生殖发育毒性作用及其试验与评价
药物毒理学生殖毒性试验
药物毒理学生殖毒性试验
药物毒理学的研究范围包含了药物对生殖系统的影响，其中生殖毒性是一项重要的研究内容。
生殖毒性试验主要通过实验动物模型，评估药物对生殖系统的对两性生殖器官和功能的影响。
生殖毒性试验通常包括以下内容：
1.生殖毒性评估：评估药物对生殖器官的影响，包括生殖细胞的发育、数量、性功能的影响。
2.生殖发育毒性评估：评估药物对胚胎和胎儿的影响，包括睾丸、卵巢、外生殖器和乳腺等生殖发育的影响。
3.遗传毒性评估：评估药物对基因突变、染色体畸变和细胞遗传毒性等的影响。
药物毒理学生殖毒性试验是一项重要的药物安全性评估内容，能够为药物的开发和上市提供重要数据支持，保障人类健康和安全。
生殖毒性与发育毒性
药物和化学品 反应停
Abamectin 酒精 氨基蝶呤 雄性激素 麻醉剂 抗甲状腺药物 白消安 咖吲 F 因 氯代联苯类 香豆素抗凝剂 环磷酰胺 二已基乙烯雌酚 敌螨普 三氟氯溴乙烷
异维 A 酸 锂 甲巯咪唑 有机汞化合物 有机溶剂类 苯妥因 腐霉利 四环素 三甲唿唑烷二酮 丙(基)戊酸
Developmental Toxicity
外源化学物对发育过程的不良 影响,包括对胚胎发育、胎仔发育 及出生幼仔发育的损害作用. • 发育生物体死亡 • 结构异常 • 生长、发育迟缓 • 功能缺陷
生殖、发育毒性的靶器官
• 对性腺的损害 • 对胚胎的毒作用-胚胎毒性(embryotoxicity)
生殖毒性与发育毒性
(Reproductive and Developmental Toxicology)
北京大学公共卫生学院毒理学系 郝卫东
Reproductive Toxicity
外源化学物对生殖过程的不良 影响, 主要指对生殖细胞的发生、 卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分 娩和哺乳过程的损害作用.
发育生物体死亡 结构异常 生长、发育迟缓 功能缺陷
• 对胎盘的毒作用
经胎盘致癌作用(transplacental carcinogenesis)
致畸作用 （Terotogenicity)
外源化学物作用于妊娠母体， 干扰胚胎及胎儿的正常发育过程， 使胎儿出现形态结构及功能异常．
已知的人类致畸物
电离辐射 放射治疗 放射性碘 原子武器
学物，对生育力及早期胚胎发育的 接触化学物，对动 触化学物，对母鼠妊娠，仔鼠
第八章 化学物质的生殖发育毒性和致畸作用及评价
3．损伤细胞和分子水平的翻译 细胞增殖率在个体发生过程中空间和
时间都在变化，在胚胎中细胞增殖、分化 和凋亡之间有精致的平衡。用CP处理妊娠 第10天大鼠，引起胚胎的S-期细胞周期阻 断，在细胞迅速增殖区域观察到细胞死亡
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细胞周期长度的不同可能部分地影响 敏感性。如：胚胎的神经上皮对CP诱导 的细胞死亡相当敏感，而心脏有抵抗力。 第10天大鼠胚胎神经上皮的细胞周期时间 大约为9.5h，而在心脏中的细胞周期大约 是13.4h，这是由于心脏细胞比神经上皮 有更长的C0/G1期
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第四节 外源性化学物发育毒性的评价
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一、动物发育毒性试验
➢ 最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包 括子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段 ➢ 观察期应贯穿一个完整的生命周期，以 检测近、远期效应 ➢ 最常选用的方案为三阶段试验
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I 阶段试验
➢ 雌雄性交配前-受孕-雌性受精-雌性着床 期间染毒 ➢ 对成年雌雄性的生殖功能、配子的发生 及成熟、交配行为、受精、着床前的发育 和着床的影响
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（二）器官形成期
孕体着床后直到硬腭闭合的一段时间 致畸敏感期或致畸作用危险期 (critical period)
➢ 器官结构畸形 ➢ 胚胎死亡
✓ 吸收胎（resorption） ✓ 流产
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➢ 各个器官发育最旺盛时感受性最强，不 同器官的敏感期（target window）不同， 且有交叉重叠
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3. 胚胎-胎儿毒性
胚胎毒性（embryotoxicity） 外源性理化因素造成的着床前后直到
器官形成期结束的所有毒性表现
胎儿毒性（fetoxicity） 器官形成期结束后的因素引发的任何
毒性表现（死亡、低体重、骨化迟缓、功 能缺陷以及结构异常）
生殖毒性试验流程及意义
啮齿类动物生殖毒性I、II、III段实验流程及意义1.概述生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。
包括：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）、胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）、围产期毒性试验（III段）。
生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示：图1. 动物生命周期划分A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。
B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。
C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。
D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。
E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。
F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。
各段试验研究阶段如下：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）：C-D围产期毒性试验（III段）：C-F1一般试验设计简介1.1受试物生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。
1.2实验动物首选啮齿类动物为大鼠。
在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。
1.3给药1. 3.1计量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。
高剂量：应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。
低剂量：应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量（NOAEL）”。
1.3.2给药途径：给药途径应与临床拟用途径一致（不用腹腔注射途径，因腹腔注射会对胎儿及子宫产生直接影响）。
生殖毒性及其评定
第二节生殖毒性及其评定一、生殖毒性表现外来化合物对生殖过程的损害作用可以表现为性淡漠、性无能或各种形式的性功能减退。
雌性可出现排卵规律改变、月经失调或闭经、卵巢萎缩、受孕减少、胚胎死亡、生殖力降低、不孕或不育等。
雄性可表现为睾丸萎缩或坏死、精子数目减少等。
二、生殖毒性作用的评定外来化合物对生殖过程作用的评定主要通过生殖毒性试验来进行，过去也称为繁殖试验。
生殖毒性试验可以全面反映外来化合物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕、妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的影响。
评定的主要依据是交配后母体受孕情况（受孕率）、妊娠过程情况（正常妊娠率）、子代动物分娩出生情况（出生存活率）、授乳哺育情况（哺育成活率）以及断奶后发育情况等。
此外还可同时观察出生幼仔是否有畸形出现，但畸形观察主要在发育毒性评定中进行。
（一）试验方法原则生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家兔。
大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。
一般设三个剂量组，另设对照组。
最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平，希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。
低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。
另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。
中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
最高剂量组轻度中毒的概念是进食量显著减少，体重明显下降。
要求最高剂量组出现轻度中毒的目的是表明在已能引起中毒剂量下，如仍不致影响正常生殖过程，则表示该受试物确实不具有生殖毒性作用。
反之，如剂量过低，则难于确定受试物是否确实不具有生殖毒性，有可能因剂量不足，未达到最小有作用剂量。
剂量的确定可用少数动物进行预试，如已进行过亚慢性和急性毒性试验，则最高剂量也可略高于亚慢性毒性试验中最大无作用剂量，或相当于LD50的1/10左右。
最低剂量可相当于最高剂量的1/30。
如经多次试验确实证实1 000mg／kg体重剂量对生育力无损害作用，或最高剂量可引起亲代动物表现一般毒性作用，但对生育力无不利影响，则可不进行其它剂量试验。
生殖毒性试验流程及意义
啮齿类动物生殖毒性I、II、III段实验流程及意义1.概述生殖毒性试验（Reproductive toxicity study）是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。
包括：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）、胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）、围产期毒性试验（III 段）。
生殖毒性试验中，为方便实验一般可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段如下图所示：图1. 动物生命周期划分A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。
B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。
C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。
D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。
E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。
F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。
各段试验研究阶段如下：生育力与早期胚胎发育毒性实验（I段）：A-B胚胎—胎仔发育毒性试验（II段）：C-D围产期毒性试验（III段）：C-F1一般试验设计简介1.1受试物生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品。
1.2实验动物首选啮齿类动物为大鼠。
在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，家兔为优先选用的非啮齿类动物。
1.3给药1. 3.1计量选择：至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。
高剂量：应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。
低剂量：应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量（NOAEL）”。
1.3.2给药途径：给药途径应与临床拟用途径一致（不用腹腔注射途径，因腹腔注射会对胎儿及子宫产生直接影响）。
两代生殖发育毒性试验方法
两代生殖发育毒性试验方法Two-Generation Reproductive Toxicity Study1范围本规范规定了两代生殖发育毒性试验基本原则，试验方法和技术要求。
本规范用于检测化妆品原料的生殖发育毒性。
2试验目的提供关于受试物产前、产后暴露对雌性、雄性动物生殖功能、生育力及子代发育影响的确切信息。
3定义3.1生殖毒性Reproduction toxicity对后代产生有害作用，并损伤雄性和雌性的生殖功能和生殖能力。
3.2发育毒性Developmental toxicity生殖毒性的表现，具体表现为后代在产前、围产期、产后发生的结构和功能紊乱。
3.3母体毒性Maternal toxicity受试物引起亲代雌性妊娠动物直接或间接的健康损害效应，表现为增重减少、功能异常、毒性反应、甚至死亡。
3.4未观察到有害作用剂量NOAEL通过动物试验，以现有的技术手段和检测指标未观察到任何与受试物相关的毒性作用的最大剂量。
3.5观察到有害作用的最低剂量LOAEL在规定的条件下，受试物引起实验动物组织形态、功能、生长发育等有害效应的最小作用剂量。
4试验的基本原则通过对实验动物以受试物暴露，考察其对雄性和雌性动物生殖功能、生育力及生殖系统形态的影响。
若该暴露（直接或间接）持续至子代，则还可以继续考察受试物对子代发育，甚至子代生殖功能和生育力的影响。
5受试物配制化妆品生殖发育毒性试验一般采用经口途径给予受试物，但基于人的可能暴露途径或受试物的特性而选择经皮或吸入也是合适的。
溶媒对照应采用与之相同的给予途径。
若设置阳性对照，其处理方式可以不同于受试物处理组。
一般情况下首选水作为溶媒，可以是水溶液也可以是混悬液，其次可以选择玉米油作为溶媒配制成乳浊液，也可以将其与水混合配制成油溶液。
使用水以外的其它溶媒，应阐明其毒性并保证所配制溶液的稳定性。
其它应纳入考虑的因素包括：溶媒是否影响受试物化学特征继而改变受试物毒性；溶媒是否影响受试物的吸收、代谢、分布和蓄积；溶媒是否影响动物食物和饮水摄入继而影响营养状况；溶媒本身是否有潜在毒性。
毒理08化学毒物生殖和发育毒性作用
生殖毒性试验也称繁殖试验，可以全面反映外源化学物对性腺功能、发情周期、交配行为、受孕妊娠过程、分娩、授乳以及幼仔断奶后生长发育可能发生的损害作用。
1.试验方法原则 大鼠，一般设三个剂量组及对照组。最高剂量，稍高于亚慢性最大无作用剂量，或LD50的1/10左右。每组雌雄各20只。
3.观察指标
（1）受孕率：
（2）正常分娩率：
（3）幼仔出生存活率：
（4）幼仔哺乳成活率：
三、发育毒性及其评介
（一）致畸作用的毒理学特点
1.致畸作用和母体毒性
母体毒性作用是指外源化学物在一定剂量下，对受孕母体产生的损害作用。具体表现包括体重减轻、功能异常，出现某些毒性表现、死亡。
A. 1～3周
B. 3～8周
C. 5～8周
D. 4～10周
E. 5～10周
[答疑编号111080104：针对该题提问]
『正确答案』B
B1型题
（1～2题共用备选答案）
A.生长迟缓
B.受精卵死亡
C.致畸作用
『正确答案』A
3.致畸试验首选的实验动物是（ ）
A.大鼠
B.小鼠
C.豚鼠
D.家兔
E.狗
[答疑编号111080103：针对该题提问]
『正确答案』A
A2型题
1.器官形成期这一阶段对致畸作用的敏感性最强，人体主要器官系统的形成期是受精后第几周（ ）
①具有致畸作用，但无母体毒性出现；②出现致畸作用的同时也表现母体毒性；③仅具有母体毒性，但不具有致畸作用。
2.致畸作用的毒理学特点
（1）器官发生期的胚胎对致畸物最为敏感
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生殖毒性试验的目的在于了解外源化学物及其代 谢产物对机体成年哺乳动物的生殖功能和生育力 的影响。
多代繁殖试验在整个生命期内接触受试化学物， 更符合人类实际生活中长期低剂量接触食品添加 剂、微量重金属、农药及环境污染物的情况。
（1）试验方法原则
生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家
兔。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。
灌胃或胶囊法。
利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各16～20只，
或雌性16～20只，雄性8～10只。
（2）试验方法
①三代两窝生殖试验
大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物或以其它 方式与受试物接触，共进行8～12周，即直到性 发育成熟，相当出生后4个月左右。每周至少称 体重一次，记录进食量并观察有无中毒症状或死
一般设三个剂量组，另设对照组。
最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平， 希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或
死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。
低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。 另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。
动物接触受试物的方式应参照人类实际接触途径。 一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也可采用
致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前）接触 外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用。
变异：是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或 由于分化改变而引起的中途歧异。
2. 发育毒性的表现
① 生长迟缓
即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的 发育过程缓慢。 ② 致畸作用 由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表 现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出 生后立即可被发现。
③功能不全或异常
即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及
行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生
后一定时间才被发现，因为正常情况下，有些功
能在出生后一定时间才发育完全。
④胚胎或胎仔致死作用
某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育
F0（断奶或出生８周）
第一次交配 给予受试物8到12周
第通饲 料，观察其生长发育情况
F１b
断乳后给予受试 物８到１２周
F２a
观察三个月，喂饲普通饲 料，观察其生长发育情况
F２b
断乳后给予受试 物８到１２周
F３a
F３b
2．两代一窝和一代一窝生殖试验
近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一 窝试验法。 两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同， 但只进行到第二代F2，每代只交配一窝。
特殊毒性试验及其评价
第一节 致突变作用及其试验方法与评价 第二节 生殖发育毒性作用及其试验与评价 第三节 致癌作用及其试验方法与评价
第二节 生殖发育毒性及其试验 与评价方法
一、 生殖毒性试验与评定 二、发育毒性试验与评定
一、生殖毒性试验与评定
外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖毒性。 生殖毒性可发生于妊娠期，也可发生于妊娠前期和 哺乳期。 生殖毒性试验主要研究外来化合物对生殖细胞发生、 卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程的 损害及其评定。过去也称为繁殖试验。
分娩时出生幼仔数 出生后4天存活幼仔数
4．幼仔哺乳成活率反映雌性动物授乳哺育幼 仔的能力。 幼仔哺乳成活率= —————————×100%
出生后4天幼仔存活数 21天断奶幼仔存活数
（四）结果判定
将试验组动物各项观察指标统计结果与对照组动 物进行比较，如试验动物在交配、妊娠、幼仔存
活、幼仔发育（哺育）等方面受到影响，则说明
亡。
将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比例为1
︰1或2︰1，直到受孕或进行3周为止。雌鼠受
孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交配3周
后，如仍未受孕，则停止交配，并进行生殖器
官病理学检查。
确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片，
检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精
日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易 脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或 检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。
交配雌性动物数 妊娠雌性动物数
2．正常分娩率反映雌性动物妊娠过程是否受到影 响。 正常分娩率= ————————
妊娠动物数 正常分娩雌性动物数
×100%
3．幼仔出生存活率反映雌性动物分娩过程是 否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在 出生4天内死亡。
幼仔出生存活率= ———————————×100%
亲代动物（F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死 亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠 断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共 生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲 鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情 况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 ～12周，直到性发育 成熟，选出雌雄各16～20只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a， F2a断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶后， 将F1b淘汰。F2b交配处理方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次，所产仔 鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。
受试物对动物繁殖功能有损害作用。
二、发育毒性试验与评定
1. 基本概念 发育毒性指出生前经父体和（或）母体接触外源
理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有
害作用，包括结构畸形、生长迟缓、功能障碍及 死亡。 能造成发育毒性的物质称为发育毒物。
畸形：指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖 学上形态结构的缺陷。
两代一窝生殖试验
出生第8周给予受试物（F0） 第16~19周 雌雄交配
F1（每窝选留幼仔８只，雌雄各半） 断奶，给予受试物 F１交配 F2出生，每窝留８只幼仔 F2断奶，检查发育情况
（三）观察指标
在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部
生育繁殖过程，可观察下列4个指标：
1．受孕率反映雌性动物生育能力以及雌性动物受 孕情况。 受孕率= ————————×100%