高效液相色谱分析 高效毛细管电泳仪
色谱分析法第九章 毛细管电泳法简介
出版社 社文分社
11 页 退出
色谱分析法
出版社 社文分社
(1)溶质的电荷 (2)溶质大小 9.4.3电泳参数对分离的影响
影响电泳分离的参数主要有时间、效率、选择性和分辨率。每 个分离参数都受一个或多个电泳参数的影响，包括电压、电泳迁移 率、电渗流和毛细管长度。 1)时间 2)效率 3)选择性 4)分辨率 9.5毛细管电泳的分离模式 9.5.1毛细管区带电泳(CZE)
2 页 退出
色谱分析法
出版社 社文分社
图9.1 毛细管电泳示意图 9.1.2区带电泳 9.1.3引起区带扩散的因素 9.1.4管的直径对对流扩散的影响 9.1.5介质中的电泳 9.1.6毛细管电泳
3 页 退出
色谱分析法
出版社 社文分社
9.2毛细管电泳体系
9.2.1概述
从概念上来讲，毛细管电泳体系比较简单。如图9.2所示，其
12 页 退出
色谱分析法
出版社 社文分社
图9.10 CZE中不同组分的迁移示意图 9.5.2胶束电动力毛细管电泳(MEKC) 1)胶束电动毛细管色谱的原理
图9.11 MEKC的分离原理示意图
13 页 退出
色谱分析法
出版社 社文分社
图9.12 胶束电动色谱图 2)MEKC中的保留参数 3)MEKC中的分辨率 4)用MEKC分离离子化溶质 5)在MEKC中使用改性剂 6)其他类型的电动色谱
质通常是蛋白质，分离基于蛋白质等电点(PI)的差异。毛细管内充
满两性电解质和蛋白质溶液，加上一个电场，在毛细管中产生一个
pH梯度。各种蛋白质因为它们的等电点不同，而在毛细管内聚焦为
许多狭小的区带。毛细管内的溶液在动力作用下通过检测器而产生
电泳图。
氯化胆碱含量的检测方法
氯化胆碱含量的检测方法
氯化胆碱含量的检测方法可以通过以下几种常用方法进行：
1. 高效液相色谱法（HPLC）：使用高效液相色谱仪进行分析，常用色谱柱为反相C18柱，流动相为甲醇和水的混合物，检
测波长为230-270nm。
2. 毛细管电泳法（CE）：利用毛细管电泳仪进行分析，使用
芳香醇作为外标物，运行缓冲液为硼酸-牛磺酸缓冲液，检测
波长为甲氧基化氯化胆碱的220nm。
3. 气相色谱法（GC）：氯化胆碱经酯化后，使用气相色谱仪
进行分析，常用色谱柱为聚硅氧烷柱，检测器为火焰离子化检测器。
4. 质谱法（MS）：将氯化胆碱溶液进行电喷雾或化学电离后，通过质谱仪对其荧光进行检测和分析。
以上方法可以根据实验室设备和分析要求选择合适的方法进行氯化胆碱含量的测定。
毛细管电泳结合高效液相色谱-质谱用于天然产物活性成分的筛选
的溶液 ， 涡旋 混合 ， 超声 溶解 ２ ｍｉ ｎ ， 以１ ２ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍｉ ｎ
离心 ３ ｍｉ ｎ 。用 于 活 性 测 试 的 溶 液 的配 制 ： 黄 连 粗
（ Ｅ ＭＭＡ）
实 现 了反 应 和 检 测 的 一 体 化 ， 试 剂
乙酰 胆碱 酯酶 、 盐 酸硫 代 乙 酰胆 碱 （ Ａ Ｔ ｈ Ｃ ｈ） 购
自Ｓ ｉ ｇ ｍａ — Ａ ｌ ｄ ｒ ｉ ｃ ｈ ， 小檗碱 （ ｂ ｅ ｒ ｂ ｅ ｒ ｉ ｎ ｅ ） 、 药根碱 （ ｊ ａ — ｔ ｒ ｏ ｒ ｒ ｈ ｉ ｚ ｉ ｎ ｅ ） 、 黄连 碱 （ ｃ ｏ ｐ ｔ ｉ ｓ ｉ ｎ ｅ ） 、 巴马 汀 （ ｐ ａ ｌ ｍａ — ｔ ｉ ｎ ｅ ） 购 自阿 拉 丁 ， 木 兰花碱 （ ｍａ ｇ ｎ ｏ ｆ ｌ ｏ ｒ ｉ ｎ ｅ ） 、 表 小 檗碱（ ｅ ｐ ｉ ｂ ｅ ｒ ｂ ｅ ｒ ｉ ｎ ｅ ） 、 非 洲 防 己碱 （ ｃ ｏ ｌ ｕ ｍｂ ａ ｍｉ ｎ ｅ ） 、 甲基黄连 碱 （ ｗｏ ｒ ｅ ｎ ｉ ｎ ｅ ） 购 自 上 海 彩 佑 实 业 有 限 公 司， 异丙 醇 、 四 硼 酸 钠 和 一 环糊精均为 Ａ Ｒ级 ， 购自 国药集 团化 学 试 剂有 限公 司 ， 乙腈 （ Ｈ Ｐ Ｌ Ｃ级 ） 购自
术 仍难 与高 通量 筛 选 技 术 相 匹配 ， 这 大大 减 慢 了从
天 然 产 物 中 筛 选 活 性 成 分 的 速 度 ’ 。 据 统 计 ， 近 ２ ０年 来 全 球 获 得 批 准 上 市 的 天 然 产 物 类 药 物 有 逐 渐 减 少 的 趋 势 。 因 此 ， 非 常 有 必 要 充 分 利 用 高 效 液 相色 谱 （ ＨＰ Ｌ Ｃ） 技术 ， 结合 微 量 的 活性 测 试 技 术 ，
高效毛细管电泳HPEC
青霉素发酵液的高效毛细管电泳图
1. 青霉素G钠 ；2. 6-氨基青霉烷酸； 3. 对羟基苯乙酸 ；4. 邻羟基苯乙酸 ；5. 苯乙酸
2. 中药成分分析 如：黄酮及其苷类分析
HPCE条件
毛细管40cm×50μm (Bio-Rad) 检测波长：UV275nm 进样：10psi × sec 操作压力：20KV(+)→(-) 柱温：20℃ 缓冲液：50mmol/L磷酸二氢钠-12.5mmol/L硼 砂(pH8.0)
北沙参供试品溶液的毛细管电泳图
1. 补骨脂素; 2. 花椒毒素; 3. 异茴芹内酯; 4. 佛手柑内酯; 5. 东莨菪内酯。
复方生脉散的毛细管电泳指纹 图谱研究
利用毛细管电泳(CE)方法建立中药复方 生脉散(红参、麦冬、五味子)的指纹图谱。
采用序贯式均匀设计的方法优化CE分离 条件，确定生脉散指纹图谱 电泳条件为:以pH为9.5、44 mmol/L硼砂、 34 mmol/L SDS为缓冲溶液体系， 运行电压25 kV，温度25℃， 压力进样50 mbar×100 s， 检测波长200 nm。
3. 毛细管凝胶电泳 凝胶的网络结构对溶质具 有分子筛的作用，可分离质荷 比相同但分子大小不同的组分。 在分子生物学和蛋白质化 学上有着十分广泛的应用。
4. 毛细管等电聚焦
根据蛋白质的等电点不同 而进行分离。
E B B F A B D A C F C A B A A E D D D E AE D C C E B B AA BB AA BB CC DD CC DD EE EE FF FF
低
pH梯度
高
毛细管电泳的操作
将运行缓冲液充满毛细管柱 移去进样端缓冲液池，用样品池代替 用电动或压力进样方式进样 将进样端缓冲液放回 毛细管两端加操作电压进行电泳分离 分离样品迁移至检测窗检测，数据记录 和处理
毛细管电泳仪使用说明书
毛细管电泳仪使用说明书尊敬的用户：感谢您选择购买我们的毛细管电泳仪。
为了帮助您更好地使用该仪器，我们特别提供了以下使用说明书，请您仔细阅读，并按照说明进行操作。
一、仪器介绍毛细管电泳仪是一种用于分离和分析化合物的高效液相色谱仪器。
它主要由电泳槽、高压电源、检测器和数据处理系统等部分组成。
1. 电泳槽：电泳槽由两个并列的金属板构成，中间通过绝缘材料隔开。
电泳槽用于保持电场稳定以及支撑毛细管。
2. 高压电源：高压电源为仪器提供电场，使溶液中的化合物在毛细管中移动。
3. 检测器：毛细管电泳仪配备了多种检测器，包括紫外-可见吸收检测器、荧光检测器和电导检测器等，您可以根据实际需要选择使用。
4. 数据处理系统：数据处理系统可以实时监测和记录电泳结果，并提供数据分析和报告功能，便于您的后续研究。
二、使用步骤1. 准备工作在操作前，请确保仪器已正确接通电源，并检查各部分连接是否紧固。
同时，根据实验需要，选择合适的电泳缓冲液，并通过滤器过滤以去除杂质。
最后，准备好待测样品，并稀释至适当的浓度。
2. 将毛细管装入电泳槽首先，将尾端截平的毛细管插入电泳槽的两个极板之间，确保毛细管的两端均能延伸到电泳槽外。
然后，通过调整槽中绝缘材料的位置，使毛细管保持在水平状态。
3. 调整高压电源参数根据实验需要，设置合适的电压和电流值，确保电泳能够正常进行。
注意，过高的电压可能会导致电泳带宽过宽或毛细管损坏，因此请务必谨慎调整参数。
4. 注射样品使用注射器将待测样品缓慢注入毛细管，避免产生气泡。
注射结束后，迅速切断样品进入毛细管的通路，以免影响分离效果。
5. 启动电泳在确认样品已经注入毛细管后，启动电泳，并开始记录数据。
您可以根据实际需要选择自动采集数据或手动记录数据。
6. 数据处理电泳结束后，您可以通过仪器提供的数据处理系统对结果进行处理和分析。
不同的检测器可能需要不同的数据处理方式，请根据实际检测器选择相应的处理方法。
三、注意事项1. 请在使用仪器前仔细阅读使用说明书，并根据说明书进行正确操作。
毛细管电泳法
毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳法分离水杨酸、苯甲酸及阿司匹林中的含量测定毛细管电泳又称高效毛细管电泳( High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE) 是一种仪器分析方法。
通过施加10-40kV 的高电压于充有缓冲液的极细毛细管，对液体中离子或荷电粒子进行高效、快速的分离。
现在，HPCE 已广泛应用于氨基酸、蛋白质、多肽、低聚核苷酸、DNA 等生物分子分离分析，药物分析，临床分析，无机离子分析，有机分子分析，糖和低聚糖分析及高聚物和粒子的分离分析。
人类基因组工程中DNA 的分离是用毛细管电泳仪进行的。
毛细管电泳较高效液相色谱有较多的优点。
其中之一是仪器结构 简单（见图1）。
它包括一个高电压源，一根毛细管，紫外检测器及计算机处理数据装置。
另有两个供毛细管两端插入而又可和电源相连的缓冲液池。
high-v oltagepower supply BufferV ialBuffer V ial Detector Recording dev icecapillaryElectrode Electrode图1 CE 仪器组成示意图毛细管中的带电粒子在电场的作用下，一方面发生定向移动的电泳迁移，另一方面，由于电泳过程伴随电渗现象，粒子的运动速度还明显受到溶液电渗流速度的影响。
粒子的实际流速 V 是电泳流速度 Vep 和渗流速度 Veo 的矢量和。
即:V = Vep + Veo (1)电渗流是一种液体相对于带电的管壁移动的现象。
溶液的这一运动是由硅/水表面的Zeta 势引起的。
CE 通常采用的石英毛细管柱表面一般情况下(pH>3)带负电。
当它和溶液接触时，双电层中产生了过剩的阳离子。
高电压下这些水合阳离子向阴极迁移形成一个扁平的塞子流，如图2。
毛细管管壁的带电状态可以进行修饰，管壁吸附阴离子表面活性剂增加电渗流， 管壁吸附阳离子表面活性剂减少电渗流甚至改变电渗流的方向。
高效液相色谱分离检测技术
(3)缓冲溶液中缓冲剂浓度增大 ;保留时间会减小。
三、反相离子对色谱法
1、分离机制
在反相色谱法中,将一种或多种与被测离子电荷相反得离子(称为对离子 或反离子)加到极性流动相中,使其与被测离子结合,形成疏水性(中性或弱极性) 得离子对缔合物 ,而被非极性固定相(有机相)萃取,进入固定相被保留 、因待测 组分离子得性质不同、反离子形成离子对得能力不同和形成离子对疏水性得 不同,导致各组分离子在固定相中滞留时间得不同,因而出色谱柱先后不同,实现 分离、
2、固定相与流动相
(1)固定相
基质 ---合成树脂(聚苯乙烯)、纤维素和硅胶 离子交换剂 ----键合得离子交换基团
类型
符号
官能团
强阳离子交换剂 弱阳离子交换剂
SCX WCX
—SO3H —COOH
强阴离子交换剂 弱阴离子交换剂
SAX WAX
—N+R3 —NH2
(2)流动相----水缓冲溶液
选择规则 (1)增加流动相中盐得浓度,可以降低待测离子得竞争亲和力, 使其在固定相上得保留时间减少,先出色谱柱;反之,则保留时间 增大,后出色谱柱 、
2、不加校正因子得主成分自身对照法
按上述(1)法配制对照溶液并调节检测灵敏度后,取供 试品溶液和对照溶液适量,分别进样。除供试品质量标准项 下有特别规定外,供试品溶液色谱图记录得时间应为主成分 色谱峰保留时间得2倍,测量供试品溶液色谱图中各杂质得峰 面积并与对照溶液得主成分得峰面积比较,计算杂质得含量。
在无抑制柱得离子交换色谱中,进入检测器得就是高电导得洗脱剂 NaOH及被洗脱得组分NaX,后者所产生得电导得微小变化被洗脱剂得高本 底所淹没,难于检测。而加了抑制柱后,进入检测器得本底就是电导率很低 得水,因此很容易检测出具有较大电导率得HX。
毛细管电泳
高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）是近年来发展起来的一种分离、分析技术，它是凝胶电泳技术的发展，是高效液相色谱分析的补充。
该技术可分析的成分小至有机离子、大至生物大分子如蛋白质、核酸等。
可用于分析多种体液样本如血清或血浆、尿、脑脊液及唾液等，HPLC分析高效、快速、微量。
电泳迁移不同分子所带电荷性质、多少不同，形状、大小各异。
一定电解质及PH的缓冲液或其它溶液内，受电场作用，样本中各组分按一定速度迁移，从而形成电泳。
电泳迁移速度(v)可用下式表示：v=uE其中E为电场强度(E＝V/L，V为电压，L为毛细管总长度)。
u 为电泳淌度。
电渗迁移：电渗迁移指在电场作用下溶液相对于带电管壁移动的现象。
特殊结构的熔合硅毛细管管壁通常在水溶液中带负电荷，在电压作用下溶液整体向负极移动，形成电渗流。
带电微粒在毛细管内实际移动的速度为电泳流和电渗流的矢量和。
分离分析类型根据其分离样本的原理设计不同主要分为以下几种类型：①毛细管区带电泳（capillary zone electrophoresis，CZE）；②毛细管等速电泳（capillary chromatography，CITP）；③毛细管胶速电动色谱（miceller electrokinetic capillary chromatography，MECC）；④毛细管凝胶电泳（capillary gelelectrophoresis，CGE）；⑤毛细管等电聚焦（capillary isoelectric focusing ，CIEF）。
毛细管区带电泳（CZE）为HPCE的基本操作模式，一般采用磷酸盐或硼酸盐缓冲液，实验条件包括缓冲液浓度、ｐＨ值、电压、温度、改性剂（乙腈、甲醇等），用于对带电物质（药物、蛋白质、肽类等）分离分析，对于中性物质无法实现分离。
毛细管胶束电动色谱（MECC）为一种基于胶束增溶和电动迁移的新型液体色谱，在缓冲液中加入离子型表面活性剂作为胶束剂，利用溶质分子在水相和胶束相分配的差异进行分离，拓宽了CZE的应用范围，适合于中性物质的分离，亦可区别手性化合物，可用于氨基酸、肽类、小分子物质、手性物质、药物样品及体液样品的分析。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
特点 加二极管阵列，光谱信息 灵敏度高，样品需衍生 灵敏度极高，样品需衍生 离子灵敏，需专用的装置；
2020/6/29
.
7
三、毛细管电泳的进样方式
injection method of HPCE
进样量：毛细管长度的1%-2%；纳升级、非常小；
1. 流体力学进样方式
（1）进样端加压
（2）出口端抽真空
第三章 高效液相色谱
分析
high performance liquid chromatography,HPLC
第九节 高效毛细管电泳仪
一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary electrophoresis apparatus
二、流程与主要部件
process and main assembly
2020/6/29
.
6
3.缓冲液池
化学惰性，机械稳定性好；
4. 检测器
要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化；
类型 紫外-可见 荧光 激光诱导荧光 电导
检测限/mol 10-13～10-15 10-15～10-17 10-18～10-20 10-18～10-19
三、进样方式
injection method
high performance capillary electrophoresis apparatus
2020/6/29
.
1
一、高效毛细管电泳仪
high performance capillary electrophoresis apparatus
2020/6/29
separate types of HPCE
第五节 应用与进展
applications and advances of HPCE
结载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
（1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换；
2. 毛细管柱
（1）材料：石英：各项 性能好；玻璃：光学、机 械性能差；
（2）规格：内径20～ 75μm，外径350～400μm； 长度<=1m
.
2
仪器2
2020/6/29
.
3
仪器3
2020/6/29
.
4
二、仪器流程与主要部件
process and main assembly
• 电压：0～30kV； • 分离柱不涂敷任何固定液； • 紫外或激光诱导荧光检测器； （可检测到：10-19～10-21 mol/L）
2020/6/29
.
5
1.高压电源
2020/6/29
.
9
内容选择
第一节 概述
generalization
第二节 高效毛细管电泳的理论基础
basic theory of HPCE
第三节 高效毛细管电泳仪器
high performance capillary electrophoresis apparatus
第四节 高效毛细管电泳的分离模式
（3）虹吸进样
进
样
体积 P
d4π t
128L
2020/6/29
.
8
2. 电动进样方式
毛细管一端插入样品瓶，加电压；
进样 （ 量 eoef)Vπr2ctt
L
进样不均：电歧视现象，淌度大的离子比淌度大的进样 量大；
离子丢失：淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不 去；
特别适合黏度大的试样；
3. 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处。