白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析
尖吻蝮毒液类凝血酶的序列分析和异源表达的开题报告
尖吻蝮毒液类凝血酶的序列分析和异源表达的开题
报告
1、前言
尖吻蝮是一种在全球分布的毒蛇，其毒液含有多种生物活性成分，其中凝血酶是一种重要的酶类。
凝血酶可以使血液凝结，以防止大量出血。
由于尖吻蝮毒液中含有大量凝血酶，因此对其进行序列分析和异源表达具有重要的研究意义。
2、研究目的
本研究旨在通过对尖吻蝮毒液中凝血酶的序列分析和异源表达，探讨其基本结构和生物学特性，为深入研究尖吻蝮毒液中其他成分的作用机制提供参考。
3、研究方法
（1）毒液样品的制备：选取成年雄性尖吻蝮进行获得毒液，通过超滤、逆流凝胶层析等方法纯化获得凝血酶。
（2）序列分析：将获得的凝血酶进行质谱分析和测序，获得其氨基酸序列，并利用生物信息学软件进行序列比对和分析。
（3）异源表达：利用重组技术，在大肠杆菌等细胞中进行凝血酶的异源表达，并进行纯化和活性鉴定。
4、预期结果
通过本研究，预计可以得到尖吻蝮毒液中凝血酶的氨基酸序列，并在此基础上分析其结构和生物学特性。
同时，通过异源表达获得可扩展的凝血酶种子，可以为其在医学、生物学等领域的应用奠定基础。
5、研究意义
通过对尖吻蝮毒液中凝血酶的研究，可以深入了解其作用机理，为凝血相关疾病的治疗研究提供有益信息。
同时，尖吻蝮毒液中的其他成分也有潜在的药物和生物技术应用价值，而对凝血酶的研究则可为这些成分的进一步研究提供基础。
竹叶青属毒蛇的毒素研究进展
竹叶青属毒蛇的毒素研究进展邓疆渝;和七一;文浩平;余晓东【摘要】蛇毒含多种生物活性成分,其中多数为酶类和活性肽类.随着蛇毒毒理学、药物学、生物化学和分子生物学的发展,蛇毒的许多组分已得到分离纯化和序列测定,并广泛应用于理论研究和临床应用.竹叶青蛇属是中国常见的毒蛇,近年来对其应用研究的报道颇多,就竹叶青属毒蛇的种类与分布,及其蛇毒组分的分离纯化、理化性质、分子克隆表达等方面的研究资料进行了概括和综述.%There are many kinds of biologically active substances which belong to the venom of snake and most of them are active enzymes and peptides. With the development of the snake venom toxicology, pharmacology as well as the biochemistry and molecular biology, many components of snake venom have been purified and sequenced, and some of them even have been used extensively in research and clinical applications. Trimeresurus are common snakes in China. In recent years, the studies about the application of it have been reported widely. In the paper, the data of the snake Trimeresurus including the kinds and distribution of it as well as the purification, the molecular cloning and expression were summarized.【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2011(028)002【总页数】5页(P83-86,97)【关键词】竹叶青蛇属;蛇毒;纯化【作者】邓疆渝;和七一;文浩平;余晓东【作者单位】重庆师范大学生命科学学院,重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047;重庆师范大学生命科学学院,重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047;重庆师范大学生命科学学院,重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047;重庆师范大学生命科学学院,重庆市动物生物学重点实验室,重庆400047【正文语种】中文【中图分类】Q959.6+2;R996.3Abstract:There are many kinds of biologically active substanceswhich belong to the venom of snake and most of them are active enzymes and peptides.W ith the development of the snake venom toxicology,phar macology aswell as the biochemistry and molecular biology,many components of snake venom have been purified and sequenced,and some of them even have been used extensively in research and clinical applications.Trim eresurusare common snakes in China.In recent years,the studies about the application of it have been reported widely.In the paper,the data of the snakeTrim eresurusincluding the kinds and distribution of it aswell as the purification,the molecular cloning and expression were summarized.Keywords:Trimeresurus;snake venom;purification蛇毒是一种珍贵的生物资源,它是从毒蛇头部毒腺所分泌的有毒液体,传统上分为神经毒、血循毒与混合毒。
47例竹叶青蛇伤患者凝血功能检测结果分析
47例竹叶青蛇伤患者凝血功能检测结果分析发表时间：2013-07-30T11:26:50.187Z 来源：《中外健康文摘》2013年第21期供稿作者：姚碧婉[导读] 咬伤患者后，其蛇毒素、蛇毒酶进入人体后可引起机体的凝血机制发生改变，内外源凝血途径均被启动。
姚碧婉（广西梧州市中医医院检验科 543002）【中图分类号】R446.11 【文献标识码】B【文章编号】1672-5085（2013）21-0370-01 【摘要】目的探讨被竹叶青蛇咬伤患者凝血功能指标的变化及临床意义。
方法 47例被竹叶青蛇咬伤患者未治疗前采取血样检测血浆凝血酶原时间（PT）活化部分凝血酶原时间（APTT）凝血酶时间（TT）血浆纤维蛋白原（FIB）、D2聚体及血小板（PLT）计数并与39例对照组比较分析。
结果蛇咬伤组PT、APTT、TT、D2聚体均明显高于对照组，而FIB、PLT均明显低于对照组（P<0.01）。
结论竹叶青蛇咬伤后，检测患者凝血功能指标可了解患者的凝血功能状况，防止DIC的进一步发生具有很好的临床意义。
【关键词】竹叶青蛇伤蛇毒凝血功能蛇伤是指有毒蛇的毒牙刺破人体皮肉后，使毒液进入人体引起的中毒症状，根据蛇毒性质及中毒症状，分为神经毒，血循环毒，混合毒三大类，竹叶青蛇伤是属于混合毒，但以血循环毒为主，成分比较复杂，因此最容易引起血循环中凝血功能障碍[1]。
我们在实验室工作中发现竹叶青蛇伤患者血凝血功能指标凝血酶原时间（PT）活化部分凝血酶原时间（APTT）凝血酶时间（TT）血浆纤维蛋白原（FIB）、D2聚体及血小板（PLT）计数改变有统计学意义（P<0.01），容易导致弥漫性血管凝血（DIC）,现将我院2008年3月至-2013年1月，共收治的47例竹叶青蛇咬伤患者凝血功能检测结果分析如下。
一、材料和方法1.研究对象2008年3月至-2013年1月共收治的47例竹叶青蛇咬伤患者，其中男34例，女13例，年龄5-67岁。
关于我国竹叶青蛇毒的研究概述
[25,30]1前言分离出TLE 。
蛇毒中TLE可分解FG结构里A肽或B肽。
TLE 竹叶青蛇属（Trimersurus Lacépède，1804）隶属于爬行降解“脱肽链A纤维蛋白”是可溶性单体，不受血液中纤维蛋白纲（Reptilia）有鳞目（Squamata）蛇亚目（Serpentes）蝰科稳定因子（XIII F）催化交联，它可通过微循环不停地在血管内（Viperidae）。
鉴别特征为，头大呈三角形，头背被以小鳞。
皮细胞表面形成微血栓，并易被血浆溶解、吞噬细胞清除，减[15,30]体背及两侧为鲜绿色，腹面为浅绿色。
体侧有一条黄色雌蛇或少血液中Fg含量，引起纤维蛋白血症。
此外，竹叶青蛇毒中白色体伴以红色雄蛇的纵线， 尾端呈焦红色。
体长尺左右，尾含有抑制剂Trigramin可抑制Fg与被ADP活化的血小板结合，但有缠绕性，为树栖蛇。
分布于南亚及东南亚，我国南部。
我国不影响血小板的释放，并且阻断人vWF和被凝血酶活化的血小[27][30,36]已知有7种，即：白唇竹叶青蛇T.albolabris（Gray，1842），板糖蛋白II b/IIA复合物的结合。
抑制血小板功能，血小板在[30]台湾竹叶青蛇T. gracilis（Oshima，1920），墨脱竹叶青蛇 血栓形成中的作用也受到影响。
[15]T.medoensis（Zhao，1977），福建竹叶青蛇T.stejnegeri周宁等（2005）在关于“大剂量糖皮质激素联合抗蛇毒血[42]（Schmidt，1925），西藏竹叶青蛇T. tibetanus（Huang，清治疗竹叶青蛇伤致DIC的疗效”实验中得出，大剂量糖皮质激[12]1982），乡城竹叶青蛇T. xiangchengensis（Zhao，Jiang，and 素联合抗蛇毒血清治疗竹叶青蛇伤致DIC可明显缩短凝血指标恢[25]复时间及提高疗效。
可以对竹叶青蛇毒起较好的中和作用，取Huang，1978），云南竹叶青蛇T. yunnanensis（Schmidt，[41,44][30]1925）。
白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质
收稿日期：2008-01-30；接受日期：2008-05-27基金项目：重庆市自然科学基金重点项目（CSTC2006BA5032）；重庆市教委基金项目(KJ080824)*通讯作者（Corresponding author ），E-mail: yxd@动 物 学 研 究 2008，Aug. 29(4)：399-404 CN 53-1040/Q ISSN 0254-5853 Zoological Research doi:10.3724/SP.J.1141.2008.04399白唇竹叶青蛇毒5′-核苷酸酶的分离纯化及性质陈 夏，余晓东*，邓 敏，李 卉，林亦心，和七一，柳建平（重庆师范大学 生命科学学院，重庆市生物活性物质工程研究中心，重庆市动物生物学重点实验室，重庆 400047）摘要：用DEAE-SephadexA-25、Sephadex-G-100和CM-SephadexC-50三步柱层析分离法，从白唇竹叶青（Trimeresurus albolabris ）蛇毒中分离纯化出具有5′-核苷酸酶活性的组分。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为48.03 k Da ，HPLC 柱层析图谱为单一峰。
该组分是一个糖蛋白，以一磷酸腺苷（AMP ）为底物时，其酶活力为330.33 μg Pi/（mi n·mg ）；而以二磷酸腺苷（ADP ）为底物时，其酶活力为123.56 μg Pi/（mi n·mg ）。
金属离子Zn 2+、Fe 3+和Cu 2+对5′-核苷酸酶活性有显著的抑制作用，EDTA 可完全抑制其酶活性。
该酶的最适pH 为9，最适温度为50℃。
该组分还具有抑制由ADP 诱导的血小板聚集的生物功能。
关键词：白唇竹叶青蛇毒；5′-核苷酸酶; 分离纯化中图分类号：Q502；Q959.6 文献标识码：A 文章编号：0254-5853-(2008)04-0399-06Purification and Characterization of 5′-nucleotidase fromTrimeresurus albolabris VenomCHEN Xia, YU Xiao-dong *, DENG Min, LI Hui, LIN Yi-xin, HE Qi-yi, LIU Jian-ping(College of Life Science, Chongqing Normal University; Chongqing Engineering Research Center of Bioactive Substance;Chongqing Key Laboratory of Animal Biology, Chongqing 400047)Abstract: A 5′-nucleotidase was isolated and purified from the snake venom of T. albolabris using three steps of chromatography including DEAE-SephadexA-25, Sephadex-G-100 and CM-Sephadex C-50. Using SDS -PAGE and HPLC column chromatography the purified 5′-nucleotidase proved to be homogenous. It was a glycoprotein with a molecular weight of 48.03 k Da. The enzymatic activities of the purified 5′-nucleotidase were 330.33 µg Pi/min mg and 123.56 µg Pi/min mg when using AMP （adenosine monophosphate ） and ADP （adenosine diphosphate ） as substrates,respectively. Metal ions, including Zn 2+, Fe 3+ and Cu 2+, could inhibit 5′-nucleotidase activity, as did EDTA. Its optimum pH was nine and its optimum temperature was 50°C. It has a potent inhibitory effect on rabbit platelet aggregation induced by ADP.Key words: Trimeresurus albolabris ；Snake venom; 5′-nucleotidase; Isolation and purification5′-核苷酸酶是一种磷酸酯酶，主要分布于动植物细胞、细菌及动物毒液中（Li ，2004）。
一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析
一种新的五步蛇蛇毒类凝血酶Cdna的克隆和序列分析梁宁生;刘滔滔;贺海平;谢裕安;蒙子卿;梁安民【期刊名称】《广西医科大学学报》【年(卷),期】2002(019)001【摘要】目的:克隆出五步蛇的类凝血酶cDNA,为研究其结构和功能的关系,并为下一步基因表达开发抗血栓药物提供依据和基础.方法:从五步蛇蛇腺中提取了总RNA,通过反转录合成第一链cDNA,经PCR 扩增出五步蛇毒腺中类凝血酶TLE1的cDNA片段,并将其连接到质粒载体扩增,然后进行DNA测序.结果:成功克隆出一种新的五步蛇类凝血酶的cDNA片段.此片段全长794bp,包括编码部分的全长为777bp.推导其编码的蛋白质序列为258个氨基酸,其中包括18个氨基酸的信号肽,6个氨基酸的前肽和234个氨基酸的成熟氨基酸顺序.TLE1成熟肽与其它蛇毒类凝血酶相比,蛋白质一级结构具有较高的同源性.结论:从五步蛇中成功克隆出一种新的类凝血酶cDNA,并确定了它的DNA顺序.【总页数】4页(P27-30)【作者】梁宁生;刘滔滔;贺海平;谢裕安;蒙子卿;梁安民【作者单位】广西肿瘤研究所,南宁,530021;广西肿瘤研究所,南宁,530021;广西肿瘤研究所,南宁,530021;广西肿瘤研究所,南宁,530021;广西肿瘤研究所,南宁,530021;广西肿瘤研究所,南宁,530021【正文语种】中文【中图分类】R991【相关文献】1.一种新HDM2剪接变异体的cDNA克隆与序列分析 [J], 梁爱华;张国强;张志云2.岩栖蝮蛇类凝血酶纯化、cDNA克隆和序列分析 [J], 孙德军;杨春伟;杨同书;颜炜群;王伟3.蛇毒类凝血酶Calobin cDNA的设计合成与克隆 [J], 袁盛凌;段海清;张兆山4.五步蛇蛇毒金属蛋白酶cDNA的克隆和序列分析 [J], 范春阳;钱友存;杨胜利;龚毅5.白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析 [J], 宋锡迅;余晓东;林奕心;和七一;李恒因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin基因的克隆及原核表达
蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin基因的克隆及原核表达朱书宇;黄程新;胡启平;黄秒;舒伟;方玲【摘要】目的构建蛇毒精氨酸酯酶Agkihpin的原核表达载体,并诱导其表达重组Agkihpin,为将来量产Agkihpin提供方法和依据.方法 RT-PCR法扩增Agkihpin 基因,构建重组表达质粒pET30a(+)-Agkihpin和pEASY-E1-His6-Agkihpin,并转化到BL21(DE3)感受态细胞中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳观察重组蛋白Agkihpin的表达情况,Western blot检测其特异性.结果成功构建Agkihpin的原核表达载体pEASY-E1-His6-Agkihpin和pET30a(+)-Hiss-Agkihpin,并利用pEASY-E1-His6-Agkihpin首次在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出分子量约为30kD 的His6-Agkihpin重组融合蛋白.结论首次实现了His6-Agkihpin重组融合蛋白在原核系统中的高效表达,为Agkihpin将来量产提供了方法和实验依据.【期刊名称】《中国生化药物杂志》【年(卷),期】2014(000)009【总页数】5页(P33-37)【关键词】蛇毒精氨酸酯酶;类凝血酶;Agkihpin;原核表达;克隆【作者】朱书宇;黄程新;胡启平;黄秒;舒伟;方玲【作者单位】广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室,广西南宁530021;中国人民解放军第三○三医院,广西南宁530021;广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室,广西南宁530021;广西医科大学附属肿瘤医院,广西南宁530021;广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室,广西南宁530021;广西医科大学细胞生物学与遗传学教研室,广西南宁530021【正文语种】中文【中图分类】Q78;R34蛇毒精氨酸酯酶（arginine esterase，AEase）是一类丝氨酸蛋白酶，部分具有类凝血酶（thrombin-like enzymes）活性，能直接作用于纤维蛋白原释放血纤肽FPA和FPB，导致纤维蛋白单体首尾聚合而凝固，所以这类酶又常被称为类凝血酶［1］。
大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究
( 1. 大连理工大学 生物工程系 辽宁 大连 116012; 2. 中国科学院化工冶金研究所 生物化学工程国家重点实验室 3. 瑞典乌普萨拉大学 生物医学研究中心 乌普萨拉 75 123 )
北京
100080;
摘要: 根据同源性设计引物 通过 RT-PCR 方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总 RNA 中合成扩增出
第2期
杨 青等, 大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因克隆与表达研究
157
1. 2 RT-PCR 合成扩增 cDN A 取 1 pL 新鲜制备的总 RNA 在 65 下保温
1O min, 然后立即转移至 冰 上. cDNA 的 合 成 以 及 扩 增 采 用 RT-PCR kit( 5/ -f ull RACE Core Set, Takara, 日本) . 具体操作根据试剂盒生产商 的建议完成. 基于同源性[5~ 6], 设计合成用于扩增 反应的 PCR 引物序列是
O引 言
毒蛇的毒液也许是迄今为止所发现的脊椎动 物中最高度浓缩的分泌产物 而蛋白水解酶是蛇 毒 中最重要的成分. 从生物化学上讲 蛇毒蛋白 水解酶可被划分为两大类: 丝氨酸蛋白水解酶和 金属蛋白水解酶{1]. 类 凝 血 酶 属 于 丝 氨 酸 蛋 白 水 解酶 它的特点是能将纤维蛋白原转化为纤维蛋 白凝胶. 由于此纤维蛋白凝胶是非交联的并极易 为纤维溶解酶所降解 类凝血酶在临床上可以用 于改善血液的流动性 从而达到治疗和防治血栓 的目 的{2~ 3]. 目 前 已 有 20 余 种 不 同 种 蛇 的 类 凝 血酶被分离出来并进行了性质的鉴定 其中有 8 种 类 凝 血 酶 的 氨 基 酸 全 序 列 已 见 报 道 {4] .
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动物科学
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第 ’ 期! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! 宋锡迅， 等： 白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆与序列分析
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个半胱氨酸也完 全 保 留， 分别为 CD4E"F"G& 、CD4(HFGG 、CD4%$F&(G 、 CD4"’&F&"H、 CD4"I’F"$% 和 CD4&HHF &&(。其中 CD4%$F &(G 为蛇毒蛋白 酶所特有的。 &0 E 多序列比对 多序列比对的结果显示中国 产的白唇竹叶青蛇 )2.:<.?<.4.7 与 !" #$%&’%(%)* 的 43<.73 ;<=:3843 CJ& ;<3F )6<4=< （ KI"KL& ） 和 4:3M7=?.7 （ K$,N$" ） 、 !" +,-.,+-)*# 的 OPQF 1J& （ ,RS"&HI( ） 的同源性分别为 $E0 I&T 、I"0 (’T 和 IHT ；与 /,.01*2# #+3+$*,*# 的 93>.?<843 （ KISUV" ） 、 4.$5).6# +$).3 的 ?8:<F =W=?.7 （ ,,,’$((E ） 和 7+,,.#%,+#8+ )5.1.#$.8+ 的 87)<=9（ ,,,’%"%( ） 的同源性分别为 G(0 $%T 、 G&0 HGT 和 (I0 G%T （图 ( ） 。可见， )2.:<.?<.F 4.7 与竹叶青属几种类凝血酶的同 源性高于非竹叶青属的几种类凝 血酶。 &0 ’ 分子进化树 图 G 显示包 括 )2.:<.?<.4.7 在 内的十几种 SQ1JV4 的分子进化 趋势与形态学大 致 一 致， 且种间 差异大于种内差异， 属间差异大于 属内差异。同时该图也反映出 SQ1JV4 在进化上也 是存在多样性的。 SQ1JV4 的基因序列， 推导出其氨基酸序列， 并确定 二硫键位置。通过与其他竹叶青属类凝血同源性的 比对， 发现它们有较高的同源性， 经过多次测序验证 表明得到的白唇竹叶青类凝血酶 )*+, 序列结果是 可靠的。本研究成功克隆 )2.:<.?<.4.7 基因， 希望将 来能够在原核或真核生物中得到高效表达， 从而获 得具有高效活性的 )2.:<.?<.4.7， 以节省日益减少的蛇 毒资源。 另一方面， 比对结果没有发现核苷酸序列完全 相同的两个 )*+, 分子， 也反映出类凝血酶分子结 构的多样性。判断造成 SQ1JV4 多样性的原因有以
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白唇竹叶青蛇毒类凝血酶基因的克隆和序列分析
宋锡迅，余晓东，林奕心，和七一，李! 恒
（ 重庆师范大学 生命科学学院 重庆市动物生物学重点实验室 重庆市生物活性物质工程研究中心，重庆 +###+F ） 摘要： 通过分析多种已知的毒蛇蛇毒类凝血酶 （ @AIJK>） 基因序列同源性， 以保守的 9 和 4 末端氨基酸序列设计引 物， 克隆得到白唇竹叶青 （ !"#$%"%&’"’& ()*+)(*"#&） @AIJK 基因并分析其序列。以毒腺总 L9M 为模板进行 LIGN4L， 纯 化并克隆至 OPB%HGI。结果表明， 该酶基因大小为 FFF QO； 推测出其相应氨基酸序列含 "RH 个氨基酸残基， 分子量为 "H) #" SB，OC 值为 *) #F ； 其 D 个可能糖基化位点为 9BI%#D T %#R 、 99@%"% T %"D 和 9LI"R% T "RD ； 与其它毒蛇的已知 @AIJK> 基因比较分析， 推测出其含 * 对二硫键即 4?>D%G%*" 、 4?>R#G** 、 4?>$HG"R* 、 4?>%+"G"%# 、 4?>%F+G%H$ 和 4?>"##G 其催化活性中心氨基酸残基为 U8>*R 、 M>O%%# 和 @=/"#+ 。分子进化树分析表明， 毒蛇 @AIJK> 一级结构的进化具 ""R ； 有一定种属特征， 可为蛇的系统分类提供参考。 关键词： 白唇竹叶青； 蛇毒类凝血酶 （ @AIJK>） ； 克隆； 序列分析 中图分类号： VFHR 文献标识码： M! ! ! 文章编号： %*F"G **$D （ "##$ ） #+G ##DHG #R
! ! 蛇毒含多种生物活性成分， 其中大部分是酶和 多肽
［ %］
德科技发展有限公司合成。其余试剂均为国产分析 纯。 %) " 方法 %) ") % 毒腺总 L9M 的抽提 ! 剪下白唇竹叶青蛇头， 迅速取出毒腺， 置于液氮中研磨成粉末， 其余步骤按 照 I1[1L1 公司的总 L9M 抽提试剂盒说明进行。通 过 %] 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光仪检测抽提的总 L9M 的质量和浓度。 %) ") " 一步法 LIGN4L 扩增 ’B9M! 取 %# ^ &0= @(=O L9M N4L Q.33=/ %# #J、 P642" （ "# ::-2 E J ）"# #J、 X9IN 混合物 %# #J、 正向引物 （ %# O:-2 E #J） " #J、 反 向引物 （%# O:-2 E #J）" #J、 L91>= C058Q8(-/ （+# ; E #J） " #J、 MPA L=<=/>= I/10>’/8O(1>= _J （ R ; E #J） " #J、 MPAG&O(8:8W= I17 （ R ; E #J ） " #J、 L9M %# #J、 L91>= ‘/== XU" & +# #J 至总体积 %## #J， 然后进行 LIGN4L 反应。 LIGN4L 反 应 条 件 为 R# a 反 转 录 D# :80， $R a 反转录酶灭活 " :80， $R a 变性 D# >， *# a 退火 D# >， F" a 延伸 +R >， 进行 D# 个循环， 最 后 F" a 延伸 R :80。取 H #J 反应产物电泳检测， 其余用 ICM9ZK9 公司的 B9M 纯化回收试剂盒纯 化， 溶于 D# #J 的洗脱缓冲液备用。 %) ") D ’B9M 的 克 隆 ! B9M 连 接 反 应 按 OPB%HGI <=’(-/ 试剂盒说明书进行， 感受态细菌的制备、 大肠
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收稿日期： "##$G #+G #F! ! 修回日期： "##$G #*G "" 资助项目： 重庆市自然科学基金 （ 9-) 4@I4"##*\MR#D ） 作者简介： 宋锡迅， 男， 硕士研究生， 研究方向为药用资源动物学； 通讯作者： 余晓东， KG:182： ?YXb ’70.) =X.) ’0
,+ , <B%:* 基因的核苷酸序列及氨基酸序列分析 除合成 8 ’ 和 A’ 末端引物外， 还合成了一系列 的中间引物， 最后得到一条 YYY US 的核苷酸序列 ： 起始密码子为 ’%) （ 核苷酸 # Z A ） ， 终止密 （ 图 -）
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重庆师范大学学报 （ 自然科学版） 0 QOOS： I I [[[+ .\RX]+ .R0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 第 ,H 卷
［ !"#$ ］ 杆菌的转化、 等均按常规方法进行 。质粒抽提
列， 所测结果一致， 见序列于 （ 图 -） 。
按 %&’()*( 公司试剂盒说明书进行。 #+ ,+ - ./(’ 全序列的测定 0 质粒经 123 和 456 !、 *.73"双酶切鉴定为阳性克隆后， 将其菌液送至北 京三博远志生物技术有限责任公司完成序列测定。 #+ ,+ 8 ./(’ 和蛋白质序列分析0 采用 /(’9’( 对 ./(’ 序列进行推导， 采用软件 2:;<%:=#+ > 和 4?" =<@’/* A+ ,# 对蛋白质进行多序列比较。
［ D］
首次成功地克隆出一种蝮蛇类
［ +］
凝血酶 （ 巴曲酶） 基因以来， 越来越多的 @AIJK> 得 到 克 隆 和 表 达， 如 N1221Q80 Q80
［ *］
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