色谱峰分离度计算
色谱分离度及其优化简介
色谱分离度及其优化简介黄秋鑫（学号：200728016537055）中国科学院广州地球化学研究所摘要： 本文介绍色谱分离度的含义、影响分离度因素及常用优化离子色谱分离度方法，对实际应用色谱法有一定的启发与帮助。
关键词： 色谱法 分离度 优化一、分离度的定义分离度（resolution ）又称分辨率[1]，为了判断难分离物质对在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为柱的总分离效能指标，是全面反映两峰分离程度的参数。
分离度等于相邻两峰保留时间之差与两组分色谱峰的峰底宽度之和的一半的比值： ())()()()(21B b A b A R B R t t R ωω+-= 或 ⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛+-=)(21)(21)()(699.1)(2B A A R B R t t R γγ相邻两组分保留时间的差值反映了色谱分离的热力学性质；色谱峰的宽度则反映了色谱过程的动力学因素。
因此分离度概括了这两方面的因素，并定量地描述了混合物中相邻两组分的实际分离程度，因此用它作为色谱柱的总分离效能的指标。
当两峰等高，峰开对称且符合正态分布时，可以从理论上证明，若R=0.8时，分离程度89％；R=1.0时，4δ分离（峰间距4δ），分离度达98%；R=1.5时，6δ分离，分离度达99.87%。
一般采用R=1.5作为相邻两峰完全分离的标志。
图1从图1中可以看出，(c)中A/B 两峰完全分离。
实现分离的条件：相对保留值a 增大（组分分配比之差△K D 增大），分离的可能性增大，其峰间距也增大；柱效能n 增大，峰宽减小。
二、色谱基本分离方程式假设相邻两峰的峰底宽度相等，即ωb(1)=ωb(2)()()()⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=⎪⎭⎫ ⎝⎛+=∴⎪⎭⎫ ⎝⎛+===∴⎪⎪⎭⎫ ⎝⎛=-=-=-=-=+-=ααωωωωωωωωω1'1'411'1'411'1'41'1'41','1'4116','161''1'''''''2122,12,122,122)2()2(2)2()2(22,1)2()2()2()2(2,1)2()2()2()1()2()2()2()1()2()1()2()1()2(k k n r r k k n r k k n R k k n t k k n n n n t t n r t t r t t t t t t t t t R b R effeff eff b R b R effb R R b R b R R R R b R R b b R R 又 其中：n 为色谱柱效；k ’为分配比；α=r 1,2为相对保留值；t 为保留时间；t ’为相对保留时间；ω为峰宽。
通则0512高效液相色谱法
高效液相色谱法：系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪：是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
分离度与峰分离
分离度与峰分离在分析化学领域中，分离度与峰分离是两个重要的概念。
它们在色谱分析、质谱分析以及其他分析技术中起着关键作用。
本文将详细介绍这两个概念，并探讨它们在实际应用中的意义和影响。
一、分离度分离度是指在分析过程中，两个相邻峰之间的距离或重叠程度。
它是衡量分离效果的重要指标之一。
分离度越高，表示两个峰之间的距离越大，样品成分得到更好的分离。
相反，分离度越低，表示两个峰之间的距离越小，样品成分分离效果较差。
分离度的计算方法有多种，其中一种常用的方法是使用峰宽和峰高来计算。
峰宽是指峰的宽度，可以通过峰的半高宽度来确定。
峰高是指峰的最大高度。
通过计算两个相邻峰的峰宽和峰高，可以得到它们之间的分离度。
分离度的高低对于分析结果的准确性和可靠性有着重要影响。
如果分离度较低，不同成分之间可能会发生重叠，导致分析结果的误差增大。
因此，在实际分析中，我们通常会采取一些措施来提高分离度，例如调整分析条件、改变柱子类型等。
二、峰分离峰分离是指在色谱分析中，不同成分在色谱图上形成的峰之间的距离。
峰分离的好坏直接影响到分析结果的准确性和可靠性。
如果峰之间的距离足够大，那么不同成分可以清晰地分离开来，分析结果更加准确。
相反，如果峰之间的距离较小，不同成分可能会发生重叠，导致分析结果的误差增大。
峰分离的好坏与分离度密切相关。
分离度越高，峰分离越好。
因此，在实际分析中，我们通常会通过调整分析条件、选择合适的柱子和优化方法等手段来提高峰分离效果。
峰分离的好坏还与样品的复杂性和分析目的有关。
对于复杂样品，可能存在大量的组分，峰之间的距离较小，峰分离较差。
这时，我们需要采取更加精细的分析方法来提高峰分离效果。
而对于简单样品，峰之间的距离较大，峰分离较好，分析结果更加准确。
总结起来，分离度与峰分离是分析化学中两个重要的概念。
它们在分析过程中起着关键作用，直接影响到分析结果的准确性和可靠性。
在实际应用中，我们需要通过调整分析条件、选择合适的柱子和优化方法等手段来提高分离度和峰分离效果，以获得更准确的分析结果。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
色谱峰的分离度计算公式
色谱峰的分离度计算公式色谱技术是一种用于分离和检测化合物的重要分析技术。
在色谱分析中，色谱峰的分离度是一个重要的指标，用于评价分离效果的好坏。
分离度的计算公式可以帮助分析人员快速准确地评价色谱分离效果，为实验结果的解释和分析提供重要参考。
分离度的计算公式如下：分离度 = (R2-R1) / (0.5(W1+W2))。
其中，R1和R2分别表示两个相邻峰的峰顶位置，W1和W2分别表示两个相邻峰的峰宽。
分离度的数值越大，表示两个相邻峰之间的分离效果越好。
色谱峰的分离度计算公式的理论基础是色谱分离原理。
色谱分离是利用不同化合物在固定相和流动相之间的分配系数不同，通过在固定相上的分配和流动相的传递来实现的。
当样品中含有多个化合物时，这些化合物在色谱柱中的分布和传递过程会导致它们在检测器中形成不同的峰。
而分离度的计算公式则是基于这些峰的位置和宽度来评价它们之间的分离效果。
分离度的计算公式的应用范围非常广泛。
在实际的色谱分析中，分离度可以用于评价不同色谱柱、不同流动相、不同分析条件等对分离效果的影响。
通过比较不同条件下的分离度，可以选择最适合的分析条件，提高分离效果和分析速度。
此外，分离度还可以用于评价不同分析方法的分离效果，指导实验设计和结果解释。
除了分离度的计算公式，还有一些与分离度相关的参数也是色谱分析中常用的指标。
比如峰高比、峰面积比等。
这些参数可以与分离度一起综合评价色谱分离效果，提高分析结果的准确性和可靠性。
在实际的色谱分析中，分离度的计算需要准确的峰顶位置和峰宽数据。
因此，对于色谱峰的峰识别和峰参数测定是非常重要的。
峰识别可以通过色谱数据处理软件实现，而峰参数测定则需要仪器操作人员具备一定的操作技能和经验。
只有准确获取了峰的位置和宽度数据，才能得到准确的分离度计算结果。
总之，色谱峰的分离度计算公式是评价色谱分离效果的重要指标。
它基于色谱分离原理，通过峰的位置和宽度来评价不同化合物之间的分离效果。
《中国药典》2015版通则0512高效液相色谱法
通则0512高效液相色谱法高效液相色谱法系采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。
注入的供试品，由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。
1.对仪器的一般要求和色谱条件高效液相色谱仪由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成。
色谱柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。
超高液相色谱仪是适应小粒径（约2μm）填充剂的耐超高压、小进样量、低死体积、高灵敏度检测的高效液相色谱仪。
（1）色谱柱反相色谱柱：以键和非极性基团的载体为填充剂填充而成的色谱柱。
常见的载体有硅胶、聚合物复合硅胶和聚合物等；常用的填充剂优十八烷基硅烷键合硅胶、辛基硅烷键合硅胶和苯基键合硅胶等。
正相色谱柱：用硅胶填充剂，或键合极性基团的硅胶填充而成的色谱柱。
常见的填充剂有硅胶、氨基键合硅胶和氰基键合硅胶等。
氨基键合硅胶和氰基键合硅胶也可用作反向色谱。
离子交换色谱柱：用离子交换填充剂填充而成的色谱柱。
有阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
手性分离色谱柱：用手性填充剂填充而成的色谱柱。
色谱柱的内径和长度，填充剂的形状、粒径与粒径分布、孔径、表面积、键合基团的表面覆盖度、载体表面基团残留量，填充的致密与均匀程度等均影响色谱柱的性能，应根据被分离物质的性质来选择合适的色谱柱。
温度会影响分离效果，品种正文中未指明色谱柱温度时系指室温，应注意室温变化的影响。
为改善分离效果可适当提高色谱柱的温度，但一般不宜超过60℃。
残余硅羟基未封闭的硅胶色谱柱，流动相的pH值一般应在2～8之间。
残余硅羟基已封闭的硅胶、聚合物复合硅胶或聚合物色谱柱可耐受更广泛pH值的流动相，适合于pH值小于2或大于8的流动相。
（2）检测器最常用的检测器为紫外-可见分光检测器，包括二极管阵列检测器，其他常见的检测器有荧光检测器、蒸发光散射检测器、示差折光检测器、电化学检测器和质谱检测器等。
高效液相色谱法的计算方法
高效液相色谱法的计算方法高效液相色谱法是用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,经进样阀注入供试品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器，色谱信号由记录仪或积分仪记录。
1、对仪器的一般要求所用的仪器为高效液相色谱仪。
色谱柱的填料和流动相的组分应按各品种项下的规定。
常用的色谱柱填料有硅胶和化学键合硅胶。
后者以十八烷基硅烷键合硅胶最为常用，辛基键合硅胶次之，氰基或氨基键合硅胶也有使用；离子交换填料，用于离子交换色谱;凝胶或玻璃微球等,用于分子排阻色谱等。
注样量一般为数微升。
除另有规定外,柱温为室温，检测器为紫外吸收检测器。
在用紫外吸收检测器时，所用流动相应符合紫外分光光度法(附录ⅣA)项下对溶剂的要求。
正文中各品种项下规定的条件除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意改变外,其余如色谱柱内径、长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组分的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等,均可适当改变，以适应具体品种并达到系统适用性试验的要求。
一般色谱图约于20分钟内记录完毕。
2、系统适用性试验按各品种项下要求对仪器进行适用性试验,即用规定的对照品对仪器进行试验和调整,应达到规定的要求；或规定分析状态下色谱柱的最小理论板数、分离度和拖尾因子。
(1)色谱柱的理论板数（N,用于定量表示色谱柱的分离效率，简称柱效)。
在选定的条件下,注入供试品溶液或各品种项下规定的内标物质溶液,记录色谱图,量出供试品主成分或内标物质峰的保留时间ｔR（以分钟或长度计，下同,但应取相同单位）和半高峰宽(W h/2),按n=5.5４(t R/Wｈ/2)2计算色谱柱的理论板数,如果测得理论板数低于各品种项下规定的最小理论板数,应改变色谱柱的某些条件(如柱长、载体性能、色谱柱充填的优劣等),使理论板数达到要求。
（2) 分离度（R)定量分析时，为便于准确测量,要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
色谱法
载气
检测器
氮气
氢火焰离子化检测器（FID）
检测温度高于柱温
一般 250 ~ 350℃
二、高效液相色谱法（HPLC法）
以液体为流动相的色谱法
（一）HPLC的速率理论
H A Cu
与气相色谱法的差别
GC法 高温（ChP 50 ~ 265℃） 纵向扩散项大（B/u）
HPLC法
室温
传质阻抗项大（Cu）
2. 载体
硅藻土型载体（红色、白色）
3. 毛细管色谱柱 填充型毛细管柱
开管型毛细管柱（WCOT、SCOT）
√
（四）气相色谱仪
气源 进样及气化系统
色谱柱和柱温箱
检测器 热导检测器 氢火焰离子化检测器
电子捕获检测器
ChP（2005）对气相色谱仪的一般要求
色谱柱 固定液 填充柱或毛细管柱（空心柱) 高沸点液体
As Cs f AR CR
内标+样品→计算杂质含量
Ax Cx f As Cs
内标物+ 杂质对照品 →校正因子
内标物+样品 →杂质含量
（2）外标法 供试品→供试品溶液
杂质对照品→对照品溶液
Ax 含量（ x） CR C AR
缺点 不易控制进样量
宜用定量环
（3）加校正因子的主成分自身对照法
2
（二）分离度（R）
除另有规定外，R≥1.5
2 t R2 t R1 R W1 W2
t R2 t R1
（三）重复性（RSD）
尾因子（T）
除另有规定外，T应0.95 ~ 1.05
W0.05h T 2d1
四、GC和HPLC在药品检验中的应用
配系数大的后流出
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色谱分析的目标就是要将混合物中的各组分分离，两个相邻色谱峰
的分离度R （r e s o l u t i o n ）定义为两峰保留时间差与两峰峰底宽平均值之商，即
(7-5)
式中t R1和t R2分别为峰1和峰2的保留时间；w 1和w 2分别为峰1和峰2在峰底（基线）的峰宽，即通过色谱峰的变曲点（拐点）所作三角形的底边长度。
计算分离度所需的参数都可以从色谱图（图7-4）中获得
如果色谱峰呈高斯分布，则分离度R =2（相当于8分离）即可完全满足定量分析的需要。
因为在基线位置的峰宽w 为4，R =2时，两个峰完全达到了基线分离。
通过调节色谱条件还可获得更高的R 值，不过这时的代价将是分析时间增加。
如果两组分浓度相差不是太大，分离度R =时，仍然可以看得出两个峰的峰顶是分开的。
分离度 )(2/1211
2y y t t R +-= R>即为完全分离
t 1 ：色谱峰1的保留时间
t 2 ：色谱峰2的保留时间
y 1 ：色谱峰1的峰宽
y 2 ：色谱峰2的峰宽
乙苯与对二甲苯 38.2)079.008.0(2/1409.9598.9=+-=
R 对二甲苯与间二甲苯 08.2)
0828.008.0(2/1598.9767.9=+-=R
从结果可以看出，乙苯、对二甲苯、间二甲苯三种物质的峰能够完全分离
乙苯与对二甲苯 52.2)0756.0076.0(2/1272.9463.9=+-=
R 对二甲苯与间二甲苯 18.2)
0756.00791.0(2/1463.9632.9=+-=
R 从结果可以看出，乙苯、对二甲苯、间二甲苯三种物质的峰能够完全分离。