常见病原性真菌鉴定
PCR-RFLP和多重PCR技术检测常见病原性丝状真菌的实验研究
２１ ０ ０年 ４月 第 ５卷 第 ２期
Ｃ ｉ ＪＭ ｈｎ ・Fra bibliotek论 著 ・
Ｐ ＲＲ Ｌ Ｃ ．Ｆ Ｐ和多 重 Ｐ Ｒ技 术 检测 常见 病 原性 Ｃ 丝 状 真菌 的实 验研 究
张 晓利 吕雪莲 沈永年 吕桂 霞 王 淼淼 葛 一平 刘维达
（． １ 中国 医学科 学 院皮肤 病研 究所 ， 南京 ２０４ ；． １０ ２２ 大连 皮肤 病 医院 ， 大连 １６ １ ） １０ １
【 关键词】 丝状真菌 ；Ｃ ．Ｆ Ｐ 多重 Ｐ Ｒ； Ｐ ＲＲ Ｌ ； Ｃ 分子鉴定
【 中图分类号】 Ｒ３９６ Ｒ３９９ ． ７ ． ７
【 文献标识码】 Ａ
【 文章编号 】 １７ — ２ （００ ０－１５ ４ ６３ ８７ ２１）２００ － ３ ０
Ｅｘ ｒｍ ｅ ａ ｎ ｅ ｔｇ ｔｏ ｎ ｔ ｔ ｃ ｉ ｎ ｏ ｔ ｏ ｅ ｉ ｏ ｄ ｐｅ ｉ ｎｔ ｌｉ ｖ ｓｉ ａ ｉ ｎ ｏ ｈｅ ｄｅ ｅ ｔｏ ｆｐａ ｈ ｇ ｎ ｃ ｍ ｌ ｓ ｂｙ ＰＣＲ－ ＲＦＬＰ ｎｄ ｍ ｕ ｔｐｌｘ ＰＣＲ ａ ｌｉ ｅ
真菌检测
真菌检测
1.21毒性检测病原性检测
真菌鉴定真菌菌落特征检测
真菌（Fungus）是一种真核生物。
最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母。
现在已经发现了七万多种真菌，估计只是所有存在的一小半。
大多真菌原先被分入动物或植物，现在成为自己的界，分为四门。
真菌自成一门，和植物、动物和细菌相区别。
真菌和其他三种生物最大的不同之处在于，真菌的细胞有含甲壳素为主要成分的细胞壁，和植物的细胞壁主要是由纤维素组成的不同。
检测项目：
形态特征检测
传统真菌鉴定方法主要按照真菌的形态特点、生理生化特征进行分类。
由于真菌的种类繁多，有时同一株真菌在不同生长条件下呈现出完全不同的形态，给真菌分类带来较大困难。
真菌rDNA上的5.8s，18s和28srDNA序列高度保守，而ITS序列由于选择压力小，在自然中变异较快，在绝大多数真菌中表现出序列多态性，表现为种内相对一致，种间差异比较明显，非常适合真菌鉴定以及系统发育分析。
由于ITS鉴定快速，分析准确，有效弥补了传统鉴定方法的不足，得到了广泛应用。
科标生物为您提供的真菌鉴定服务采用独有真菌DNA提取技术，能对难以裂解的真菌进行高效DNA提取，极大提高菌种鉴定的成功率。
我们的服务包括真菌基因组提取，ITS 序列扩增纯化，序列分析比对和相近菌种系统发育树构建。
科标生物检测中心从事饲料、土壤肥料、微生物及生物制剂、化妆品及日化用品、木材及木制品、其他生物材料等生物相关产品的性能测试、成分分析以及配方研发等工作。
09。
微生物学 真菌 常见病原性真菌
•申克孢子丝菌：属腐生性真菌，经皮肤微小创口侵入。可引 起孢子丝菌下疳及深部感染。
三、新生隐球菌
• 在自然界分布广泛； • 也存在于人体 的体表、口腔和粪便中； • 大量存在于干燥的鸽粪中； • 外源性感染，肺是主要入侵途径，多数症状不明显，
能自愈；有的引起支气管肺炎；严重肺呈暴发性感染， 死亡； • 经血行传播至中枢神经及其它组织，引起慢性脑膜炎。源自四、白假丝酵母菌（白色念珠菌）
1、白色念珠菌是最常见的条件致病性真菌。 2、皮肤粘膜感染 ： 鹅口疮，阴道炎。 3、内脏感染：肺炎、关节炎、膀胱炎，肾盂肾炎。 4、中枢神经感染：脑膜炎、脑脓肿。
常见病原性真菌
一、皮肤癣真菌
引起皮肤浅部感染，具有嗜角质蛋白特性，侵犯部位： 角化的表皮，毛发，指（趾）甲。一种皮肤癣菌可在不同 部位引起病变相同部位的病变也可由不同的皮肤癣菌引起。
指（趾）甲 皮肤 毛发
毛癣菌
+
+
+
皮肤癣菌属
+
+
-
小孢子癣菌属
-
+
+
二、皮下组织真菌感染
• 着色真菌：感染发生在暴露部位，病损皮肤变 黑，称着色真菌病。
常见病原性真菌
第十九章常见病原性真菌
第一节皮肤感染真菌：侵犯人或动物体表角质组织的真菌（皮肤癣病，角层癣菌）
侵犯角化的皮肤、毛发、指（趾）甲；所致疾病：癣
浅部真菌致病特点：1、途径：接触传染；
2、一种癣病可由多种癣菌引起；
3、一种癣菌可引起多种癣病；
4、一般无疤痕（除黄癣菌所致头癣）
第二节深部感染真菌：多为内源性；多侵犯皮肤深层、深部组织、内脏；多继发慢性、消耗性疾病。
（致死原因）
一、新生隐球菌
1、半数继发于白血病、何杰金病、艾滋病
2、在自然界广泛，如土、鸽粪
3、单细胞，圆形
4、传染方式：吸入孢子、内源性
5、所致疾病：肺隐球菌病、隐球菌脑膜炎
6、微生物学检查：1）直接镜检；2）荚膜多糖抗原
二、白色念珠菌
1、单细胞，革兰阳性，属条件致病菌
2、健康人口腔、上呼吸道、肠道阴道有此菌
3、致病条件：免疫功能下降、菌群失调
4、所致疾病：1）粘膜：鹅口疮、口角炎、外阴、阴道炎
2）皮肤：指间糜烂症
3）内脏：（1）支气管肺念珠菌病；（2）中枢神经系统念珠菌感染；（3）肠炎、脑膜炎
5、微检：直接镜检
真菌中毒
有毒真菌：如磨菇类
真菌毒素中毒：无传染性，一般药物与抗生素治疗无效，与特定食物、饲料、农作物有关主要侵害肝、肾、神经系统
致癌性真菌（如黄曲霉素）。
实验11真菌的病原性检测
学习如何进行真菌分离和培养
学习真菌分离和培养的基本操作技术，包括样品采集、处理、接种和培养条件控 制等。
掌握不同类型真菌的分离和培养特点，以便在实际工作中能够准确地进行分离和 鉴定。
掌握真菌的形态学特征和分类鉴定
掌握常见病原性真菌的形态学特征，包括菌落形态、菌丝、孢子和产孢结构等。
学习真菌分类鉴定的基本原理和方法，包括形态学特征、生化反应和分子生物学技 术等。
了解不同病原性真菌的流行病学特征和临床意义，以便在实际工作中能够准确地进 行鉴定和诊断。
02 实验原理
真菌的病原性检测原理
01
02
03
直接镜检
通过显微镜观察真菌形态， 初步判断是否为病原体。
分离培养
将疑似病原体真菌接种在 选择性培养基上，观察其 生长情况，判断是否具有 病原性。
鉴定
根据真菌的形态学特征、 生长特点及生化反应等， 对病原体进行鉴定和分类。
实验结果
成功分离出多种真菌，并对其进行了鉴定和病原 性检测。
ABCD
实验方法
采用组织分离法、涂片法、培养法等手段，对疑 似感染真菌的组织样本进行处理和分析。
实验结论
根据实验结果，得出不同真菌的病原性强弱，为 后续治疗提供了依据。
结果分析讨论
1 2 3
病原性分析
实验结果显示，某些真菌具有较强的致病性，如 念珠菌属和曲霉菌属。这些真菌在免疫低下人群 中易引起严重的感染症状。
样本处理
将采集的样本进行清洗、去污、 分离等处理，以备后续实验使用 。
真菌分离与培养
培养基制备
根据实验需求，制备适合真菌生长的培养基。
接种与培养
将处理后的样本接种到培养基上，在适宜的温度和湿度条件下进行培养。
几种真菌的分离与鉴定
常见真菌得分离与鉴定病原真菌得一般特性真菌(Fｕnｇi)就是微生物中得一个大类,就是一群数目庞大得细胞生物,估计全世界已有记载得真菌有10万种以上、它们得子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征就是具有真正得细胞核,产生孢子与不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其她都有分支或不分支得丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其她葡聚糖)或几丁质得微纤维或两者兼有得细胞壁得有机体。
对人类与动物致病得真菌大约100余种,属于病原真菌。
一、基本性状(一)形态结构真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yｅaｓt)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(ｍold)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)得不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在3７℃或体内呈单细胞得酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌、真菌得细胞结构与一般植物细胞相似,有定型得细胞核及完善得细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而就是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。
1.菌丝(Hypｈa) 真菌在合适得环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。
芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。
菌丝继续生长并生长分枝,增殖得菌丝交织组成菌丝体。
其中一部分菌丝深入被寄生得物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体、另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。
气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。
菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。
主要见于病原性真菌。
很多非病原真菌得菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。
有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝、2.孢子生成孢子就是真菌扩大繁殖得一种方式。
植物病原真菌的鉴定方法
植物病原真菌的鉴定方法植物病原真菌是导致植物疾病的主要原因之一，对其进行准确的鉴定可以帮助农民和植物病理学家采取正确的防治措施。
本文将介绍常用的植物病原真菌鉴定方法。
一、外部形态鉴定法外部形态鉴定法是最常用的真菌鉴定方法之一。
通过观察真菌的菌丝、孢子、子实体等形态特征，可以初步确定其属种。
一般可以从患病植物的病斑、病果或病茎中采集样本，将其放置在玻璃片上，加入适当的溶液后，在显微镜下观察和测量其形态特征，比如颜色、形状、大小等。
二、组织学鉴定法组织学鉴定法主要是通过显微镜下观察真菌在植物组织中的生长和病变情况，从而确定其病原性和感染方式。
常用的方法包括石蜡切片法和组织分离培养法。
石蜡切片法是将植物组织固定在石蜡中，然后用切片机将其切成薄片，再染色并观察。
组织分离培养法是将植物组织切碎，然后将其接种到适当的培养基上，观察真菌的菌丝和孢子的生长情况。
三、生物学鉴定法生物学鉴定法是通过观察真菌在不同培养基上的生长特性、菌丝和孢子的形态特征以及生殖方式等，来确定其属种。
常用的生物学鉴定方法包括培养特性观察法、生殖器官观察法和生理生化特性观察法。
培养特性观察法是将真菌接种到不同培养基上，观察其生长速度、菌落形态和色素产生情况。
生殖器官观察法是观察真菌的生殖器官，如子实体、子囊盘和拟囊等，以确定其属种。
生理生化特性观察法是通过观察真菌在不同培养条件下的生理生化特性，如温度和pH值对其生长的影响，以及酶特性等。
四、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是一种较为准确的真菌鉴定方法，通过分析真菌的DNA序列来确定其分类地位。
常用的分子生物学鉴定方法包括PCR方法和序列分析方法。
PCR方法是在真菌DNA中选择特异的基因片段进行扩增，并通过电泳检测扩增产物的大小和形态，从而确定真菌的分类。
序列分析方法是通过测定真菌DNA序列，与数据库中已知真菌的序列进行比对，从而确定其物种分类。
植物病原真菌的鉴定方法有外部形态鉴定法、组织学鉴定法、生物学鉴定法和分子生物学鉴定法等。
病原性真菌
18
第二节
皮下感染真菌 地方性流行真菌
19
皮下感染真菌
种 类：着色真菌 孢子丝菌 侵入途径：外伤
感染部位：局部，也可扩散至周围组织 扩 散：着色真菌：血行或淋巴管 孢子丝菌：淋巴管
20
申克孢子丝菌 (Sporotrix schenckii)
腐生性、双相型
培养： 沙保弱培养基（25℃）：灰褐色皱膜状菌落 含胱氨酸血平板（37℃）：芽生方式形成酵母型 菌落 形态特征：分隔菌丝，成群梨形小分生孢子
27
4.马尔尼菲青霉（Penicillium marneffei） 东南亚部分地区最常见 感染：广泛性、播散性，多见于AIDS病人 形态特征： 菌落：淡黄白绒毛状，后棕红色，有皱褶， 可产生玫瑰红色色素。 菌丝相(25℃)：帚状枝分散，双轮生，稍不对称， 瓶梗顶端变窄，分生孢子球形，链状排列。 酵母相(37℃)：圆形或长方形关节孢子。
13
犬小孢子菌菌落 犬小孢子菌大分生孢子（400×）
14
石膏样小孢子菌分生孢子（400×）
15
皮肤癣菌的种类、侵犯部位及传染源
种 数 1 感染部位 皮肤 毛发 甲板 + + 人 絮状表皮癣菌 传染源 动物 无
真菌 种类 表皮癣 菌属
小孢子 菌属
毛癣 菌属
15
20
+
+
+
+
+
奥杜安小孢子菌
石膏样毛癣菌 红色毛癣菌
犬小孢子菌 石膏样小孢子菌
石膏样毛癣菌
16
角层癣菌
腐生于表皮角质或毛干表面 病原性真菌： 秕糠状鳞斑癣菌（Malassezia furfur） 何德毛结节菌(Pieria hortai)
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微生物学检验
《微生物学检验》
国家卫生和计划生育委员会规划教材
《微生物学检验》
第十五章 常见病原性真菌鉴定
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本章内容
1 第一节 浅部感染真菌 2 第二节 深部感染真菌
学习目标及重点
学习目标： • 掌握 毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子癣菌属生物学特性和
微生物学检验；白假丝酵母菌、隐球菌生物学特性和微生 物学检验 • 熟悉熟悉深部感染真菌的临床意义 • 了解其他真菌的生物学特性和微生物学检验 本章重点： ★毛癣菌属、表皮癣菌属、小孢子癣菌属学特性和微生物学检 验 ★白假丝酵母菌、隐球菌生物学特性和微生物学检验
絮状表皮癣菌菌落
絮状表皮癣菌菌落
絮状表皮癣菌大分生 孢子、厚膜孢子
第一节 浅部感染真菌
2.毛癣菌属：常见的致病菌有红色毛癣菌、紫色毛癣菌、 须毛癣菌、断发毛癣菌和许兰毛癣菌
红色毛癣菌菌落正面 红色毛癣菌菌落背面
紫色毛癣菌菌落
第一节 浅部感染真菌
2.毛癣菌属：
须毛癣菌菌落
断发毛癣菌菌落
许兰毛癣菌菌落
荚膜组织胞浆菌菌落（25℃ ）
荚膜组织胞浆菌大分生孢子
第二节 深部感染真 菌
（四）卡氏肺孢菌
姬姆萨染色，可见孢囊内的8个孢子；亚甲胺蓝染色 ，孢囊囊壁呈深褐色或黑色，孢子不着色。 是条件 致病菌，引起卡氏肺孢菌性肺炎。
Giemsa染色，卡氏肺孢 亚甲胺兰染色，卡氏肺孢菌包囊 菌包囊
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第二节 深部感染真 菌
（一）曲霉
曲霉可引起呼吸系统曲霉病、全身性曲霉病。
肺曲霉瘤
肺曲霉病痰涂片
第二节 深部感染真 菌
（二）毛霉
在沙保培养基上形成丝状菌落，镜下可见孢子囊梗 、孢子囊、孢子囊孢子。引起毛霉病
毛霉菌落
孢子囊与孢子囊孢子
第二节 深部感染真 菌
（三）荚膜组织胞浆菌
是一种侵犯单核─吞噬细胞系统的双相型真菌。在 沙保培养基上25℃培养形成丝状菌落，镜下可见特 征性的齿轮状大分生孢子。
第一节 浅部感染真菌
2.毛癣菌属：显微镜下可见大分生孢子、小分生孢子； 菌丝形态多样
红色毛癣菌大分生 孢子
红色毛癣菌小分生 孢子
紫色毛癣菌菌丝
第一节 浅部感染真菌
2.毛癣菌属：
须毛癣菌大、小分 生孢子
断发毛癣菌小分生孢 子及菌丝
许兰毛癣菌菌丝
第一节 浅部感染真菌
3．小孢子癣菌属：常见的致病菌有铁锈色小孢子菌、石 膏样小孢子菌、犬小孢子菌等
（二）申克孢子丝菌
25 ℃培养，形成丝状菌落，镜下可见分枝菌丝及小 分生孢子。
申克孢子丝菌菌落
申克孢子丝菌小 分生孢子
第一节 浅部感染真菌
（二）申克孢子丝菌
37 ℃培养，形成酵母型菌落，镜下可见梭形孢子。
申克孢子丝菌菌落
申克孢子丝菌孢子
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第二节 深部感染真 菌
一、白假丝酵母菌
（一）生物学特性 在沙培养基上呈类酵母型菌落，菌体呈圆形或卵圆形，G+ ，可形成假菌丝、厚膜孢子。
新型隐球菌菌落
新型隐球菌荚膜
第二节 深部感染真 菌
（二）微生物学检验
1．标本采集 脑脊液、痰液、尿液、脓汁等。 2．检验方法
♦直接镜检 ♦分离培养 ♦鉴定试验 ：酚氧化酶试验、脲酶试验、糖同化及发酵试验 。 ♦其他检测 ♦药敏试验
第二节 深部感染真 菌
（三）临床意义
经呼吸道侵入人体，引起肺部感染。由肺经血行播 散时可引起亚急性或慢性脑膜炎
第一节 浅部感染真菌
二、表面感染真菌
秕糠马拉癣菌：侵犯皮肤角质层可引起皮肤表面出现黄 褐色的花斑癣。镜下可见腊肠样有隔菌丝和圆形厚壁孢 子
花斑癣
秕糠马拉癣菌菌、皮下组织感染真菌
（一）着色真菌 经破损皮肤而感染，引起病损的皮肤变黑，产生着 色真菌病
着色真菌病
第一节 浅部感染真菌
白假丝酵母菌菌落 芽生孢子与假菌丝
假菌丝与厚膜孢子
第二节 深部感染真 菌
（二）微生物学检验
1．标本采集 分泌物、痰、尿、粪、血或脑脊液等
2．检验方法 ♦直接镜检 ♦分离培养 ♦鉴定试验：芽管形成试验、厚膜孢子形成试验、TTC 试验、糖同化或发酵试验
第二节 深部感染真 菌
（二）微生物学检验
芽管形成试验
♦其他检测 ♦药敏试验
厚膜孢子形成试验
显色培养基
第二节 深部感染真 菌
（三）临床意义
可引起：①皮肤假丝酵母菌病；②黏膜假丝酵母菌病；③内
脏假丝酵母菌病；④中枢神经系统白假丝酵母菌病。
指间念珠菌病
鹅口疮
第二节 深部感染真 菌
二、新型隐球菌
（一）生物学特性
墨汁负染色后，可见圆形或卵圆形菌体，外周有宽厚荚 膜，形成酵母型菌落
肺新型隐球菌感染
第二节 深部感染真 菌
三、其他重要真菌
（一）曲霉
在沙保培养基上形成丝状菌落，由于产生分生孢子 而渐呈现不同颜色
烟曲霉菌落
黄曲霉菌落 黑曲霉菌落 构巢曲霉菌落 土曲霉菌落
第二节 深部感染真 菌
（一）曲霉
镜下可见菊花样的分生孢子头，因菌种不同而呈不同颜
色
烟曲霉
黄曲霉
黑曲霉
构巢曲霉
土曲霉
铁锈色小孢子菌菌落
石膏样小孢子菌菌落
犬小孢子菌菌落
第一节 浅部感染真菌
3．小孢子癣菌属：镜下可见菌丝、厚壁梭形大分生孢子
铁锈色小孢子菌 菌丝
石膏样小孢子菌大 分生孢子
犬小孢子菌大分生孢子
第一节 浅部感染真菌
（二）微生物学检验
1．标本采集 采集皮屑、甲屑、病发 2．检验方法
♦直接镜检：查找菌丝和孢子 ♦分离培养与鉴定：观察菌落颜色和形态；毛发穿 孔试验、脲酶试验和特殊营养需要试验
第一节 浅部感染真菌
一、皮肤癣真菌
分表皮癣菌属、毛癣菌属和小孢子癣菌属3个属，可侵犯 皮肤、指（趾）甲和毛发，引起人类的体癣、股癣、手癣、足 癣、甲癣、头癣等
体癣
股癣
手癣
第一节 浅部感染真菌
一、皮肤癣真菌
足癣
甲癣
头癣
第一节 浅部感染真菌
（一）生物学特性
1.表皮癣菌属：对人致病的是絮状表皮癣菌。镜检可见 大分生孢子、菌丝较细有分隔、厚膜孢子
（一）着色真菌
菌落从灰黑色至黑色，有绒毛状或天鹅绒状气生菌 丝
疣状瓶霉菌落
卡氏枝孢霉菌落
链格孢霉菌落
第一节 浅部感染真菌
（一）着色真菌
镜检可见单个或成群的厚壁孢子，有横隔。
疣状瓶霉
卡氏枝孢霉
链格孢霉
第一节 浅部感染真菌
（二）申克孢子丝菌
主要通过微小伤口侵入皮肤，引起孢子丝菌性下疳
孢子丝菌下疳
第一节 浅部感染真菌