两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较

两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果比较王全杰，刘洪斌，张智明，王彬，杨鹏欣，窦海燕，孟福强，丁国杰∗（哈药集团生物疫苗有限公司研发中心，哈尔滨１５００６９）［收稿日期］２０１４－０８－２５㊀［文献标识码］Ａ㊀［文章编号］１００２－１２８０（２０１４）１１－００１９－０５㊀［中图分类号］Ｓ８５９．７９＋７［摘㊀要］㊀为对比使用甲醛㊁二乙烯亚胺（ＢＥＩ）两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗对猪的呼吸道发病率㊁肺部病变记分㊁饲料转化率㊁日增重㊁以及猪血清抗体水平等指标的影响，将１２０头健康仔猪随机分成三个试验组和一个对照组，于７㊁２１日龄对试验组的仔猪进行疫苗接种，所有猪于２０㊁５０㊁８０及１４０日龄采血分离血清，检测血清中猪肺炎支原体抗体水平㊂结果显示，用ＢＥＩ灭活的疫苗在呼吸道发病率㊁肺部病变记分㊁饲料转化率㊁日增重㊁以及猪血清抗体水平等各项指标均好于甲醛灭活的疫苗（Ｐ＜０．０５），与进口疫苗无显著差异㊂试验表明，使用ＢＥＩ灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗的免疫效果好㊂［关键词］㊀灭活；二乙烯亚胺；甲醛；支原体；免疫效果作者简介：王全杰，硕士，从事动物疫苗研究通讯作者：丁国杰㊂Ｅ－ｍａｉｌ：ｄｉｎｇｇｕｏｊｉｅ１９７４＠１２６．ｃｏｍＣｏｍｐａｒｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＩｍｍｕｎｅＥｆｆｅｃｔｓｏｆＩｎａｃｔｉｖａｔｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅＶａｃｃｉｎｅｓｗｉｔｈＴｗｏＰｅｒｐａｒａｔｉｏｎＭｅｔｈｏｄｓＷＡＮＧＱｕａｎ－ｊｉｅ，ＬＩＵＨｏｎｇ－ｂｉｎ，ＺＨＡＮＧＺｈｉ－ｍｉｎｇ，ＷＡＮＧＢｉｎ，ＹＡＮＧＰｅｎｇ－ｘｉｎ，ＤＯＵＨａｉ－ｙａｎ，ＭＥＮＧＦｕ－ｑｉａｎｇ，ＤＩＮＧＧｕｏ－ｊｉｅ∗（ＨａｒｂｉｎＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＧｒｏｕｐＣｏ．，Ｌｔｄ，ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＶａｃｃｉｎｅ，Ｈａｒｂｉｎ１５００６９，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＴｈｅｉｍｍｕｎｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｗｏｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｖａｃｃｉｎｅｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅａｎｄｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ（ＢＥＩ）ｗｅｒｅｃｏｍｐａｒｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｉｎｃｉｄｅｎｃｅｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｄｉｓｅａｓｅ，ｌｕｎｇｌｅｓｉｏｎｓｃｏｒｅ，ｄａｉｌｙｗｅｉｇｈｔｇａｉｎ，ｆｅｅｄｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｒａｔｉｏａｎｄｐｏｒｃｉｎｅｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓ．１２０ｈｅａｌｔｈｙｐｉｇｌｅｔｓｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｔｈｒｅｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓａｎｄａｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｐｉｇｌｅｔｓｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｓｗｅｒｅｖａｃｃｉｎａｔｅｄａｔｔｈｅａｇｅｏｆ７ａｎｄ２１ｄａｙｓ．Ａｔ２０，５０，８０ａｎｄ１４０ｄａｙｓｏｆａｇｅ，ｗｅｓｅｐａｒａｔｅｄｂｌｏｏｄｓｅｒｕｍｏｆａｌｌｐｉｇｓ，ａｎｄｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｐｎｅｕｍｏｎｉａｉｎｓｅｒｕｍ．Ｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ＢＥＩｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｄｏｂｅｔｔｅｒｔｈａｎｔｈｅｆｏｒｍａｌｉｎｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｉｎｔｈｅａｓｐｅｃｔｓｏｆｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｍｏｒｂｉｄｉｔｙ，ｌｕｎｇｌｅｓｉｏｎｓｃｏｒｅ，ｄａｉｌｙｗｅｉｇｈｔｇａｉｎ，ｆｅｅｄｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒａｔｅａｎｄｐｏｒｃｉｎｅｓｅｒｕｍａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｃｏｍｐａｒｅｄＢＥＩｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｉｍｐｏｒｔｅｄｖａｃｃｉｎｅ，ｔｈｅｒｅｗａｓｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌｌｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ（Ｐ＜０．０５）．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｍｍｕｎｅｅｆｆｅｃｔｏｆｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｗｈｉｃｈｗａｓｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄｗｉｔｈＢＥＩｗａｓｂｅｔｔｅｒ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｎａｃｔｉｖａｔｅ；ｂｉｎａｒｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ；ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ；Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ；ｉｍｍｕｎｅｅｆｆｉｃａｃｙ㊀㊀猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，Ｍｈｐ）引起的一种慢性接触性呼吸道疾病，俗称喘气病［１］㊂感染猪慢性㊁持续干咳，其中育肥前期猪咳嗽最严重㊂该病能造成猪的日增重和饲料转化率等生产性能指标的明显下降，严重影响经济效益，同时还容易引起其他细菌病毒的继发感染，大幅增加治疗费用［２］㊂免疫接种猪肺炎支原体疫苗是防控该病的重要手段之一，接种疫苗可减少肺部损伤，提高料肉比及缩短出栏时间［３］㊂目前，猪支原体肺炎疫苗主要有弱毒疫苗和灭活疫苗，由于弱毒疫苗需要胸腔接种，操作困难，所以不易于推广普及㊂灭活疫苗通过肌肉注射进行接种，易于操作，同时生产工艺简单㊁使用安全㊁方便㊁易于保存，并能刺激动物产生高滴度抗体和显著的免疫保护效果［４］㊂在灭活疫苗的研制中，用到最多的灭活剂是甲醛，甲醛是比较传统的灭活剂，其主要通过对蛋白和核酸的烷化作用，使病毒丧失感染性［５］㊂二乙烯亚胺（ＢＥＩ）是另一类良好的病毒灭活剂，其作用原理是破坏微生物核酸，而不影响其蛋白质成分，并保持病毒抗原性［６］㊂本实验分别用ＢＥＩ和甲醛对猪肺炎支原体进行灭活并制备成疫苗，并设立进口疫苗作为对照，通过动物试验，比较两种灭活疫苗对支原体肺炎的抵抗能力㊂１㊀材料与方法１．１㊀材料１．１．１㊀试验动物㊀１日龄健康杜长大三元杂交仔猪１２０头（支原体肺炎母源抗体为阴性），由哈药集团生物疫苗有限公司实验动物中心提供㊂１．１．２㊀供试抗原及疫苗㊀猪肺炎支原体Ｐ－５７２２－３菌株抗原由哈药集团生物疫苗有限公司提供，猪支原体肺炎灭活疫苗（进口）由美国辉瑞公司生产㊂１．１．３㊀主要试剂㊀二乙烯亚胺（ＢＥＩ），购自ＦＬＵＣＡ公司；硫代硫酸钠购自Ａｌｆａ公司，甲醛，购自国药集团化学试剂有限公司；氢氧化钠，购自国药集团化学试剂有限公司；猪肺炎支原体ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒，由美国ＩＤＥＸＸ公司生产㊂１．２㊀方法１．２．１㊀灭活疫苗的制备㊀将检验合格的菌液（抗原浓度ȡ１０８ＣＣＵ／ｍＬ）分成两组㊂第一组为ＢＥＩ灭活组，向菌液中加入ＢＥＩ溶液至终浓度４ɢ，（３７ʃ２）ħ下搅拌培养至少２４ｈ㊂加入硫代硫酸盐溶液（最终浓度４ｍｍｏｌ／Ｌ），继续搅拌至少２４ｈ［７］；第二组为甲醛灭活组，向菌液中缓慢加入甲醛溶液至终浓度２ɢ，（３７ʃ２）ħ下灭活至少２４ｈ㊂半成品检验合格后，用磷酸缓冲盐水调整抗原浓度，并调ｐＨ至７．０ʃ０．２，加入佐剂后乳化㊂１．２．２㊀试验分组㊀将试验动物随机分成４组，３０头／组，Ａ组为ＢＥＩ灭活疫苗组，Ｂ组为甲醛灭活疫苗组，Ｃ组为进口疫苗组，Ｄ组为空白对照组㊂Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ组分别于７㊁２１日龄进行疫苗免疫，肌肉注射，２ｍＬ／头，Ｄ组注射同样剂量的生理盐水㊂所有试验猪按照常规饲养进行管理，仔猪于２８日龄断奶，７０日龄转入育肥舍㊂１．２．３㊀观察指标１．２．３．１㊀生产性能指标㊀注射疫苗后，分别于２８㊁７０㊁１５５㊁１８０ｄ称量猪体重，并记录饲养各个阶段饲料使用情况㊂计算并比较各组的日增重及料肉比情况㊂１．２．３．２㊀发病情况统计㊀在饲养的全程记录试验猪的发病情况，计算呼吸道发病率㊂呼吸道发病率＝呼吸异常猪的累计头数每组猪数ˑ观察天数㊂同时，在７５日龄时，每组随机抽取１０头猪进行宰杀，观察和记录每头猪的肺脏病变情况，通过５５分法［８］记分，计算肺炎减少率㊂肺炎减少率＝对照猪肺炎平均分－免疫猪肺炎平均分对照猪肺炎平均分ˑ１００％㊂１．２．３．３㊀抗体检测㊀每组随机抽取１０头试验猪，分别于２０㊁５０㊁８０㊁１４０日龄通过前腔静脉采血并分离血清，按照ＥＬＩＳＡ抗体检测试剂盒说明书进行检测，在波长为６５０ｎｍ处测量和记录样品和对照的吸光度值㊂检测结果的判定标准［９］：Ｓ／Ｐ＜０．３为阴性，Ｓ／Ｐ＞０．４为阳性，０．３ɤＳ／Ｐɤ０．４为可疑㊂２㊀结果２．１㊀猪生长各阶段平均体重及生产性能试验结果仔猪分别于出生后７日龄和２１日龄两次免疫猪气喘病疫苗，接种后免疫仔猪均无过敏反应，没有的临床异常反应，注射部位无肿块和异常反应㊂表明两种灭活疫苗对仔猪安全性良好㊂猪生长各阶段的平均体重见表１㊂表１㊀猪生长各阶段平均体重情况表组别灭活剂头数体重／ｋｇ初生２８ｄ７０ｄ１５５ｄ１８０ｄＡＢＥＩ３０１．５４６．７７１８．７４７０．３３１０１．３３Ｂ甲醛３０１．６２６．６５１７．９６６８．２３９８．８９Ｃ进口３０１．５９６．７５１８．５０６９．８９１００．４３Ｄ－３０１．５８６．４３１６．４４６１．３５８５．４４㊀㊀根据表１中的体重情况，计算出猪生长各阶段的日增重及料肉比，结果见表２㊂由表２可以看出，在哺乳期内（０ ２８ｄ）所有猪日增重相差不大；哺乳期至出栏前，Ａ组日增重均大于Ｂ组和Ｄ组，Ａ组与Ｃ组日增重差异不大㊂Ａ组和Ｃ组饲料转化率高于Ｂ组和Ｄ组㊂从全程来看，Ａ组的平均日增重为５５４．９ｇ，Ｂ组的平均日增重为５４０．４ｇ，Ｃ组的平均日增重为５４９．１１ｇ，Ｄ组平均日增重为４６５．９ｇ，Ａ组与Ｄ组差异显著（Ｐ＜０．０５），与Ｃ组差异不显著㊂Ｄ组料肉比为３．０７，Ｃ组料肉比为２．６８，Ｂ组料肉比为２．８３，Ａ组料肉比为２．６３，Ａ组较Ｂ组降低０．２０，与Ｃ组料肉比相当，由此可见，ＢＥＩ灭活疫苗组免疫猪经济效益较甲醛灭活组免疫猪要好㊂表２㊀猪生长各阶段的生产性能检测结果组别㊀㊀㊀０ ２８ｄ㊀㊀㊀㊀㊀㊀２８ ７０ｄ㊀㊀㊀㊀㊀㊀７０ １５５ｄ㊀㊀㊀㊀㊀㊀１５５ １８０ｄ㊀㊀㊀㊀㊀㊀全期㊀㊀㊀㊀日增重／（ｇ㊃ｄ－１）料肉比日增重／（ｇ㊃ｄ－１）料肉比日增重／（ｇ㊃ｄ－１）料肉比日增重／（ｇ㊃ｄ－１）料肉比日增重／（ｇ㊃ｄ－１）料肉比Ａ１８６．７８ａ－２８５．０６ａ１．５８５ａ６０６．９０ａ２．６１１ａ１２４０ａ３．２４１ａ５５４．９ａ２．６３ａＢ１７９．６４ａ－２６９．２９ｂ１．６８２ｂ５９１．４１ａｂ２．７３７ｂ１２２６．４ａ３．５８１ｂ５４０．４ｂ２．８３ｂＣ１８４．２９ａ－２７９．７６ａ１．６０４ａ６０４．５９ａ２．６２３ａ１２２１．６ａ３．２５９ａ５４９．１１ａ２．６８ａＤ１７３．３２ａ－２３８．３３ｂ１．８３３ｂ５２８．３５ｃ３．０３３ｃ９６３．６ｂ３．８７７ｂ４６５．９ｃ３．０７ｃ㊀㊀同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５），相同表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）２．２㊀试验猪的呼吸道发病率及免疫猪肺炎减少率７５日龄时，对照组的猪发生气喘性咳嗽，呼吸困难，并有明显的腹式呼吸，精神不振，免疫组未见上述症状，每组随机抽取１０头猪进行宰杀，观察肺部病变，结果对照猪出现典型的猪喘气病肺部病变，在肺脏心叶㊁尖叶㊁中间叶以及膈叶前１／３部位，出现大面积胰样病变，病灶部位切面多汁，猪肺炎记分平均分为１４．０；Ｃ组免疫猪肺部几乎没有病变，猪肺炎记分平均分为２．３，肺炎减少率为８３．５７％；Ｂ组免疫猪肺部病变情况明显较轻，只有小面积典型病变，猪肺炎记分平均分为６．７，肺炎减少率为５９．２８％；Ａ组免疫猪肺部仅有少量病变，猪肺炎记分平均分为２．５，肺炎减少率为８２．１４％，由此可见，Ａ组免疫效果要好于Ｂ组㊂㊀㊀试验猪约在１２０日龄时，每天观察咳嗽及喘气情况，１０ｍｉｎ／次，连续观察２１ｄ㊂结果Ａ组和Ｃ组免疫猪只有个别几头猪发生气喘性咳嗽，呼吸道发病率分别为０．９１％和１．０２％；Ｂ组免疫猪发生气喘性咳嗽的头数稍稍多些，呼吸道发病率为１．９０％；Ｄ组免疫猪发生气喘性咳嗽较多，呼吸道发病率为３．５％㊂结果见表３㊂表３㊀免疫猪肺炎减少率及呼吸道发病率检测结果组别各组猪肺炎记分几何平均分肺炎减少率／％呼吸道发病率／％Ａ２．５８２．１４０．９１Ｂ６．７５９．２８１．９０Ｃ２．３８３．５７１．０２Ｄ１４．０－３．５２．３㊀试验猪血清抗体的检测２．３．１㊀各组猪肺炎支原体抗体水平的比较㊀试验猪免疫支原体肺炎疫苗后，各组均产生不同水平的抗体，结果见表４㊂可以看出，２０日龄时，Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ三组的抗体水平差异不显著，各个免疫组与对照组的抗体水平差异不大；５０日龄时，免疫组的抗体水平均升高，Ａ组与Ｂ组抗体水平差异显著，Ａ组抗体水平高于Ｃ组，但差异不显著；８０日龄时，免疫组的抗体水平开始下降，但Ａ组抗体水平只是略有下降，均高于其他组，Ａ组与Ｂ组差异显著；１４０日龄时，免疫组抗体水平略有回升，Ａ组与Ｂ组抗体水平差异显著，Ａ组与Ｃ组抗体水平相当，各个免疫组与对照组的抗体水平差异较大㊂表４㊀试验猪肺炎支原体抗体水平检测结果组别平均ＯＤ６５０值２０日龄５０日龄８０日龄１４０日龄Ａ组０．２１２ʃ０．０１３ａ０．３８２ʃ０．０２７ａ０．３６５ʃ０．０３３ａ０．４０３ʃ０．０９３ａＢ组０．２０１ʃ０．０５７ａ０．２９１ʃ０．０６１ｂ０．２７３ʃ０．０２４ｂ０．３２９ʃ０．０３３ｂＣ组０．２０５ʃ０．０３１ａ０．３３７ʃ０．０３５ａ０．３０４ʃ０．０７８ａｂ０．３５８ʃ０．０６３ａＤ组０．１９１ʃ０．０４３ａ０．１９０ʃ０．０３５ｃ０．１７５ʃ０．０７４ｃ０．２１３ʃ０．０５２ｃ㊀㊀同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５），相同表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）２．３．２㊀猪肺炎支原体抗体阳性率变化规律㊀由表５可以看出，７日龄免疫猪肺炎支原体疫苗后，２０日龄时，免疫猪均有猪肺炎支原体抗体产生，其中Ａ组和Ｃ组阳转率较高；５０日龄时，由于二次免疫的作用，各个免疫组的阳性率快速上升，但是相对于Ａ组和Ｃ组，Ｂ组抗体阳性率较低；８０日龄时，免疫组抗体阳性率下降，Ａ组的阳性率由８０％下降到７０％，Ｂ组的阳性率由４０％下降到３０％㊂Ａ组和Ｃ组的阳性率差异不显著；１４０日龄时，所有试验组的阳性率均上升㊂Ａ组和Ｃ组的阳性率明显高于Ｂ组和Ｄ组㊂表５㊀各组猪血清抗体阳性率统计结果组别阳性率／％２０日龄５０日龄８０日龄１４０日龄Ａ组４０ａ８０ａ７０ａ８０ａＢ组２０ｂ４０ｂ３０ｂ４０ｃＣ组４０ａ７０ａ６０ａ８０ａＤ组０ｃ０ｃ０ｃ１０ｃ㊀㊀同列数据肩标小写字母完全不同表示差异显著（Ｐ＜０．０５），相同表示差异不显著（Ｐ＞０．０５）３㊀讨论与小结３．１㊀生产性能比较㊀为了更好的了解不同灭活方法对猪肺炎支原体灭活的影响，本实验用ＢＥＩ和甲醛两种灭活方法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗通过动物试验进行免疫原性比较㊂结果发现，ＢＥＩ灭活组免疫猪的日增重㊁饲料转化率和肺部病变减少率均好于甲醛灭活组免疫猪，和进口疫苗组的免疫效果差异不显著㊂空白对照组在７０ｄ后，日增重逐渐减少，同时大部分猪出现气喘性咳嗽，并出现腹式呼吸㊂甲醛灭活组个别免疫猪出现同样的症状㊂但是ＢＥＩ灭活组和进口疫苗组均健康存活㊂这一结果与曹建国等［１０］研究的结果相一致㊂对所有试验组呼吸道发病症状进行观察和统计，ＢＥＩ灭活组和进口疫苗组的呼吸道发病率低于甲醛灭活组，且与空白对照组差异显著㊂通过５５分法记分比较肺部病变，结果ＢＥＩ灭活组肺炎减少率在８０％以上，远远高出甲醛灭活组的５９．２８％，由此可见，用ＢＥＩ灭活的疫苗比用甲醛灭活的疫苗对猪的保护效果要好，能很好的抵御猪肺炎支原体的侵袭㊂３．２㊀抗体水平比较㊀在猪肺炎支原体免疫保护方面主要是以细胞介导的免疫力为主［１１］，但体液免疫力和粘膜免疫力也参与其中，值得一提的是，疫苗诱导产生的抗体水平和阻止病原移行及疾病发生之间联系不大，疫苗抗体水平不一定与保护正相关，只为参考性指标［１２］㊂本研究对免疫猪生长过程中各个阶段的抗体水平和抗体阳性率等指标进行了跟踪记录，在２０日龄时，所有试验猪的抗体水平均较低，并且差异不显著，这可能表明，在７日龄时注射的疫苗在此时还未能刺激机体产生较高浓度的抗体水平，这一试验结果与Ｖｉｌｌｓｒｒｅａｌ等［１３］报道的猪在接种疫苗３周后可检测到抗体的结果相似㊂从抗体水平和阳性率的数值上来看，ＢＥＩ灭活组和进口疫苗组的抗体产生差异不显著，均高于甲醛灭活组，并且甲醛灭活组的阳性率处于很低的水平，主要原因在于甲醛作用于病毒的表面蛋白，使病毒抗原的免疫原性降低，并阻碍其对病毒内部核酸的破坏作用［１４］，而ＢＥＩ主要破坏病毒的核酸，使病毒完全丧失感染力，而不损坏病毒的蛋白质衣壳，从而保留其保护性抗原，病毒的免疫原性几乎不被破坏［１５］㊂综上所述，ＢＥＩ灭活法制备的猪肺炎支原体灭活疫苗免疫效果及经济效益要好于甲醛灭活法㊂参考文献：［１］㊀于敏，王文军，李景鹏，等．猪肺炎支原体的研究近况［Ｊ］．畜牧兽医科技信息，２００３（８）：１４－１６．［２］㊀ＢａｒｂａｒａＥＳ，ＪｅｆｆｅｒｙＪＺ，ＤｏｉｄＪＴ，ｅｔａｌ．猪病学［Ｍ］．９版．赵德明，张仲秋，沈建忠，主译．北京：中国农业大学出版社，２００８：７９５－８１６．［３］㊀ＭｏｒｅａｕＩＡ，ＭｉｌｌｅｒＧＹ，ＢａｈｎｓｏｎＰＢ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＭｙｃｏｐｌａｓｍａｈｙｏ⁃ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅｖａｃｃｉｎｅｏｎｐｉｇｓｎａｔｕｒａｌｌｙｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈＭ．ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅａｎｄｐｏｒｃｉｎｅｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｄｒｏｍｅｖｉｒｕｓ［Ｊ］．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００４，２２（１７／１８）：２３２８－２３３３．［４］㊀张秀芳．灭活疫苗有哪些优点［Ｊ］．山西农业，２００３（１１）：４５．［５］㊀徐守振，尹燕博，王新．动物疫苗中常用抗原灭活剂的研究进展［Ｊ］．中国畜牧兽医，２０１０，９：１６２－１６７．［６］㊀赵本进，潘铙苘，陈晓清，等．二乙烯亚胺（ＢＥＩ）灭活猪细小病毒的试验报告［Ｊ］．上海畜牧兽医通讯，２００４，６：１９．［７］㊀魏晓露，刘婧，高菁霞，等．二乙烯亚胺灭活禽流感病毒的效果观察［Ｊ］．中国生物制品学杂志，２００８，２１（５）：３９５－３９７．［８］㊀中国标准出版社第一编辑室．动物防疫标准汇编［Ｍ］．北京：中国标准出版社，２００４：４７３－４７８．［９］㊀陆承平．兽医微生物学［Ｍ］．中国农业出版社，２００１：１７７－１７９．［１０］曹建国，张云台，赵芳根，等． 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