猪支原体肺炎活疫苗（168株）的安全性研究
猪支原体肺炎疫苗研究进展
猪支原体肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine ，MPS ）是由猪肺炎支原体（Mycoplasmahyopneumoniae ，Mhp ）引起的一种慢性、接触性呼吸道传染病，临床上有独特的咳嗽和喘气症状，又称猪喘气病或猪气喘病［1］。
该病可通过空气传播，不同日龄的猪均易感，但仔猪超过6周龄时才表现明显症状。
感染后导致日增重降低，死亡率的增加、饲养利用率的下降及给药治疗导致的成本增加等，当与引起呼吸道疾病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex ，PRDC ）的部分病毒性病原体结合时，猪肺炎支原体也能够导致由特定病毒性病原包括猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV ）和猪2型圆环病毒（PCV2）感染引起疾病的发生［2］。
疫苗免疫是猪支原体肺炎的主要防制措施，目前商品化疫苗应用广泛，对防控MPS 起到了积极的作用。
本文将对国内外近年来研发及使用的猪支原体肺炎疫苗进行概述，为将来MPS 疫苗的研究开发提供参考。
1常规疫苗目前使用非常广泛的疫苗主要是灭活疫苗和减毒活疫苗，详见表1。
国内上市的进口猪支原体肺炎灭活苗菌株主要是J 株、P 株、BQ14株、P⁃5722⁃3Ⅰ株和P⁃5722⁃3Ⅱ株。
近年来，国产猪支原体肺炎灭活疫苗的开发迅速，新增了5个不同菌株的灭活疫苗，该类疫苗在我国市场占有率较高，生产企业也较多，主要是DJ⁃166株、HN0613株、NJ 株、CJ 株和SY 株。
除上述猪支原体肺炎灭活疫苗外，目前仍有4个菌株的灭活疫苗处在新兽药注册阶段，分别是广东大华农动物保健品股份有限公司的M1203株，北京中海生物科技有限公司的S 株，广东永顺生物制药股份有限公司的GD0503株和辽宁益康生物股份有限公司的ZY 株。
猪支原体肺炎活疫苗国外无商品化猪支原体肺炎疫苗研究进展穆光慧，刘欢欢，胡美容*（广东永顺生物制药股份有限公司，广东广州511356）摘要：猪肺炎支原体是引起猪支原体肺炎的病原，该病呈世界性流行，死亡率虽然不高，但由于长期性和消耗性的流行，使饲料转化率降低，并引起猪的多种并发病，是造成养猪业经济损失最重要的疾病之一。
猪支原体肺炎及疫苗研究进展
猪支原体肺炎及疫苗研究进展朱燕锋;罗意;许俊才;卢业云;杨德明;冯志新;王胜东【摘要】文章对猪支原体肺炎的危害、致病机理、诊断和防控技术进行了综述,并对猪支原体肺炎疫苗进行了分类及分析,为该病的防控及疫苗的研究开发提供参考.【期刊名称】《贵州畜牧兽医》【年(卷),期】2017(041)001【总页数】5页(P17-21)【关键词】猪支原体肺炎;活疫苗;研制;免疫机理;应用【作者】朱燕锋;罗意;许俊才;卢业云;杨德明;冯志新;王胜东【作者单位】南京大爻网络科技有限公司,江苏南京210012;贵州福斯特生物科技有限公司,贵州贵阳550014;贵州福斯特生物科技有限公司,贵州贵阳550014;南京大爻网络科技有限公司,江苏南京210012;南京大爻网络科技有限公司,江苏南京210012;江苏省农科院兽医研究所,江苏南京210014;寿光华银食品有限公司,山东潍坊262700【正文语种】中文【中图分类】S858.28猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是引起猪支原体肺炎(MPS，又称“喘气病”)的病原体。
MPS以接触性、高度传染性、慢性、高发病率和低死亡率为特点，主要表现为咳嗽、呼吸困难，解剖可见肺组织肉样或胰样病变。
其主要危害是引起猪的生长受阻和饲料转化率大幅下降，同时造成免疫缺陷并诱导其它疾病多发，严重影响养猪业的经济效益。
猪支原体肺炎流行于世界各地，在畜牧业发达的美国、澳大利亚等国普遍存在，也是对我国养猪业造成严重经济损失的主要疾病之一［1］。
猪肺炎支原体导致的疾病在猪场比较普遍，一般不会引起猪的死亡，因而其危害容易被人们所忽视。
猪支原体肺炎造成的经济损失主要有:日增重降低、死亡率增加、饲养效率低及医药费用增加。
Wallgren.P等［2］在对一个屠宰场的调查中发现，在被检4 508头猪中有4210头有肺损伤，对其中3 841头猪的肺脏进行检验发现有3 769头为猪肺炎支原体阳性，感染率高达91.6%。
猪支原体肺炎疫苗应用现状与研究进展
110猪业科学 SWINE INDUSTRY SCIENCE 2017年34卷第07期猪群保健H E A L T H广东腾骏动物药业股份有限公司协办栏目协办国家高新技术企业猪支原体肺炎疫苗应用现状与研究进展魏 凤1，张文通2，李 峰1，沈志强*，1,2（1.山东省滨州畜牧兽医研究院，山东 滨州 256600；2.山东绿都生物科技有限公司，山东 滨州 256600）基金项目：山东省现代农业产业技术体系生猪创新团队项目 SDAIT-08-17 作者简介：魏凤，女（1979-），河南遂平人，硕士，助理研究员，主要从事兽用生物制品研究，E-mail ：hzndzwt1@猪肺炎支原体（Mhp）是引起猪肺炎的一种接触性呼吸系统传染病。
它主要通过感染破坏猪的上呼吸道纤毛、导致纤毛的脱落，进而使得其他病原有机会侵袭肺脏而引发肺炎，从而导致猪体的体液免疫和细胞免疫功能的降低，产生免疫抑制，使其他细菌或病毒性疾病易感。
该病的特点是可感染各年龄阶段的猪群，当猪肺炎支原体伴有其他病原混合感染或继发感染（如猪圆环病毒2型、猪繁殖与呼吸综合征病毒等）时，表现为呼吸困难、发热、死亡；反之，未伴有其他病原体时，表现为干咳、生长减慢。
该病全世界普遍存在，能够降低猪只平均日增重、降低饲料转化率、增加防治药费、增加淘汰猪和低体重猪数量等，给养猪业带来了巨大经济损失[1-4]。
防治该病最关键措施是疫苗接种。
目前国内外用于预防猪肺炎支原体感染的商品疫苗有灭活苗、减毒活苗，这些疫苗己得到广泛应用。
而一些新型疫苗的研究如活载体苗、以及亚单位苗和DNA 苗均处于实验室研究阶段。
本文对该疫苗在国内外主要研究进展展开综述。
1 灭活疫苗目前国内市场上出售的猪支原体肺炎灭活苗进口的有：梅里亚有限责任公司的BQ14株，西班牙海博莱的J 株，硕腾公司美国查理斯堡的P-5722-3株，美国普泰克的P 株，勃林格殷格翰的J 株，英特威美国分公司的J 株。
市场上出售的猪支原体肺炎灭活苗国产的有：哈药集团的P-5722-3株，中牧的DJ-166株。
猪支原体肺炎弱毒疫苗——“支必宁”临床应用报告
猪支原体肺炎弱毒疫苗——“支必宁”临床应用报告作者：周先建，周勇岐，何东旭等来源：《兽医导刊》 2018年第1期一、试验单位山东某种猪场（国家核心育种场）二、试验目的探究南京天邦猪支原体肺炎弱毒活疫苗（168株）——“支必宁”与某进口厂家支原体肺炎灭活疫苗在预防猪支原体肺炎的效果及免疫后对猪生长性能等经济指标影响之间的差异。
三、试验材料与方法试验选择同一产房21 头母猪所产仔猪进行试验，试验猪群随机分成两组：支必宁组和灭活苗组。
灭活苗组于7 日龄和28 日龄两次免疫某进口厂家支原体肺炎灭活疫苗（2ml/ 头），支必宁组于7 日龄免疫支必宁（1 头份/ 头），试验全程两组试验猪群都于相同环境下饲养。
四、试验结果试验数据见表1，表2。
数据显示：支必宁组下保育时均重、日增重、料肉比等指标均优于灭活苗组。
肺部解剖结果显示：支必宁组肺脏肉变比例（33.33%）远小于灭活苗组（75%），说明支必宁与某厂家灭活疫苗相比，对防止肺脏发生肺炎支原体造成的样肉变及改善均重、日增重、料肉比等各项经济指标具有明显优势。
五、结果分析从表1 试验结果可以看出：两组在饲喂试验中，就料肉比而言，两组相差：1.69-1.63=0.06，即灭活苗组每头猪每长1kg 肉就多耗料0.06 kg ；而支原体肺炎发病日龄多在保育后期及育肥期，随着日龄的增加发病率及肺部病变将进一步增大，若试验继续至育肥出栏，则料肉比的差值将极有可能进一步扩大。
设想即使到出栏时料肉比的差值仍为0.06，按出栏重为100 kg，则支必宁组较灭活苗组将少耗费饲料：0.06×100=6 kg/ 头；按每公斤饲料3.2 元计算，则支必宁组每头猪增加收益：3.2×6=19.2 元/ 头，一个年出栏1 万头肥猪的猪场则可增加收益19.2 万元。
此外，如果进一步计算支必宁的使用对呼吸道疾病发病率的降低，治疗、保健用药的减少，则支必宁与灭活苗相比对于猪场效益的增加将远远大于19.2 万元。
猪肺炎支原体168弱毒株P65基因的原核表达及鉴定
海生 工 生物 工程 技术 服务 有 限公 司产 品 。
１ ． ２ 方 法
１ ． ２ ． １ 引物设 计 根据 ＮＣ Ｂ Ｉ 发 布 的关 于 Ｍｈ ｐ １ ６ ８ 弱毒株的表面膜蛋 白 ｐ ６ ５ （ Ｉ Ｄ： １ ６ １ ８ ６ ８ ２ ４ ） 的基 因序
列， 设计扩增 Ｐ ６ ５基 因的引物 ， 并加入 了 Ｂ ａ ｎＨＩ ｒ 、 Ｓ ａ Ⅱ
酶 切 位 点 。Ｐ １ ： ５ ～ Ｃ ＧＣ ＧＴ Ｃ ＧＡＣ Ｇ Ｃ ＧＡＡＡＡＡＴＴ —
猪 肺炎 支原体 （ Ｍｙ ｃ ｏ ｐ ｌ ａ ｓ ｍａ ｈ ｙ ｏ ｐ ｎ ｅ ｕ ｍｏ ｎ ｉ ａ ｅ ，
１ 材 料 与 方 法
１ ． １ 材 料
Ｍｈ ｐ ） 可 以 引起 猪 的支 气 管 肺 炎 ， 又称猪 “ 气 喘 病” ［ ｊ ］ 。该 病 的危 害在 于 Ｍｈ ｐ可 与 猪 呼 吸道 上 皮 细 胞 的纤 毛发生 特 异 性 黏 附 ， 从 而破 坏 动 物 机 体 呼 吸 道黏 膜一 纤毛屏障 ， 引发 其 他 病 原 体 的感 染 ， 使 呼 吸 道疾 病 加重 ， 继 而 引 起 猪 呼 吸 道疾 病 综 合 征 （Ｐ ｏ ｒ —
关 键词 ： 猪 肺 炎支原 体 ； Ｐ ６ ５基 因 ； 酶 联 免 疫 吸 附 测 定
中图 分 类 号 ： ￥ ８ ５ Ｚ ． ６ ２； ￥ ８ ５ ８ ． ２ ８
文献标识码 ： Ａ
文章编号 ： １ ０ ０ ７ — ５ ０ ３ ８ （ ２ ０ １ ５ ） Ｏ ４ — ０ ０ １ １ － ０ ５
猪肺炎支原体168株弱毒活疫苗的应用
２３． 兜／人 、３１．４０兜／人 、４８兜／人 ； 两纰 ：免 疫 组 １６７头 （７１：ｔ龄 １６７头 健 试验期 ６个 月 。
免 疫绀 符 阶段 成活 率较 ｘ，ｊ Ｊｌ｛｛ｆｉｔｇ）＇￣１］岛
３．４７、１．１３、６．６７个 盯分 一 ；屠
表１ 衍肺 炎支原体弱 毒活疫 （１６８株 ）对 仃肥期 产性能的影响
科 技 与 推 广 Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ
４．生 产数 据 采集 。统计对 ｊ｛《｛组 免 疫 组 料 肉 比较 时照 绀 降 低 Ｏ．４５７， ｊＪ【１： （０．５ｌ一（）．４２）１－‘ ×８ Ｊｆｉ／丁‘ 和 免疫组 各 阶段 （哺乳 期 、保 育期 、 分 别 为２．６０５、３．０６２，保 育期 免 疫 组 ＝ ０．７２７亡／头 ，保 育 １ 约 删 料 成
肺 部痫 变 分 ，免疫 绀 较对 照绀 ｝１Ｉｆ『邴 病 变 比例 降低 ４６．１６％。
一 、 试 验 材 料 与 方 法 １．试验 材 料 。猪 支原 体肺炎 弱 毒 活 疫 苗 （１６８株 ）ｍｔ南京 某 公 州提 供 ，产 批 号 ：ｌ６９１２０。 ２．试验 动物 。５～１０ Ｌｔ龄健康仔
肺部 病 变 分等
生 产 数 据 上 均 优 于 对 照 组 ， 川 ’『问 约 ３大 ，以 １ ２（） 兜 研 人
肺 部 病 变 比 例 呼分 ：每 组 各 选 育 肥 期 末 免疫 ｆｆ｛ 均 最 较 对 照 组 ２．５ 克饲 料 ，肥 料 ２． ／Ｔ‘屯 ，
取 ２０头 猪 进 行 屠 宰 ，剖 取 肺 脏 进 行 高 ７．０４千 克 ／头 ，育肥 期平 均 日增 重 免 疫 诸 只 育 Ｊｊ巴期 ＼？约 饲 料 成 小
猪支原体肺炎活疫苗_168株_的免疫效力研究_苏国东
后仍有 60% 以上免疫猪的肺部无病变。攻毒对照 组攻毒后 25 d 内和 25 d 后解剖表现猪支原体肺炎 的临床症状和典型的肺部病变，健康对照组没有表 现肺部病变。说明南京天邦生产的猪支原体活疫 苗（ 168 株） 和 北 京 中 海 的 支 原 体 肺 炎 活 疫 免 疫 5 ～ 7个月后均有 80% 以上的猪获得保护，两种猪支 原体活疫苗的免疫期至少在 6 个月以上，免疫保护 期没有明显差异。两种猪支原体肺炎活疫苗不同 免疫期的攻毒保护率见图 4 。
2． Nanjing Tianbang Bio － Industry Co． Ltd，Nanjing 211102，China）
Abstract： Three batches of Mycoplasma hyopneumoniae， live vaccine （ 168 strain ） were chosen for the experiment of immune efficacy and duration on healthy piglets． The comparison experiment of immune efficacy and duration with the similar vaccine was conducted simultaneously，and five batches of vaccines were done in the productive swine farm． The experiment results indicated that above 80% pigs vaccinated were protected when challenged with virulent Mhp 60 days after inoculation； three to five were protected when challenged 7 months， two vaccines have equal efficacy and the immune duration． The results of clinical observation and pathologic autopsy revealed immune protective rate is above 85% ． The above results demonstrated that the live Mhp vaccine has good immune efficacy． Key words： Mycoplasma hyopneumoniae，live vaccine； immune efficacy； immune duration
猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定
江西农业学报2012，24（11）：125 128Acta Agriculturae Jiangxi猪肺炎支原体168株特异性单抗的制备及鉴定王海燕，缪芬芳，冯志新，刘茂军，邵国青*收稿日期：2012－08－22基金项目：江苏省农业自主创新资金资助项目［cx （12）5047］。
作者简介：王海燕（1983─），女，江苏大丰人，硕士，助理研究员，主要从事动物疫病研究。
*通讯作者：邵国青。
（江苏省农业科学院兽医研究所、农业部兽用生物制品工程技术重点实验室、国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京210014）摘要：将猪肺炎支原体168株全菌蛋白免疫小鼠，取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合，3次亚克隆后，获得了4株针对168株全菌蛋白的单抗，分别将其命名为2F5、2G7、4F5、5E9。
Western －blot 检测结果表明，2G7、4F5与猪肺炎支原体具有特异性反应条带，不与猪鼻支原体、大肠杆菌反应。
亚型鉴定结果表明，两株特异性单抗(2G7、4F5)的亚型属IgG1，轻链为κ型，2F5、5E9亚型属IgG2a ，轻链为κ型。
间接免疫荧光结果表明，4株单抗均与猪肺炎支原体168株有特异性荧光反应，特异性单抗的获得为猪肺炎支原体的检测及机理研究奠定基础。
关键词：猪肺炎支原体;单克隆抗体;间接免疫荧光中图分类号：S858．28文献标识码：A文章编号：1001－8581(2012)11－0125－04Preparation and Identification of Monoclonal Antibodies against Mycoplasma hyopneumoniae Strain 168WANG Hai －yan ，MIAO Fen －fang ，FENG Zhi －xin ，LIU Mao －jun ，SHAO Guo －qing *(Institute of Veterinary Medicine ，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ;Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology ，Ministry of Agriculture ;National Center for Engineering Research of Veterinary Bio －products ，Nanjing 210014，China )Abstract :Balb /c mice were immunized with Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp )strain 168，and the splenocytes of the immu-nized mice were fused with SP2/0cells．After subcloning for 3times ，four hybridoma clones which produced Monoclonal Antibodies (McAbs )steadily were screened by ELISA ，named 2F5，2G7，4F5，and 5E9．The result of Western －blot indicated that 2G7and4F5both strongly specifically reacted with the Mhp strain 168．Both of the McAbs (2G7and 4F5)belonged to IgG1isotype ，and their light chains were κtype．However ，2F5and 5E9belonged to IgG2a isotype ，and their light chains were also κtype．They all reacted strongly with Mhp strain 168in immunofluorescence assay (IFA )．The McAbs could be used for the detection and pathogenic mecha-nism research of Mhp．Key words :Mycoplasma hyopneumoniae ;Monoclonal antibody ;Immunofluorescence assay猪支原体肺炎（Mycoplasma hyopneumoniae ，Mhp ），亦称猪地方流行性肺炎、猪气喘病，是一种接触性、慢性呼吸道传染病。
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猪支原体肺炎活疫苗（168株）的安全性研究刘茂军;苏国东;周勇岐;冯志新;王海燕;朱晓玮;邵国青【摘要】An experiment of susceptible piglets were used to evaluate the safety of a live vaccine on Mycoplasma hyopneumoniae （Mhp） through contact with vaccinated piglets, and five generations of virulence reversion experiment was also involved. The clinical assessment of the pigs vaccinated with one dose, one dose repetition and the high dose of the live vaccine were carried out, and five batch vaccines were done in the productive swine farm. The results demonstrated that the typical clinical symptoms and pathological changes were not observed in vaccinated piglets and cohabitated pigs with vaccinated pigs. In the test of five generations of virulence reversion experiment, Mhp 168 strain was identified from each generation back to pigs to pigs and there was no the typical clinical symptoms and pathological changes in all the pigs. Moreover, the typical clinical symptoms and pathological changes were vaccine, and five batches has good safety. not observed in the one dose, one dose repetition and the high dose of the live Mhp vaccines clinical experiments. All these results demonstrated that the live Mhp vaccine has good safety.%用健康易感仔猪进行同群感染试验和连续五代返强试验对猪肺炎支原体活疫苗（168株）进行安全性试验，同时也进行了该活疫苗单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗免疫商品猪的l临床试验。
结果发现，猪支原体肺炎活疫苗（168株）免疫猪后，免疫猪和同群感染猪均未观察到典型的临床症状和病理变化；连续五代返强试验，试验猪均未观察到典型的临床症状和病理变化，说明该疫苗株未出现返强。
单剂量、单剂量重复和大剂量试验及5批次疫苗的临床试验也未观察到不良反应。
这说明受试批次猪支原体肺炎活疫苗（168株）具有良好的安全性。
【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2012(046)007【总页数】4页(P1-4)【关键词】猪支原体肺炎活疫苗;安全性;毒力返强【作者】刘茂军;苏国东;周勇岐;冯志新;王海燕;朱晓玮;邵国青【作者单位】江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014／南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014／南京天邦生物科技有限公司,南京211102;江苏省农业科学院兽医研究所,农业部兽用生物制品工程技术重点实验室,国家兽用生物制品工程技术研究中心,南京210014【正文语种】中文【中图分类】S859.797猪支原体肺炎(Mycoplasma Pneumoniae of Swine，MPS)又称猪地方性肺炎，该病是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)引起的一种猪慢性呼吸道传染病，在全世界养猪国家和地区普遍存在，给养殖业造成了严重危害［1－3］。
疫苗预防是控制该病的主要手段［4］。
猪肺炎支原体168株是江苏省农业科学院兽医研究所连续传代培育而成的适应无细胞培养基(KM2)的弱毒株。
我们对该弱毒株的安全性进行了研究，确保该菌株疫苗的临床使用效果。
1 材料1．1 疫苗、培养基和试剂猪肺炎支原体168株(X+1)代(5×107 CCU/mL)和3批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由江苏省农业科学院兽医研究所保存。
5批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)(X+15)代由南京天邦生物科技有限公司制造。
猪肺炎支原体P46基因PCR引物由TaKaRa公司合成。
KM2培养基和兔抗猪肺炎支原体J株高免血清由江苏省农业科学院兽医研究所制备。
1．2 试验猪 5～15日龄猪75头，仔猪和哺乳母猪均为猪肺炎支原体IHA抗体阴性，来源于江苏省农科院猪场，饲养于江苏省农科院试验动物房，各组猪隔离饲养，饲喂无抗生素的饲料，饮用自来水。
120头商品猪来源于广东某猪场，一直饲养与该猪场。
2 方法2．1 感染性试验用猪肺炎支原体168株X代肺内注射接种5头5～15 d龄试验猪，每头1 mL，另5头不注射作为岗哨组。
在注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～4 d每日上午检测直肠温度;并于接种后连续逐日观察临床症状至剖杀前，主要观察观察是否有精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良症状。
在注射后第25 d剖杀所有猪，采集肺脏，检查是否存在组织病变。
肺病变指数按照28分评分法判定［5］。
2．2 毒力返强试验2．2．1 连续感染试验用2 mL猪支原体肺炎活疫苗(168株)X代右侧肺内接种5头5～15日龄试验猪，隔离单圈饲养25 d后，剖检试验猪，观察肺脏是否有胰样小叶性肺炎病变，并以无菌操作分别从5头猪右侧肺脏剪取注射部位周围肺组织约5～7 g剪成细块，混合研磨成糊状，加入含有1000单位/mL青霉素的Hank’s溶液，配制成5%肺悬液，当日再肺内接种到第二批5～15日龄健康易感猪5头，2 mL/头。
如此反复连续接种5代，观察每代次各接种猪临床症状和肺脏的病理变化。
2．2．2 菌株鉴定每代次剖杀的猪肺用P46 PCR方法进行检测，对猪支原体肺炎活疫苗(168株)菌体和第5次回归猪的PCR扩增产物进行序列分析［6，7］。
2．3 不同免疫剂量安全性试验 3批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内接种健康猪进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量接种各5头，分别注射1次1头份、间隔2周2次各注射1头份和1次10头份，每头份体积均为1 mL;对照组5头猪同时肺内接种1 mL生理盐水。
各组在当日注射疫苗前、注射后4 h以及注射后第1～3 d的每日检测直肠温度，并于接种后连续逐日观察临床症状至剖杀前。
接种后第25 d将试验猪全部剖杀，采集肺脏，对注射部位特别检查。
2．4 临床安全性试验用5批次猪支原体肺炎活疫苗(168株)在猪场进行免疫，每批次免20头，1头份/头，对照20头不免疫。
对免疫组和对照组的各猪只在免疫前、免后6 h和免后24 h抽样检测直肠体温，疫苗免疫后28 d内进行临床观察，观察是否有精神不振、食欲减退、呼吸困难、呕吐、俯卧、震颤等不良症状。
3 结果与分析3．1 感染性试验结果3．1．1 临床症状观察仔猪注射猪支原体肺炎活疫苗(168株)后25 d内，试验组和岗哨组的猪均表现正常，均未观察到精神不振、食欲减退、咳嗽、呼吸困难、俯卧、呕吐、震颤、死亡等不良反应。
提示猪支原体肺炎活疫苗(168株)对猪只的影响轻微，没有可观察到的临床症状发生。
3．1．2 注射后的体温变化在所有测温的时间点，试验组猪的直肠温度平均值与对照组的相差范围在0．5℃以内。
测得的每组平均直肠温度见图1。
3．1．3 大体病理观察在注射后25 d进行剖检，试验组与岗哨组均未观察到猪支原体肺炎病变。
提示该活疫苗免疫接种后未见眼观肺脏病变，也未引起同圈猪发生眼观肺脏病变。
图1 猪注射当日前后各时间的平均直肠温度3．2 毒力返强试验3．2．1 临床症状观察和肺脏剖检结果猪支原体肺炎活疫苗(168株)进行肺内注射猪后，用肺脏悬液连续5次毒力返强接种试验猪的临床观察、肺脏剖检结果见表1。
表1 连续5代毒力返强试验猪肺脏临床症状、肺脏病变结果返强试验代次猪数临床观察肺脏病变第1次返强试验 5表现正常，未见咳嗽、呼吸困难等典型症状。
肺脏正常，均未见有胰样小叶性肺炎第2次返强试验 5表现正常，未见咳嗽、呼吸困难等典型症状。
肺脏正常，均未见有胰样小叶性肺炎第3次返强试验 5表现正常，未见咳嗽、呼吸困难等典型症状。
肺脏正常，均未见有胰样小叶性肺炎第4次返强试验 5表现正常，未见咳嗽、呼吸困难等典型症状。
肺脏正常，均未见有胰样小叶性肺炎第5次返强试验 5表现正常，未见咳嗽、呼吸困难等典型症状。
肺脏正常，均未见有胰样小叶性肺炎猪支原体肺炎发病猪的典型症状表现为咳嗽、呼吸困难、气喘等［6］。
由上表可见，猪支原体肺炎活疫苗(168株)肺内注射易感猪均表现正常，未观察到该病的临床症状。
第2～5代连续返强试验接种时，接种猪也未见明显临床反应，病理剖检均未产生眼观典型的猪支原体肺炎病变。
对每代连续返强试验接种的肺组织均可检出猪肺炎支原体，第5代返强试验猪扑杀的分离物经代谢抑制试验鉴定为猪肺炎支原体。
连续5代返强试验的临床症状和大体剖检结果提示在5代次内该疫苗菌株毒力稳定，逐次传递没有返强迹象。
3．2．2 菌株分离和鉴定用该活疫苗(168株)肺内注射后的肺脏悬液连续5次接种试验猪，逐次剖取各批次猪的肺脏接种于KM2培养基后均分离获得的疑似猪肺炎支原体菌体，经代谢抑制试验鉴定均与猪肺炎支原体J血清型一致，因猪肺炎支原体仅有一个血清型，所以分离到的菌株为猪肺炎支原体。