仪器分析高效液相色谱
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（HPLC）是一种常用的仪器分析方法，广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域。
本文将介绍HPLC的原理、仪器组成、操作步骤以及应用领域。
HPLC的原理是利用样品在液态流动条件下在固定相上的分配行为进行分离和定量分析。
相比于传统的色谱法，HPLC具有操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点。
HPLC的仪器组成主要包括溶液配制系统、进样系统、柱温控制系统、分离柱、检测器和数据处理系统。
其中，溶液配制系统主要用于调配流动相，进样系统用于将样品注入分离柱，柱温控制系统用于控制柱温度，分离柱用于实现样品的分离，检测器用于检测样品，数据处理系统用于处理和分析检测结果。
HPLC的操作步骤如下：1.首先，需要根据需要选择合适的固定相和流动相，然后将固定相充填到分离柱中。
2.将样品溶解于合适的溶剂中，并按照一定的稀释比例稀释溶液。
3.将稀释后的溶液注入进样器中。
4.打开柱温控制系统，设置合适的柱温。
柱温的选择应考虑到样品的性质以及分离柱的要求。
5.打开溶液配制系统，调配合适的流动相，并将流动相以一定的流速通过分离柱。
6.启动检测器，并设置适当的检测波长和灵敏度，以便对样品进行检测。
7.数据处理系统会自动记录检测结果，并进行相应的数据处理和分析。
HPLC广泛应用于化学、药学、环境科学、食品科学等领域，常见的应用包括药物分析、环境污染物检测、食品成分分析等。
例如，可以利用HPLC对药物中的成分进行分离并进行定量分析，以保证药物的质量和疗效。
在环境科学中，HPLC可以用于检测空气、水体和土壤中的有机污染物。
在食品科学中，HPLC可以用于检测食品中的残留农药、添加剂和重金属等。
总之，HPLC是一种常用的高效仪器分析方法，通过流动相在固定相上的分配行为实现样品的分离和定量分析。
由于其操作简便、分离效果好、灵敏度高等优点，成为化学、药学、环境科学、食品科学等领域中不可或缺的分析工具。
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
仪器分析-色谱法
高效液相色谱法(HPLC) 是在气相色谱和经典液相色谱的基础上，采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。
特点：高压、高柱效、高灵敏度2.HPLC中分离条件的选择：a.固定相与装柱方法的选择:选粒径小的、分布均匀的球形固定相(dp≤10μm)首选化学键合相，匀浆法装柱b.流动相及其流速的选择: 选粘度小、低流速的流动相c.柱温的选择:选室温25-30℃左右。
太低流动相黏度增加，太高容易产生气泡第一节液-固色谱法1.液-固色谱法是利用各组分在固定相上的吸附能力不同进行分离的，也称液-固吸附色谱。
2.分离原理.：组分分子与流动相分子竞争吸附吸附剂表面活性中心，靠组分分子的分配比不同而分离。
3.吸附剂吸附试样的能力，主要取决于吸附剂的比表面积和理化性质，试样的组成和结构以及流动相的性质等。
1）组分与吸附剂的性质相似时，易被吸附;2）组分分子结构与吸附剂表面活性中心的刚性几何结构相适应时，易于吸附。
吸附色谱是分离几何异构体的有效手段;不同的官能团具有不同的吸附能力，因此，吸附色谱可按族分离化合物4.固定相：常用的液-固色谱固定相是表面多孔和全多孔微粒型硅胶、氧化铝等。
一般采用5~10μm的全多孔型微粒。
这些吸附剂的极性都比较大，对非极性组分的保留能力较弱，与极性化合物的相互作用较强。
5.流动相：在液-固色谱中，选择流动相的基本原则是极性大的试样用极性较强的流动相，极性小的则用低极性流动相。
液-固色谱的流动相必须符合下列要求:1）能溶解样品，但不能与样品发生反应。
2）与固定相不互溶，也不发生不可逆反应。
3）粘度要尽可能小，这样才能有较高的渗透性和柱效。
4）应与所用检测器相匹配。
例如利用紫外检测器时，溶剂要不吸收紫外光。
5）容易精制、纯化、毒性小，不易着火、价格尽量便宜。
第二节化学键合相色谱法1.液液分配色谱法分离原理：根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，在两溶液间进行不同分配而实现分离。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
仪器分析 第三章高效液相色谱分析
主要分离机理
吸附能，氢键 疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力 立体效应 生化特异亲和力
主要分析对象或应用领域
异构体分离、族分离，制备 各种有机化合物的分离、分析与制备 高分子分离，分子量及其分布的测定 无机离子、有机离子分析 手性异构体分离，药物纯化 蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析
第二节 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素
同时消耗样品少。
2、HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：
（1）速度快-通常分析一个样品在15～30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 （ 2 ）分辨率高 - 可选择固定相和流动相以达到最佳分离 效果。 （3）灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学 检测器可达0.1pg。 （ 4 ）柱子可反复使用 - 用一根色谱柱可分离不同的化合 物。 （ 5 ）样品量少，容易回收 - 样品经过色谱柱后不被破坏， 可以收集单一组分或做制备。
基本要求： ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定 量的准确性至关重要；②流量准确可调，0.1～10 ml/min， ③输出压力高，一般应能达到 150 ～ 300kg/cm2 ；④液流稳 定，无脉动；⑤ 死体积小，要求小于0.5ml。⑥密封性能好， 耐腐蚀。
泵的使用及注意事项： ①防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂 质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预 先过滤除去流动相中的任何固体微粒，泵的入口都应连接 砂滤棒。 ②流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动 相不应保留在泵内，尤其是在停泵过夜或更长时间的情况 下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏， 甚至只是由于溶液的静臵，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，用后必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于 色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（如对于反相键合硅胶 固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
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从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有用、更具发展前途
2018年12月1日星期六 2
3.HPLC的特点
1、样品不必气化
2、分离温度低
3、选择性好 4、样品回收容易
5、分离效果好
塔板数达到104 ~105/m
6、采用高压输液泵，高效微粒固定相和高灵敏度检测器 7、仪器设备费用昂贵，操作严格。 总之，高效液相色谱法是吸取了气相色谱与经典液相色谱优点，并 用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目前高效液相色谱法已 被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋 白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质 的分离和分析。
K ad [ X ad ][S ]n [ X ][S ad ]n
其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗 脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。
2018年12月1日星期六 5
2.固定相 液---固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附 剂，如硅胶、氧化铝、聚酸胶等。由于硅胶的优点较多，如线性容 量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等， 因此，以硅胶用得最多。 3.流动相
2.固定相 为了更好解决固定液在载体上流失问题。产生了化学键合固定相。它是将各 种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。它代替了固定液的机 械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现 是液相色谱法的一个重大突破。最常用的强极性固定液β,β′---氧二丙睛，中等极性 的聚乙二醇，非极性的角鲨烷等。
2018年12月1日星期六 3
§6.1 HPLC的主要类型及选择
广义地讲，除柱色谱外，薄层色谱（液—固色谱）和纸色谱（液—液 色谱）也属于LC。 狭义的LC指柱色谱。按分离机理，柱色谱法可分为液—固吸附色谱、 液—液分配色谱、键合相色谱、离子色谱等。
2018年12月1日星期六
4
6.1.1液—固吸附色谱法
2018年12月1日星期六
8
液液分配色谱
正相色谱法 1.极性固定相 聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相 正已烷、环已烷 3.极性调节剂 乙醇、四氢呋喃、三氯甲烷 4.分离中等极性和极性较强化合物. 酚类、胺类、羰基类及氨基酸类 5.组分流出顺序 极性小先洗出
液---固吸附色谱是以固体吸附剂作为固等），在它们的表面存在吸附中 心。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离 的。 1．分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要 吸附流动相分子。同时，当试样分子（X ）被流动相带入柱内，只要 它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动 相溶剂，于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS 达平衡时,有
经典LC
柱之内径 长度 填充材料粒度 使用压力 分离时间
2018年12月1日星期六
HPLC
~0.4cm 15~50cm 4µm~10µm 50~200atm ~10min
1
1~5cm 50~100cm 150µm~200µm 1~10atm 0.5h~天
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它们 仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的那些高沸点、热稳定 性差、摩尔质量大的物质，目前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。
把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样 往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 洗脱剂的极性强弱可用溶剂强度参数（ε0）来衡量。ε0越大，表示洗 脱剂的极性越强。
2018年12月1日星期六
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6.1.2液---液分配色谱法
在液---液色谱中，流动相和固定相都是液体，它能适用于各种样品类型 的分离和分析，无论是极性的和非极性的，水溶性和油溶性的，离子型的和 非离子型的化合物。 1.分离原理 液液分配色谱的分离原理基本与液液萃取相同，都是根据物质在两种 互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。所不同的是液液色 谱的分配是在柱中进行的，使这种分配平衡可反复多次进行，造成各组分的 差速迁移，提高了分离效率，从而能分离各种复杂组分。
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点在于高速、高效、高 灵敏度、高自动化。
高速：HPLC采用高压输液设备，流速大增加， 例:分离苯的羟基化合物，7个组分只 分析速度极快，只需数分钟；而经典方法靠 需 1min 就可完成。对氨基酸分离， 重力加料，完成一次分析需时数小时。 用经典色谱法，柱长约 170cm，柱径 高效：填充物颗粒极细且规则，固定相涂渍 0.9cm ，流动相速度为 30cm3· h-1 ，需 均匀、传质阻力小，因而柱效很高。可以在 用20多小时才能分离出20种氨基酸； 数分钟内完成数百种物质的分离。 而用高效液相色谱法，只需lh之内即 -9 高灵敏度：检测器灵敏度极高：UV——10 g, 可完成。 荧光检测器——10-11g。
2018年12月1日星期六 7
3．流动相 在液液色谱中为了避免固定液的流失，对流动相的一个基本要求 是流动相尽可能不与固定相互溶，而且流动相与固定相的极性差别越 显著越好。 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱 和反相分配色谱。
如果采用流动相的极性小于固定相的极性，称为正相分配色谱， 它适用于极性化合物的分离。其流出顺序是极性小的先流出，极性 大的后流出。 如果采用流动相的极性大于固定相的极性，称为反相分配色谱， 它适用于非极性化合物的分离，其流出顺序与正相色谱恰好相反。