分析化学第20章毛细管电泳法

第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
在CZE中，常用于毛细管电泳的缓冲溶液有硼砂、磷酸盐、 柠檬酸盐、琥珀酸盐和醋酸盐等。
缓冲体系的pH值要求与样品的性质有关，通常酸性组分的
分离选择在碱性条件下进行，而碱性组分则选择酸性介质分离， 蛋白质、多肽、氨基酸等两性物质，可选酸性(pH2)也可选碱性 (pH>9)分离介质。糖类样品通常在pH9~11之间能获得最佳分离， 羧酸或其它样品多在pH5~9之间选择分离条件。

毛细管电泳分离柱效方程
从分离柱效方程可知：
（1）分离电压V↑, n↑ （2）V一定时，Ld/L ↑, n↑
（3）扩散系数D↓, n↑；大分子的D小，故CE对大分子分离柱效高。
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
（二）引起区带展宽的因素
1.分子扩散 2.焦耳热
电流通过毛细管中的电解质溶液时会 产生焦耳热，使毛细管内及周围温度分布。 由于毛细管柱中沿径向存在一个抛物 线型的温度梯度，由此引起介质的粘 度在径向上的梯度分布，进而引起径 向上的电泳速度梯度。


2
Ld H n
物质在毛细管中的保留时间为：
tm
Ld LLd uap apV
Ld为毛细管柱进样端至检测窗口的距离（有效长度）
L2 n d σ2
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
L n σ
2 d 2
σ 2 2 Dtm
n
μ apVLd 2 DL
Ld LLd tm uap apV
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
高效毛细管电泳
经典电泳法散热差，分离电压受到限制。 1981年，Jorgenson和Lukacs发表了在毛细管电泳发展史上具有划时代 意义的工作，他们采用75μm内径的石英毛细管做为分离室，紫外柱上
检测的方法，在30kv的分离电压下分离丹酰化氨基酸，柱效达到40万
个理论塔板。他们的工作为毛细管电泳的发展奠定了基础。

在缓冲液中加入有机添加剂，如甲醇、 异丙醇等，或水溶性高分子物质，对
EOF也有较显著的抑制作用。
第二十章 二 . 电泳

毛细管电泳法
仪器分析
电泳（electrophoresis）是指溶液中带电粒子（离子）在电场 中定向移动的现象。
电泳迁移速度 uep 为：

uep ep E ep
再换具有不同碳链长度或结构的其它阴离子表面活性剂。若结果 仍不好，应考虑使用阳离子或中性、两性表面活性剂，如CTAB （十六烷基三甲基溴化铵）、Triton
表观淌度 正离子 中性分子 μeff+μos μos 表观迁移速度 ueff+ uos uos
负离子
μeff-μos
ueff - uos
由于电渗流速度大大高于电泳速度，所以，不管正离子、负离子还 是中性分子，均随电渗流移动。
第二十章 四、分离效率和谱带展宽
（一）理论板数和板高
毛细管电泳法
仪器分析
tm n 5.54 W 1/ 2



第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
表面活性剂选择时应考虑以下因素：

（1）经济易得


（2）水溶性好
（3）紫外吸收背景越低越好 （4）不与样品发生破坏性作用 （5）所形成的胶束足够稳定
第二十章

毛细管电泳法
仪器分析
碳链较短的阴离子表面活性剂为优先选择对象。SDS易得、紫外
吸收低，最为常用。如经浓度、缓冲溶液及pH优化，分离仍不佳，
V L
式中
－电泳迁移率（电泳淌度） ep
（electrophoresis mobility)（m2/V.s） V－毛细管柱两端施加的电压, L－毛细管柱长
△在空心毛细管中一个粒子的淌度可近似表示为：
i ep 4
第二十章
三、表观淌度
毛细管电泳法
仪器分析
uap ueff uos （eff os ) E

第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
一、毛细管区带电泳（CZE）
毛细管电泳最基本的分离模式。背景电解质是缓冲液，分离是基于样品 中各个组分间质荷比的差异。有时需在缓冲液中加入一定的添加剂，用 以提高分离选择性，改变电渗流的大小、方向或抑制毛细管壁的吸附等。 在CZE中，影响分离的操作条件为：
为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和
分离度。硼酸盐缓冲体系也适用于其它含邻羟基或多羟基 的化合物分离。
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
为了选择合适的pH值，需要pH调节剂调整介质的酸碱性。 由于多数缓冲试剂属酸性物质，如磷酸，所以pH调节剂主要是 碱类，常用的pH调节剂有NaOH、KOH、Tris等。有时也可考虑 用胺或醇胺等有机碱，如乙醇胺、乙二胺。如果缓冲试剂为碱类， 则可用酸作为调节剂，尽量使用弱酸，如 H3PO4。 缓冲剂及调节剂的浓度对改善分离、抑制吸附、控制焦耳热 等均有影响，一般缓冲试剂的浓度控制在 10 ～ 200mmol/L ，有 时为了抑制蛋白质等的吸附作用，可用高达 500mmol/L 的浓度 （此时应减少分离电压）。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼酸 盐等，一般控制在 20mmol/L，电导小的缓冲试剂如硼酸其浓度 可在100mmol/L以上。
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
缓冲液pH对电渗流的影响
阳离子型的表面活性剂使电渗流 发生反转
a.无表面活性剂存在；b．阳离子表 面活性剂在毛细管壁表面的吸附， 抵消了原来的负电荷，使电渗迁 移率0；c.继续增大阳离子表面活 性剂的浓度，阳离子表面活性剂 分子通过非极性链疏水相互作用， 在毛细管柱表面形成双分子层， 使电渗流反转. 随着pH的增大，石英管壁表面的硅羟基 解离度增加，界面有效电荷密度增大， EOF随之增大。
扩散层。
第二十章

毛细管电泳法
仪器分析
在电场作用下，固液两相间的相对运动发生在紧密层与扩散层之间的 滑动面上。 由于离子的溶剂化作用，当形成扩散层的离子在电场中移动时，携带 着液体一同移动，因此产生电渗流（electroosmotic flow,EOF）
HPLC由于压差产生抛物线型的流体流速轮廓。电渗流的流速轮廓 是一个平面，在毛细管中如同瓶塞一样流动，不存在径向的流速梯 度。这是毛细管电泳分离柱效高于HPLC的原因之一。
第二十章 五、分离度

毛细管电泳法
仪器分析
分离度是指将淌度相近的组分分离的能力
R 2(tm 2 tm1 ) tm 2 tm1 W1 W2 4
分离度也可表示为柱效的函数：
n u R 4 u
VLd 1/ 2 R eff ［ ］ DL（eff os） 4 2 1
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
3.吸附
产生原因：
（1）阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用
（2）疏水作用。
对于生物大分子，如碱性蛋白和多肽等，吸附严重时可能导致测不
到信号。因此，生物大分子分析时常需用涂层处理的毛细管柱。
4.进样 5.电泳
（过载）
样品区带与周围电解质溶液间的电导率差，从而导致峰形展宽。
讨论：分离度是下列因素的函数：①外加电压V；②有效柱长与总 长度之比（Ld/L）；③电泳有效淌度差；④电渗淌度
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
第三节

毛细管电泳的主要分离模式
毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE） 胶束电动色谱（micellar electrokinetic chromatography, MEKC) 毛细管凝胶电泳（capillary gel electrophoresis, CGE) 毛细管等速电泳（capillary isotachophoresis, CITP) 毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focus, CIF) 毛细管电色谱（capillary electrochromatography, CEC)
液体沿固体表面移动的现象。电渗与固液两相界面的双电 层有着密切关系。 电渗速度uos以下式表示：
os uos os E E 4
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析

石英毛细管壁上的硅羟基在水 溶液中发生电离，所产生的
SiO-负离子使毛细管壁带负电
荷。溶液中的抗衡离子靠静电 吸附和分子扩散在固液界面上 形成双电层（electric double layer)，双电层包括紧密层和
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
如果缓冲体系经各种参数优化后仍无法给出良好的分离结果， 可以加入添加剂以改善分离。添加剂种类较多：
1.无机电解质（NaCl、KCl）
2.有机溶剂（如甲醇、乙腈） 3.非电解质高分子（纤维素、多糖、聚乙烯醇、Triton X-100) 4. 功能性添加剂（手性冠醚、环糊精等）
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
第一节 概述
电泳（Electrophoresis)是指溶液中带电粒子在电场的作用下向与自 身带相反电荷的电极移动的现象。将电泳发展成为分离技术应归 功于Tiselius的工作。他于1937年建立“移界电泳（moving boundary electrophoresis)”，成功地将人血清中的蛋白质分为白蛋 白、α、β、和γ球蛋白，这项工作成为蛋白质化学发展的基础，因 此Tiselius本人荣获1948年诺贝尔化学奖。
第二十章
毛细管电泳法
仪器分析
二、胶束电动色谱（MEKC）
在缓冲溶液中加入离子型表面活性剂（如SDS），当表面活性剂浓度超过 其临界胶束浓度时，则形成亲水胶束，胶束具有疏水内核, 外层带负电荷。 溶质分子则在极性缓冲液与胶束中心的非极性相（假固定相）之间有一定的 分配。中性分子因其本身疏水性不同，在两相中分配存在差异。在电渗流作 用下，胶束携带溶质一起前行，疏水性强的溶质和胶束结合得较牢，流出慢。 不同分子在两相中的分配差异是MECC分离的基础。