到土壤，
03 非典型形态
•相同肿瘤的不同细胞之间的基因 与表型存在差异。
• 不同实体肿瘤来源CTC，不同患 者CTC表面抗原表达、分布存在差 异。
Burrell RA, et. al. Nature. 2013 ;501(7467):338-45.
2.3 循环肿瘤细胞特点---非典型形态
01 稀有性
02 异质性
优点：非侵入式； 无创； 可重复性取样； 获取全面的疾病信息。
Alix-Panabières C, Pantel K. Clin Chem. 2013 Jan; 59(1):110-8.
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)
人外周血循环肿瘤细胞(CTC)检测技术的研发及临床应用开发美国肿瘤协会于2006 年发表的年度报告指出，目前全世界范围内每3 人中就有1 人在其一生中会患有某种肿瘤，而且肿瘤发病率在发展中国家随着污染程度的增加，患病几率还会高于1/3 的比例。
现今全世界用于肿瘤治疗与防治的费用每年以16.5% 的比例递增。
仅用于乳腺癌，结直肠癌及前列腺癌（还不包括发病率最高的肺癌）的投资，目前世界范围内已达每年92 亿美元。
目前全世界用于肿瘤诊断的方法可归为三大类：病理学（活检切片）；影像学（超声，X光，CT, PET 等）和血清学（血清肿瘤相关蛋白，如CA-125, CA-199, CEA 等），但所有这些方法都有不可避免的缺点，例如灵敏性及特异性差，过于依赖医生判断的主观性等。
因此目前临床急需一种能够为医生及病人提供准确，快速的肿瘤检测手段。
经过长时间的大量研究，美国FDA 认证的人外周血循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC）检测目前已被公认为最好及最可观的检测手段之一。
目前已有越来越多的国内外医生开始应用此技术作为肿瘤检查的重要辅助手段。
不仅于此，CTC 检测也被公认为是目前国外新近流行的肿瘤治疗方法-即阻断肿瘤细胞入血转移的唯一有效检测指标。
除了上述CTC可作为肿瘤检测手段外，CTC还可成功应用于以下一系列其它方面的用途：(1)个体化治疗的体外肿瘤药物筛选；(2)体内化疗药物药效的快速评估: 相对于每12周一查的CT 诊断，CTC在第1-2周即可显示药效结果，这一点对临床医生和病人尤为重要；(3) 根据CTC数目，判断病人愈后状况及存活时间；（4）肿瘤病人复发的监测与及时诊断；及（5）正常人群体检普查以利于尽可能的肿瘤早期诊断。
除了应用于临床外，CTC 亦可应用于众多药厂和科研机构的基础研究，包括寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物等。
目前美国FDA已于2004年认证了美国上市公司Immunicon/Veridex的CTC检测技术及其临床应用。
ctc循环肿瘤细胞检测
CTC循环肿瘤细胞检测循环肿瘤细胞（CTC）是一种罕见的血液中的癌细胞，可以从原发肿瘤脱落，并通过血液循环传播到其他部位。
CTC的检测对于癌症的早期诊断、治疗选择和预后判断具有重要意义。
CTC循环肿瘤细胞检测是一种非侵入性、无创的方法，可以提供关于肿瘤发展和蔓延的有价值的信息。
本文将介绍CTC循环肿瘤细胞检测的原理、方法和应用。
原理CTC循环肿瘤细胞检测的原理基于CTC的特殊性质。
CTC具有一定的生物特性，如细胞形态学特征、表面标记、核酸和蛋白质表达等，使其能够与正常血液细胞区分开来。
通过对CTC进行特异性标记和分离，可以将其从血液中分离出来，并进行进一步的表征和分析。
目前，CTC的检测方法大致可以分为两类：物理方法和生物学方法。
物理方法包括密度梯度离心、滤膜分离和微流控芯片等，通过差异化的物理性质实现CTC的分离。
生物学方法则利用CTC与正常血液细胞之间的生物学区别，如表面标记的差异、特定蛋白和核酸标记等，通过生物学分子靶向的方式进行CTC的富集和分离。
方法CTC循环肿瘤细胞检测的方法多样，具体的选择取决于实验室的设备和研究目的。
下面将介绍几种常见的CTC检测方法：密度梯度离心法密度梯度离心法是最早用于CTC检测的方法之一。
该方法通过利用瘦脂蛋白或葡聚糖等高分子物质在不同浓度下形成的梯度来分离CTC。
通过对梯度离心后，在不同密度层次上找到CTC，并进行进一步的分析和鉴定。
滤膜分离法滤膜分离法基于滤膜的孔径大小来分离不同大小的细胞。
通过选择合适的滤膜孔径，可以将CTC与正常血液细胞分离开来。
然后，通过对滤膜上沉积的细胞进行进一步的标记和分析，即可获得CTC的信息。
微流控芯片法微流控芯片法是一种新兴的CTC检测方法。
该方法利用微流控技术，在芯片上制造出复杂的细流体网络，并通过微米级别的微通道将CTC富集和分离。
微流控芯片法具有高通量、高灵敏度和高特异性的优点，被广泛应用于CTC的检测。
应用CTC循环肿瘤细胞检测在临床和研究领域具有广泛的应用前景。
小细胞肺癌血清NSE及循环肿瘤细胞的相关研究进展
小细胞肺癌血清NSE及循环肿瘤细胞的相关研究进展小细胞肺癌是一种恶性肿瘤，起源于肺部，通常生长速度快，易转移，并且难以治愈。
据统计，小细胞肺癌是所有肺癌中最罕见的一种，占肺癌总发病率的10%左右，但是其死亡率却占到了所有肺癌死亡病例的30%左右，因此其对临床医学和科研的重要性不言而喻。
近年来，科学家们研究发现，由于小细胞肺癌的恶性程度高，因此它会产生很多的神经元特异性烯醇化酶（NSE），而NSE则可以通过血清检测来诊断小细胞肺癌。
这是因为在许多恶性肿瘤中，细胞会产生更多的酶来促进细胞增殖和转移，而NSE则是其中之一。
此外，循环肿瘤细胞（CTC）也被认为是小细胞肺癌的另一种重要生物标志物。
CTC指的是人体循环系统中的肿瘤细胞，可通过血液或骨髓液检测发现。
研究发现，CTC与小细胞肺癌的发展和预后密切相关。
近年来，随着技术的发展，CTC已经成为肺癌治疗领域中的研究热点。
科学家们已经开发出多种方法来检测CTC，其中最常用的是基于免疫学的细胞捕获和高通量检测技术。
通过检测CTC的数量和特定细胞表面标志物的表达水平，可以评估患者肿瘤的恶性程度和预后情况，为治疗方案的制定提供更准确的依据。
需要强调的是，虽然NSE和CTC的检测可以给临床医生提供有用的信息，但是这两种方法的灵敏度和特异性仍需要进一步提高。
一项研究发现，在小细胞肺癌早期阶段，NSE的检测可能会出现假阴性结果，这也提示我们需要在提高NSE的检测灵敏度的同时，开发更多的诊断方法来提高病例的准确性。
综上所述，小细胞肺癌血清NSE及循环肿瘤细胞的检测技术已经成为小细胞肺癌研究的热点领域。
科学家们通过不断地研究和开发，正在努力提高这两种技术的灵敏度和特异性，以便更好地预测和治疗小细胞肺癌。
循环肿瘤细胞(CTC)检测 (2)
循环肿瘤细胞(CTC)检测引言循环肿瘤细胞（CTC）是指从原发肿瘤中脱落并进入血液循环中的癌细胞。
它们是肿瘤转移和复发的主要起源，能提供重要的生物学信息和预测患者预后的依据。
因此，CTC检测对于肿瘤的早期诊断、治疗监测以及指导个体化治疗具有重要意义。
在过去的几十年中，CTC检测技术得到了快速发展和广泛应用。
通过利用特定的标记物（如抗原、RNA或DNA等），结合高灵敏的检测方法，可以在血液样本中检测到极低浓度的CTC。
本文将介绍CTC检测的原理、常用的检测方法以及其在临床上的应用。
原理CTC检测的原理基于以下几个关键步骤：1.血液样本采集：通过采集患者的外周血样本，包括血浆或全血。
2.CTC富集：为了提高CTC的检测灵敏度，需要将CTC从血液中富集出来。
一种常用的方法是通过利用CTC表面标记物的特异性，使用磁珠、细胞捕获装置或微流体装置等实现。
3.CTC检测：将富集后的CTC进行分离和检测。
目前常用的检测方法包括免疫细胞荧光染色、聚合酶链反应（PCR）、流式细胞术（FACS）等。
这些方法可以通过检测CTC表面标记物的存在与否，或者检测CTC特异基因、蛋白质或RNA等分子标记来确定CTC的存在。
4.CTC鉴定和计数：根据CTC的特征，如核形态、大小、核质比等特征，对CTC进行鉴定和计数。
一些图像处理和自动化技术也可以用来提高鉴定的准确性和效率。
常用的CTC检测方法免疫细胞荧光染色法免疫细胞荧光染色法是目前最常用的CTC检测方法之一。
该方法利用免疫荧光染色技术，通过将CTC与特定的抗原结合，然后使用荧光染料进行标记。
通过在荧光显微镜下观察，可以准确识别CTC的存在与否。
PCR法PCR法通过扩增CTC特异基因的片段，来快速检测和鉴定CTC。
该方法的优点是灵敏度高、检测速度快，然而由于PCR 技术的特点，可能存在假阳性结果的问题。
FACS法FACS法通过流式细胞仪对CTC进行快速分离和检测。
该方法可以同时检测多个标记物，提高检测的准确性和灵敏度。
循环肿瘤细胞CTC检测及临床应用
循环肿瘤细胞C T C检测及临床应用Prepared on 22 November 2020循环肿瘤细胞检测及临床应用中文摘要：循环肿瘤细胞是从原发肿瘤扩散，进入到血液或淋巴系统的肿瘤细胞。
循环肿瘤细胞在血液中含量稀少，一般先将循环肿瘤细胞富集，然后再进行检测，现在已经开发了多种细胞富集和检测技术。
本文主要对CTCs的富集和检测技术研究进展，以及CTCs在临床分析和研究上的应用进行了综述。
关键词：循环肿瘤细胞富集检测临床Abstract:Circulatingtumorcellscomefromtheprimarytumorproliferation,andprolife ration,癌症转移的过程是循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)从原发肿瘤分离，通过循环系统扩散，进入血液或者淋巴系统，在远处形成新的肿瘤，最终导致大多数的癌症病人死亡。
1869年，Ashworth在一例癌症死亡患者的外周血中发现了类似肿瘤的细胞，并首次提出了CTCs的概念。
从此，越来越多的研究表明，CTCs的出现与癌症密切相关。
通过上皮-间质转化(EMT)，实体瘤的上皮细胞进行细胞的变化，使他们通过增加流动性和侵袭性脱离组织，进入到血液中，附着，、发展成远端转移。
由于CTCs能够代表原发肿瘤的表型和遗传组成，并能够作为任何转移性肿瘤的”液体活检”，CTCs的富集分离和特征研究，十分具有吸引力。
CTCs的富集和计数技术已经建立，其中CTCs的计数可以成为预测指标，当其大于已知的阈值时，就预示着病人就患有转移性乳腺癌，、前列腺癌，、结直肠癌等。
基于临床试验，美国FDA批准了一种临床检测CTCs的CellSearch技术，用于上述癌症的CTCs的富集和计数。
CellSearch技术成功的证明了CTCs确实表征了疾病的活跃，CTCs数量的增加预示着病情的恶化，可以通过CTCs了解原发性和转移性肿瘤，以CTCs为基础的分析，可以帮助人们实时诊断和预测，对病情做出决定，并取样检测耐药性。
循环肿瘤细胞(CTC)检测
循环肿瘤细胞（CTC）检测一、什么是循环肿瘤细胞（CTC）？循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell，CTC）是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体瘤病灶（原发灶、转移灶）脱落，进入外周血循环的肿瘤细胞。
CTC非常稀少，每毫升血液中109血细胞只有几个CTC。
大部分CTC在进入外周血后会发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者的死亡风险。
二、肿瘤的发生及检测诊断全国肿瘤登记中心发布的2015年年报显示，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例——这相当于每分钟有6人被诊断为癌症。
然而，令人担忧的是这样的情势似乎仍未到达峰顶，未来可能还会不断增加。
美国约翰-霍普金斯大学Kinmel 癌症中心的Bert-Vogelstein 等专家在2013年3月份的一篇综述文章中写道：在今年将死于癌症的一百万人里，绝大部分是因为他们的癌症没有在发生、发展的前90%的时间内被发现。
因此，我们需要明确一点：癌症是一种慢性病，它只是被突然发现，并非是突然发生的。
我们需要尽可能早的发现它，从而提高治愈率。
伴随肿瘤的发生过程，肿瘤细胞的大小也随之增大。
传统方法诊断出癌症的时候，大部分已经是晚期。
晚期癌症的治愈率极低，其五年生存率也很低。
在肿瘤的发生过程中，早期到中期之间是最佳治疗期，因此，如果在早期就可以发现肿瘤的存在，必然可以提高治愈率。
临床癌症研究（Clinical Cancer Research）杂志上发表的荟萃分析（Meta-analysis）证实CTC在乳腺癌预测中的价值，结果表明早期和转移性乳腺癌患者的循环肿瘤细胞CTC检测是一个稳定的预测和预后工具。
如果将肿瘤易感性基因检测和循环肿瘤细胞检测完美结合，那么能够将肿瘤的早期发现率提高数倍。
肿瘤易感性检测是对未来可能患有癌症的一种风险预测。
如果风险等级高，除了改变生活方式外，还可以定期做循环肿瘤细胞检测，即CTC检测，而且检查频率可以适当增加，每2-3个月检查一次，从而达到实时监控的目的。
循环肿瘤细胞CTC
生物标记物(Biomarker)是近年来随着免疫学、分子生物 学和基因组学技术的发展而提出的一类与细胞生长、增殖、 疾病发生等有关的标志物。生物标志物能反映正常生理过程 或病理过程或对治疗干预的药物反应，在早期诊断、疾病预 防、药物靶点确定、药物反应以及其他方面发挥作用。寻找 和发现有价值的生物标记物已经成为目前肿瘤领域研究的一 个重要热点。
科学问题： 耐药的分子模式尚未明确 研究方法： ARMS检测技术结合ddPCR技术
研究目的: 非小细胞肺癌EGFR突变阳性患者经TKI治疗失 败后，观察： 血浆游离肿瘤DNA中T790M突变频率及丰度 不同进展模式下突变频率及丰度的差异
ctDNA检测
研究方案
筛选入组
• 男性或女性患者 （>18岁）
假阳性 1%; 假阴 性56.9% 97.3%
88%
与预后的相关性
外周血EGFR突变 预示对TKI良好的 ORR与PFS 外周血EGFR突变 与不良的预后有关
外周血EGFR突变 患者与ORR/PFS显 著相关 TKI治疗进展时 44%伴有耐药突变
血浆EGFR突变是 生存结果的有力预 测因素
ctDNA检测 外周血检测EGFR突变与TKI治疗疗效
靶人群
靶向目的 基因药物
延长有效率 延长生存 改善生活质量
临床获益
概述
基于临床分期的经典NSCLC治疗方案
Ⅰ期（IA - IB）：
手术，IA不需要辅 助化疗，IB有高期：
手术+手术后辅助 化疗
III期：
手术、放疗及化疗 相结合的多学科综
合治疗
IV期：
药物治疗为主，如 有EGFR突变或ALK （+）患者，优先
但灵敏度从43-100%不一 尚有提升的空间
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化疗一 个疗程
CTC 检测
统计 分析
患者入组标准
未做过化疗，且4周内未做过放疗 病理学确诊为非小细胞肺癌 IIIA, IIIB, IV期 准备进行标准的细胞毒疗法 5年内未患过恶性肿瘤
实验方法
CellSave 专用收集管采集血液 采集血后于室温储存并于96小 时内进行检测 Cellsearch 系统进行检测
血管内增殖 (CTM)
Cristofanilli证实治疗前
CTC数目是转移性乳腺癌 患者无进展生存期和总生 存期的独立预测因子。
转移
转移
播散肿瘤细胞 （DTC）微转 移休眠灶
CTC检测
预测PFS及OS 指示预后效果 复发转移预测与分期 有助于肿瘤个体化治疗的药物筛选和治疗方案的确定 是传统的影像学及其他生物标志物的补充检测手段 有助于寻找新的肿瘤标识物以及开发新的抗肿瘤药物
所有Ⅳ期非小 细胞肺癌病人
基线CTC数量少于5的患者无进展生存期和总生存期明显高于基 线CTC数量大于等于5的患者。
化疗前后CTC数量与患者无进展生存期和总生存期的关系
过滤法
ISET: Isolation by Size of Epithelial Tumor cells 8μm孔径过滤膜，漏检 体积较小的肿瘤细胞 敏感性低 • • • •
免疫磁珠法
肿瘤细胞表面抗原 CTC纯度低，混入较多 白细胞 不能有效排除细胞碎片 假阳性和假阴性高
Cell Search---免疫磁珠+流式细胞分析+化学发光
背景
1
肺癌是最常见的原发性恶性肿瘤，85%的 肺癌患者为非小细胞肺癌，大多数患者发 现时已是晚期，其5年生存率只有2%。
2
目前，仍然缺乏有效的生物标记物 预测治疗的有效性。CTC是一个潜 在的疗效预测因子。
3
验证能否在NSCLC患者中检测出 CTC及CTC能否预测治疗有效性。
实验流程
病人 入组
基线CTC 检测
1869年 Aust Med J， Ashworth最早在转移性癌
原发肿瘤血管 生成侵润
侵入血管内
症患者血液中观察到。
上皮－间质 转化 （EMT） 侵润 肿瘤细胞 扩增 血管生成 间质－上皮 转化 （MET）
凋亡的CTC 侵入血管外 (CTC) 转移到骨 髓和其他 器官
2005年 N Engl J Med，
• • • • • 存在一定的健康危害或健康隐患 肿瘤大小常与肿瘤的恶性程度或浸润能力不完全一致 费用昂贵 滞后性 灵敏性低
病理学方法
手术或活检获得病灶组织/周围淋巴结组织， 进行病理学染色和分析，是目前唯一明确肿瘤 有否转移的金标准 缺点：
• • • • • 精确度不够高 是侵入性检查手段 易造成扩散 人工误差大 难以标准化
CellSearch 是全球第一也是唯一经FDA批准可用于 临床的循环肿瘤细胞（CTC）产品
100% 90%
%Probability of Survival
80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
<5 CTCs n=90 (51%)
从红细胞和白细胞中富集恶性肿瘤细胞
将恶性肿瘤细胞与红细胞、白细胞、正常 上皮细胞、造血干细胞等区分开来
三种技术
梯度密度法
• • • • 肿瘤细胞和单核细胞密 度小于1.077g/ml CTC纯度低，混入较多 白细胞 肿瘤细胞会迁移至血浆 层，而聚集后容易下沉 聚蔗糖-泛影葡胺(FicollHypaque)对细胞有毒性 • • •
患者化疗前CTC数量（基线CTC）与临床特征的关系
IV期患者CTC数量明显多于IIIB期患者， IIIB期患者的CTC数量又明显多于IIIA期患者。
患者化疗前CTC数量与肿瘤转移地点的关系
肝转移及骨转移患者中 CTC数量明显多于其它转 移患者。
基线CTC数量与无进展生存期和总生存期的关系
所有非小细胞 肺癌病人
血清肿瘤标记物测定
血清肿瘤标志物的浓度往往可以在一定程 度上提示肿瘤的发展程度
缺点：
• 特异性不高 • 易受非特异蛋白的干扰 • 其他的病理生理状态影响导致假阳/指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。
循环肿瘤细 胞（CTC） 循环肿瘤 微栓 （CTM）
Logrank p < 0.0001
2010.1 中国 CTC在 2009 Cleveland 2004 获得美国 Clinic十大医学突破第 一名 复发转移乳腺癌上的
21.9 Months 10.9 Months
>5 CTCs n=87 (49%)
应用注册实验
2011.5 CTC在小细胞
20
22
24
肿瘤疾病近期疗效的判断方法
临床因子作为预后与预测因子
• 预后：T, N, M staging, PS score
• 预测：
– 吸烟状况：指导靶向治疗
– 性别：指导靶向治疗
– 种族：指导靶向治疗 – 组织学：指导化疗和靶向治疗
影像学方法
非侵入地、直观地对患者的肿瘤大小变化情 况进行评估。 缺点：
肿瘤细胞作为生物标志物
• 外周血和肺静脉血中的循环肿瘤细胞（CTCs）
– 临床意义:
• • • • 转移的辅助标志物？ 可以预测治疗？ 预后因子？ 最小损伤的突变检测?
获取CTC需要解决的技术问题
每10mL血液中可能仅含有几个到几十个 循环肿瘤细胞，而10mL血液中含有的白 细胞约有1亿个，红细胞有500亿个。
1983 磁流体
J Clin Oncol. 2011 Apr 20;29(12):1556-63. Epub 2011 Mar 21.
Evaluation and prognostic significance of circulating tumor cells in patients with non-small-cell lung cancer.
26
28
30
Time from Baseline (Months)
FDA批准用于 1999-2003 大量 临床实验建立 CellSearch与CTC 临床
2009 Prix Galien USA 肺癌上的应用实验研 究 最佳医学技术奖 ……
的临床相关数据 90年代中期开始 摸索捕获、分析 CTC的方法