西黄丸降低PGE2等炎性标志物并抑制乳腺癌干细胞的分子机制研究
西黄丸含药血清对人乳腺癌细胞生长的阻碍
西黄丸含药血清对人乳腺癌细胞生长的阻碍【摘要】目的研究西黄丸含药血清对人乳腺癌细胞系（MCF-7）生长及其细胞周期散布的阻碍。
方式应用MTT比色法检测肿瘤细胞活性，流式细胞仪分析细胞周期相对散布。
结果西黄丸含药血清对人乳腺癌细胞系（MCF7）有较强的抑制作用，其抑制率与含药血清浓度呈直线相关。
流式细胞仪周期分析结果显示含药血清处置24 h，S期细胞比例增加，G2/M期细胞减少；处置48 h后，G0/1期细胞增多，S 期细胞减少。
结论西黄丸含药血清可抑制人乳癌细胞系（MCF7）细胞生长，并可干扰其细胞周期。
【关键词】西黄丸含药血清人乳腺癌细胞细胞周期The Effects of Xihuang Pill Drug Serum on the Growth and Cell Cycle of Human Breast Carcinoma CellsAbstract：ObjectiveTo investigate the effects of Xihuang pill drug serum on the growth of breast cell(MCF7) and the cell of tumor cell was detected by MTT and cell cycle was analyzed by flow cytometry .ResultsXihuang pill drug serum had an inhibitory effect on the rumor cell,which was positively related to the drug serum content .Typital morphological changes of apoptosis were observed under the transmission electronmicroscope. FCM showed that the cell cycle treated with Xihuang pill drug serum for 24 h,the ratio of cells in S phase increased ,while that in G2/M phase decreased;after 48 h treatment,the ratio of cells in G0/1phase increased ,and S phase pill drug serum can inhibit the growth of breast carcinoma cell (MCF-7) and its cell cycle in vitro.Key words：Xihuang pill drug serum；Human breast carcinoma cells； Cell cycle西黄丸，又名犀黄丸，方出清—王洪绪所著《外科证治全生集》，为医治“乳岩”“瘰疬”“痰核”“肺痈”之名方［1］。
西黄丸辅助治疗中晚期乳腺癌的疗效观察
西黄丸辅助治疗中晚期乳腺癌的疗效观察为了探讨西黄丸在乳腺癌辅助治疗中的临床应用可行性，该研究对西黄丸用于乳腺癌治疗的近期及远期临床疗效进行观察。
将入选本研究的84例中晚期乳腺癌患者按照随机数表法平均分为对照组及治疗组，每组各42例，患者均曾接受手术治疗，并在术后采用紫杉醇+表柔比星+环磷酰胺（TEC）方案进行化学治疗。
治疗组患者在此基础上联用西黄丸进行辅助治疗。
随访3个月对近期疗效进行评估，评估指标采用2组患者的KPS评分（Kamofsky评分）、病灶稳定率以及治疗毒副反应；远期疗效则长期随访观察并比较2组患者总生存率及无进展生存率。
该研究发现治疗后2组患者KPS评分均较治疗前显著升高（P＜0.05），且在治疗后治疗组KPS评分显著优于对照组，具有统计学意义（P＜0.05）；与对照组相比，病灶稳定率由85.71%显著提高至92.86%，具有统计学意义（P＜0.05）；2组患者毒副反应发生率无显著差异。
长期随访中位时间为20.15个月，与对照组相比，治疗组患者2年总生存率及无进展生存率均显著升高（P＜0.05）。
该研究结果表明，西黄丸可用于中西医结合治疗中晚期乳腺癌，具有较好的近、远期疗效。
标签：西黄丸；中晚期乳腺癌；近期疗效；远期疗效乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，在全球女性恶性肿瘤发病率中居首位，约占23%，也是造成肿瘤相关死亡的主要病因，高达约14%，严重威胁女性健康。
目前，乳腺癌的临床治疗主要方案仍然与大多数恶性肿瘤相同，即以手术为主的综合治疗，如放射治疗及化学治疗等，然而药物治疗所带来的不良反应较大，不但对临床疗效造成负面影响，而且可影响患者的生存期及生存质量[1]。
中药在肿瘤治疗方面的开展及研究已经有较长时间，中药与化疗/放疗联用可表现出更好的临床疗效[2]。
西黄丸在临床用于乳腺癌的辅助治疗已有数十年。
西黄丸由我国清代名医王洪绪所创，由牛黄、麝香、乳香及没药等中药组成，具有抗肿瘤、抑制耐药及减轻毒副反应等生物活性。
西黄丸挥发油抗肿瘤作用及其免疫学机制的实验研究
西黄丸挥发油抗肿瘤作用及其免疫学机制的实验研究杨伟;关硕;胡俊霞;曾常茜;梁文波;马杰;高文斌【摘要】目的：研究西黄丸挥发油组分对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其免疫学机制，筛选西黄丸抗肿瘤的活性部位。
方法：雌性Wistar大鼠70只，随机抽取10只为空白对照组，剩余60只建立Walker256乳腺癌细胞荷瘤大鼠模型，建模后随机分为阴性对照组（模型组）、挥发油高、中、低剂量组，西黄丸高剂量组和香菇多糖组（阳性对照组），每组10只，灌胃给药，2次/天，连续14天。
腹主动脉采血，取瘤组织称重，计算抑瘤率；采用ELISA法检测外周血IL-2、IL-6、IL-10、IFN-γ和TGF-β水平；采用流式细胞术检测CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、粘附分子B7-1（CD80）细胞含量。
结果：挥发油高、中剂量组抑瘤率分别为28.4%、24.1%；与模型组比较，挥发油高、中剂量组IL-2和IFN-γ平均水平及CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、B7-1含量均明显升高（P<0.05）。
结论：西黄丸挥发油具有一定的抗肿瘤作用，是西黄丸抗肿瘤活性部位之一；西黄丸挥发油可通过上调外周血IL-2、IFN-γ水平及CD3+ T细胞、CD8+ T细胞、B7-1细胞含量提高荷瘤大鼠免疫清除功能。
%This study was aimed to explore the antitumor effect of volatile oil of X ihuang pill and its immune mecha-nism in order to screen the antitumor active site of Xihuang pill. Among 70 female Wistar rats, 10 rats were random-ly selected as the blank control group; and the other 60 rats was used in the establishment of walker 256 breast can-cer cell tumor-bearing rat models. The model rats were randomly divided into the negative control group (model group), high-dose volatile oil group, middle-dose volatile oil group, low-dose volatile oil group, high-dose Xihuang pill group, and lentinan group (positive controlgroup), with 10 rats in each group. The intragastric administration was given twice a day for 14 days. Blood was taken from the abdominal aorta. Tumor tissues was removed and weighed to calculate the tumor inhibitory rate. ELISA method was used to detect the level of IL-2, IL-6, IL-10, IFN-γ and TGF-β in peripheral blood. The flow cytometry was used to detect the content of CD3+ T cell, CD4+ T cell, CD8+ T cell, and B7-1 cell (CD80). The results showed that the tumor inhibitory rates of volatile oil of high-dose group and middle-dose group were 28.4% and 24.1%, respectively. Compared with the model group, the average level of IL-2 and IFN-γ of volatile oil of high-dose group and middle-dose group and CD3+ T cell, CD8+ T cell, B7-1 cell con-tent were obviously increased (P< 0.05). It was concluded that volatile oil of Xihuang pill had certain antitumor ef-fect, which was one of the antitumor active sites of Xihuang pill. The volatile oil of Xihuang pill upregulates the lev-els of IL-2 and IFN-γ, as well as the contents of CD3+ T cell, CD8+ T cell, B7-1 cell in order to increase the im-mune clearance function of tumor-bearing rats.【期刊名称】《世界科学技术-中医药现代化》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】5页(P68-72)【关键词】西黄丸挥发油;Walker256乳腺癌细胞;大鼠;细胞因子;T细胞亚群;B7-1;免疫清除【作者】杨伟;关硕;胡俊霞;曾常茜;梁文波;马杰;高文斌【作者单位】大连大学医学院大连 116622;大连大学医学院大连 116622;大连大学医学院大连 116622;大连大学医学院大连 116622;大连大学医学院大连116622;遵义医学院遵义 563000;大连大学附属中山医院大连 116000【正文语种】中文【中图分类】R285.5西黄丸又称犀黄丸，由牛黄、麝香、乳香（醋制）、没药（醋制）四味名贵中药组成，是抗癌中成药的经典名方，西黄丸用于乳腺癌、肝癌、白血病等多种恶性肿瘤的治疗和辅助治疗，取得了较好的疗效[1]。
西黄丸乙醇提取物抗肿瘤作用及其免疫学机制实验研究-马杰,杨伟,关硕,等
43第16卷 第4期 2014 年 4 月辽宁中医药大学学报JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCMVol. 16 No. 4 Apr .，2014西黄丸，又称犀黄丸，由牛黄、麝香、乳香、没药四种名贵中药组成。
目前广泛用于肿瘤的治疗及辅助治疗，临床用药证实其可提高肿瘤患者的生存率，改善中晚期肿瘤患者的生活质量[1]。
现代药理研究证实西黄丸组方药材富含抗癌成分，如乳香具有抗炎诱导细胞凋亡及抗血管生成的作用[2]；没药对C6胶质瘤细胞、A2780细胞等均表现出显著的抗肿瘤活性[3]。
目前单药研究显示西黄丸各味药材中有效成分多为酯溶性成分，如牛磺酸、β榄香烯、三萜、麝香酮等。
本实验从生物药剂学的角度采用乙醇提取西黄丸活性部位，既注重中药的整体作用及多成分、多靶点的特点，又提高了原药的生物利用度。
为西黄丸乙醇提取物抗肿瘤作用及其免疫学机制实验研究马杰1，杨伟2，关硕2，胡俊霞2，曾常茜2，高文斌3，梁文波2（1.遵义医学院，贵州 遵义 563000；2.大连大学医学院，辽宁 大连 116622；3.大连大学附属中山医院，辽宁 大连 116000）摘 要：目的：研究西黄丸乙醇提取物对荷瘤大鼠的抗肿瘤作用及其免疫学机制。
方法：采用w256乳腺癌细胞建立大鼠荷瘤模型，随机分为7组：正常组，模型对照组，香菇多糖组，西黄丸高剂量组，西黄丸乙醇提取物低、中、高剂量组。
治疗14 d，取瘤，计算抑瘤率；采用流式细胞技术检测外周血CD 4+、CD 8+和B7-1的含量；采用ELISA 技术检测外周血中IL-6、IL-10、TGF-β的表达水平，结果与模型对照组和香菇多糖组比较。
结果：西黄丸乙醇提取物高剂量对荷瘤大鼠的肿瘤抑制率为36.8%，与模型组对比西黄丸乙醇提取物可明显提高CD 4+、CD 8+细胞的比例，降低IL-6、IL-10、TGF-β的表达水平（P <0.05）；相当原药剂量的乙醇提取物优于西黄丸原制剂。
西黄丸抗肿瘤临床应用及药理作用机制研究进展
参考内容
一、引言
西黄丸，一种广泛应用于临床的中成药，具有清热解毒，消肿散结的功效。 近年来，随着中医药研究的深入，西黄丸的抗肿瘤作用及临床应用得到了广泛。 本次演示将就西黄丸的抗肿瘤作用及临床应用研究进展进行综述。
二、西黄丸的抗肿瘤作用
西黄丸的抗肿瘤作用主要表现在以下几个方面：
1、诱导肿瘤细胞凋亡：研究表明，西黄丸可通过调节肿瘤细胞的信号通路， 诱导肿瘤细胞凋亡。这些信号通路包括p53、Bcl-2、 Bax等与细胞凋亡相关的基 因。
西黄丸抗肿瘤临床应用及药理作用 机制研究进展
01 摘要
目录
02 引言
03
西黄丸抗肿瘤临床应 用
04 直接杀伤肿瘤细胞
05 增强机体免疫功能
06 抑制血管生成
目录
07 西黄丸药理作用机制 研究进展
09 参考内容
08 结论
摘要
西黄丸是一种传统的中药抗肿瘤药物，具有清热解毒、消肿散结等作用。本 次演示综述了西黄丸在抗肿瘤临床应用及药理作用机制方面的研究进展，以期为 进一步研究提供参考和启示。
2、抑制肿瘤细胞增殖：西黄丸能够抑制肿瘤细胞的增殖，主要通过抑制细 胞周期蛋白的表达，使肿瘤细胞停滞在分裂间期，从而抑制肿瘤细胞的增殖。
3、抑制肿瘤血管生成：西黄丸还能够抑制肿瘤血管的生成，通过抑制血管 内皮生长因子的表达，抑制肿瘤血管的生成，从而阻断肿瘤的营养供应，达到抗 肿瘤的作用。
三、西黄丸的临床应用研究进展
谢谢观看
西黄丸在临床广泛应用于各种肿瘤的治疗。通过对大量临床文献的梳理，可 以总结出西黄丸在抗肿瘤方面的主要作用机制包括：直接杀伤肿瘤细胞、增强机 体免疫功能、抑制血管生成等。
直接杀伤肿瘤细胞
研究表明，西黄丸中的牛黄、麝香等成分具有直接的抗肿瘤作用，能够直接 杀伤肿瘤细胞，诱导其凋亡。通过动物实验和细胞实验，发现西黄丸对多种肿瘤 细胞具有抑制作用，如肝癌、肺癌、乳腺癌等。
西黄丸通过ERα和HSP90在乳腺癌中发挥抗雌激素作用
西黄丸通过ERα和HSP90在乳腺癌中发挥抗雌激素作用目的内分泌治疗在乳腺癌治疗中发挥重要的作用,以雌激素受体(ER)为作用靶点的他莫昔芬出现,改变了女性内分泌治疗的历史。
但是,他莫昔芬能够兴奋机体部分雌激素受体,引起子宫内膜癌等不良反应。
雌激素受体纯抑制剂氟维司群被批准用于晚期乳腺癌,该药物不仅能够竞争性结合雌激素受体,而且能够通过结合ER使其免于分子伴侣HSP90的保护,降解ER受体的表达,成为芳香化酶抑制剂辅助治疗失败后一线标准治疗方法。
但其生物体内活性和利用率有限。
HSP90是分子伴侣家族中一员,参与多种蛋白的折叠、转运、降解。
HSP90与乳腺癌发生、发展、耐药关系密切:首先,与雌激素受体阳性乳腺癌细胞增殖相关的ER/PR是HSP90的伴侣蛋白;其次,与乳腺癌耐药相关的PI3K/AKT信号通路中AKT是HSP90的伴侣蛋白;同时,HER2、Raf也是HSP90的伴侣蛋白。
因此HSP90在乳腺癌中的作用尤为值得研究。
西黄丸用于乳腺癌的治疗始于1740年,由清代名医王维德所创并载于《外科证治全生集》,其后多本古籍提及其在乳腺癌治疗中作用。
西黄丸由乳香、没药、牛黄、麝香组成。
现代药理学研究发现,西黄丸在乳腺癌、肺癌、结肠癌以及恶性肿瘤淋巴转移方面有治疗作用,但是对其作用机制尚没有深入的研究。
为了解多靶点、多成分的西黄丸处方用于乳腺癌治疗的作用机制,本研究通过采用网络药理学、分子对接预测西黄丸抗乳腺癌的主要活性成分和作用靶点。
并通过体内外实验对其进行验证。
方法:1.应用台盘蓝拒染法、CCK8细胞毒活性实验,检测西黄丸及各单药、西黄丸主要活性成分对ER阳性细胞株,HER2阳性细胞株,以及三阴性乳腺癌细胞株增殖作用;采用裸鼠乳腺癌细胞株(T47D,SKBr3)移植瘤,检测西黄丸及其单药对不同分子分型乳腺癌细胞株的体内移植瘤的抑制作用;应用PNCA免疫组化检测西黄丸及各单药对移植瘤增殖作用。
2.应用流式细胞,Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒,PI试剂分别检测西黄丸及各单药、西黄丸主要活性成分对ER 阳性细胞,HER2阳性细胞,以及三阴性乳腺癌细胞株凋亡和周期的影响;应用TUNEL试剂盒检测裸鼠移植瘤凋亡作用。
西黄丸抗肿瘤作用的研究概况
西黄丸抗肿瘤作用的研究概况作者：钱娜金沈锐陈姗姗来源：《云南中医中药杂志》2016年第09期摘要：西黄丸是中国传统的抗癌名方，主要用于治疗乳岩、横痃、痰核、流注、瘰疬等，现阶段被公认为临床抗肿瘤明星。
它不仅受到科研人员的大量研究，而且也广泛的被应用于临床。
本文主要从近几年来对西黄丸抗肿瘤作用进行的临床实践、实验研究以及对西黄丸的不同制备等方面进行一些概括。
关键词：西黄丸；抗肿瘤作用；综述中图分类号：R273文献标志码：A文章编号：1007-2349（2016）09-0094-02西黄丸又称犀黄丸，是清代名医王洪绪所创，载于《外科证治全生集·卷四》，是由牛黄、麝香、乳香（醋制）和没药（醋制）为原料制成的中成药。
其主要作用为清热解毒、化痰散结、活血祛瘀，用于治疗乳岩、横痃、痰核、流注、瘰疬等。
现代西黄丸也用于各种肿瘤的治疗，并取得不错的疗效。
现主要从西黄丸抗肿瘤作用的临床实践、实验研究以及对西黄丸的不同制备等方面进行整理如下。
1临床实践对西黄丸在临床上抗肿瘤作用的运用研究主要是在西医放、化疗的基础上结合西黄丸进行的疗效观察。
大量临床观察也证明了在介入化疗治疗中晚期恶性肿瘤的同时给予西黄丸治疗能够起到稳定病灶，提高生活质量，减轻化疗药物产生的骨髓抑制、胃肠道反应、肝功能损害等毒副反应的作用[1～2]。
傅向平等[3]研究西黄丸联合化疗对晚期胃癌患者临床疗效及安全性分析。
将80例确诊为晚期胃癌患者平均分为观察组及对照组，每组40例，对照组患者行顺铂+多西他赛4-5一 FU 化疗方案，观察组在对照组的基础上加口服西黄丸，3 g/次，2次/d。
结果显示对晚期胃癌患者在化疗基础上加用西黄丸可有效降低患者毒副反应及其发生率，有利于提高患者疗效和生活质量。
2实验研究随着西黄丸抗肿瘤作用的疗效逐渐在临床上被认可，引起很多学者对西黄丸抗肿瘤的机制进行研究，发现其作用机制主要体现在调节免疫功能、抗新生血管生长、抑制肿瘤细胞增殖及诱导肿瘤细胞凋亡等几方面。
西黄丸的化学成分分析及其抗肿瘤药理作用研究进展
第39卷第3期20 2 1年3月中华中医药学刊C H I N E S E A R C H I V E S O F T R AD I T I O N A L C H I NE S E M E D I C I N EV«l. 39 No. 3Mar. 2 0 2 1DOI：10. 13193/j.issn. 1673-7717.2021.03.008西黄丸的化学成分分析及其抗肿瘤药理作用研究进展顾媛媛1,孙阳1，韩玉生1，田明1，周忠光1，崔立然2(I.黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040:2.齐齐哈尔医学院附属第一医院，黑龙江齐齐哈尔161041)摘要：西黄丸亦名犀黄九，是中医传统抗癌名方由牛黄、縻香、乳香（醋制）、没药（醋制）粉末加黄米饭以水泛丸而 成，具有清热解毒、和营消肿、活血化瘀之功效用于痈疽、疔毒、瘰疠、流注、癌肿等西黄丸主要含有的活性成分包括五环三萜类成分、挥发油成分、甾体类成分、胆红素等，其抗肿瘤作用机制主要涉及抑制肿瘤细胞和肿瘤干细胞的生长和 侵袭、阻止肿瘤侵袭转移、逆转免疫抑制微环境等多种途径：对西黄丸的主要化学成分和其抗肿瘤机制方面研究进行综 述，为西黄九抗肿瘤作用的进一步研究和临床应用提供参考关键词：西黄九；化学成分;抗肿瘤；综述中图分类号：R284.丨文献标志码：A文章编号：1673-7717(2021 )03^003(W)4Analysis of Chemical Constituents of Xihuang P ill(西黄丸）and Its Antitumor Pharmacological EffectsGU Yuanyuan1 ,SUN Yanj；1,HAN Yusheng1 ,TIAN Ming1 ,ZHOU Zhongguang1 ,CUI Liran2(1. Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, Heilongjiang,China；2. First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical College, Qiqihar 161041 ,Heilongjiang,China)Abstract:Xihuang Pill(西黄丸），also known as Xihuang Pill(渾黄丸），is a traditional anti- cancer prescription in traditional Chinese medicine.It is made of Niuhuang(Bovis Calculus) ,Shexiang(Moschus),Ruxiang(Olibanum)(vinegar processing),Moyao(Myrrha)(vinegar processing)and yellow rice.It is used lor gangrene,furunculosis,scrofula,deep multiple abscess and cancer.The main active ingredients in Xihuang Pill include pentacyclic triterpenoids,volatile oils,steroids and bilirubin.The mechanism of Xihuang Pill mainly involves inhibiting the growth and invasion of tumor cells and stem cells,preventing tumor invasion and metastasis and reversing the immunosuppressive microenvironment.This article reviewed the main chemical components of Xihuang Pill and its anti —tumor mechanism,and provided references for further research and clinical application of Xihuang Pill.Keywords：Xihuang P ilK S^A.)；chemical composition；anti - tumor；review中药作为天然产物，已被大量研究证实其抗瘤作用明确、毒副作用小，从中草药中开发抗肿瘤药物越来越受到人们的重 视。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
西黄丸降低PGE2等炎性标志物并抑制乳腺癌干细胞的分子机制
研究
西黄丸是一则中药复方方剂,为清代名医王洪绪所创,首见于《外科证治全生集》。
由牛黄、麝香、乳香和没药四味中药组成,具有清热解毒,消肿散结的功效。
在古代常用来治疗乳岩、瘰、痰核、肺痈、小肠痈等炎性恶疾,在现代常用来辅助治疗肿瘤疾患。
研究传统复方西黄丸治疗抗癌的分子机制,对于推广和拓展其临床应用十分必要,也对挖掘祖国中药宝库具有重要的意义。
乳腺癌是临床上最常见的女性恶性肿瘤之一。
其致死率逐年增加。
乳腺癌的常规治疗方法包括手术、放射治疗和化疗。
紫杉醇是临床上常用的乳腺癌化疗方案,最初用于包括乳腺癌在内的多种恶性肿瘤的治疗具有十分显著的疗效;但随着其广泛的应用,乳腺癌对其耐药的矛盾日益突出。
临床上西黄丸辅助治疗乳腺癌,具有增加化疗反应率,减少不良反应和延长患者生存期的作用;但具体的分子机制尚不明确。
肿瘤干细胞理论的提出为化疗耐药的发生提供了一个新的思路。
肿瘤干细胞理论认为,肿瘤生长是由隐藏在癌症中极少数的肿瘤干细胞所驱动,具有多项分化、自我更新和耐药等基本特征。
这使得肿瘤干细胞(CSC)难以被化疗药物杀灭,相反,在化疗药物杀死大量普通肿瘤细胞时,反而将肿瘤干细胞富集,分化成耐药且更具侵袭性的肿瘤细胞。
这也就解释了临床观察到在首次放化疗成功后,肿瘤常常出现复发、肿瘤休眠和转移的现象。
西黄丸延缓乳腺癌化疗耐药与肿瘤干细胞之间是否存在着一定的联系,这值得我们进一步的研究。
近年来,西医也认可了炎症与肿瘤的密切关系,2011年,著名学者Weinberg
将炎症列入肿瘤“新十大特征”之一,选择性抗炎药也被列为肿瘤治疗的新方向。
有研究者发现,非留体类抗炎药是通过环氧合酶-2/前列腺素E2(COX-2/PGE2)等
炎症通路,抑制肿瘤干细胞来实现抗癌的作用。
化疗在杀死大量普通的肿瘤细胞时,濒死的肿瘤细胞分泌出大量的PGE2,激
活肿瘤干细胞,分化成耐药且更具侵袭性的肿瘤细胞。
因此PGE2及其下游的炎症通路和肿瘤干细胞与化疗耐药性具有密切的关联,对它们的动态变化的研究十分重要,抑制PGE2炎症通路可能抑制肿瘤干细胞的激活,进而延缓化疗耐药的发生。
现代药理学研究表明,西黄丸的组成药材乳香和没药的成分具有强烈的抗炎作用。
这提示我们:应当重点研究西黄丸对PGE2炎症通路的影响及其可能的机制,同时也为阐述西黄丸抗癌机理、联用化疗药的协同药效的机理提供了重要的突破口。
目的本实验旨在以炎症信号通路为切入点,考察传统中药西黄丸对PGE2、白细胞介素(IL)-6、IL-8、血管内皮生长因子(VEGF)等病理标志物的影响,探索西黄丸对乳腺癌干细胞的作用,为阐明西黄丸的临床价值提供依据和参考。
方法西黄丸为成药,不能直接用于分子细胞实验,常用的提取方法包括水提液、煎液、动物血清等方式。
高温煎液会导致麝香、乳香等药材中挥发性成分的损失;查阅文献发现,西黄丸低温浸液处理后,其提取物体外抑瘤效果较含药血清更为明显,因而本实验采
用低温浸液进行体外研究。
从同仁堂采购同一批号的西黄丸,参考文献方法,一次性获取大批量低温浸提液,混匀后分装冻存于-80℃备用。
用色谱质谱技术鉴定西黄丸浸液中关键成分进行质量控制;用CCK8法检测
人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖,流式细胞术检测其凋亡;划痕实验检测MCF-7
与MDA-MB-231的愈伤迁移能力;利用乙醛脱氢酶(ALDH)阳性比例和细胞成球实验检测乳腺癌干细胞数量,Western Blot检测上皮间质转变(EMT)标志物E-钙连蛋白(E-cadherin)和纤粘蛋白(Fibronectin)的表达;ELISA检测细胞上清中PGE2及IL-6、IL-8的分泌量,Western Blot检测信号转导和转录激活因子
3(STAT3)磷酸化水平,RT-PCR检测IL-8、VEGF的基因水平。
结果对比标准品与空白基质,发现西黄丸浸液供试品各成分分离良好,空白基质无干扰,与参考标准品对应的位置存在11-羟基-β-乙酰乳香酸以及胆红素的峰;各成分的二级质谱图对照品和供试品一致。
说明实验所用西黄丸低温浸提液中含有乳香酸和胆红素这两种成分。
这不仅保障了本课题所有实验的质量控制,为西黄丸浸液的质量提供了客观参考依据,而且为下一步对其成分的深入研究打下了良好的基础。
单独用0、50、75、150μL/mL西黄丸浸提液处理MDA-MB-231细胞72h,可以显著抑制细胞的增殖(P<0.01),且具有剂量依赖性。
不同浓度的西黄丸浸液联用10nM紫杉醇后,抑制增殖的效果优于单用紫杉醇;其中联用75 μL/mL、150μL/mL西黄丸浸液时,抑制效果更加显著(分别P<0.05,P<0.01)。
单独用西黄丸浸液能抑制细胞的增殖;紫杉醇联合西黄丸浸液的抑制效果要优于单用紫杉醇。
西黄丸浸液能促进细胞的凋亡,75μL/mL、150 μL/mL西黄丸浸液处理后凋亡细胞比例从空白对照组的6.375%分别上升到19.97%、36.38%,具有显著性差异(P<0.01)。
10nM紫杉醇处理细胞72h后,凋亡占比23.95%;联用75μL/mL西黄丸浸液后,细胞凋亡比例仅比紫杉醇单独处理稍高,差异并不显著(P=0.69);而联用150 μL/mL西黄丸浸液后,细胞凋亡比例上升到31.82%(P<0.01)。
单独用西黄丸浸
液能诱导细胞凋亡;紫杉醇联用西黄丸浸液的效果要优于单用紫杉醇。
正常培养情况下,MCF-7和MDA-MB-231都表现出了较强的愈伤迁移能力。
尤其对照组MDA-MB-231在36h时划痕两侧细胞己迁移至中线位置,加入西黄丸浸液后细胞的迁移能力受到了明显的抑制;而MCF-7的迁移速度较慢,在72 h时划痕两侧细胞才开始接触,加入不同浓度的西黄丸浸液后,细胞的迁移同样也受到了抑制。
这说明西黄丸浸液具有抑制细胞迁移的作用。
流式细胞术检测乳腺癌干细胞标志物ALDH+细胞的比例。
结果显示,西黄丸浸液可以降低由紫杉醇和多烯紫杉醇处理9%h后诱导升高的ALDH+细胞的比例,说明此时乳腺癌干细胞被富集;联用西黄丸浸液,则抑制紫杉醇或多烯紫杉醇诱导升高的ALDH+细胞的比例。
说明西黄丸具有抑制乳腺癌干细胞的作用,同时也初步明确,紫杉醇诱导乳腺癌干细胞富集的化疗模型的作用时间为96 h。
成球实验直接观察西黄丸浸液对乳腺球的影响。
结果显示,75 μL/mL西黄丸浸液处理后,肿瘤球的数目从空白对照组的161个/5000cells下降到55个
/5000cells,具有显著差异(P=0.007),并且球体直径明显减小;说明西黄丸浸液能抑制乳腺球的大小和数目,具有抑制乳腺癌干细胞的作用。
在MCF-7、MDA-MB-436与ZR75-1中,表皮细胞生长因子(EGF)诱导
后,Fibronectin/E-cadherin的比值增加,表明EMT的发生;联用西黄丸浸液则抑制EGF诱导升高的Fibronectin/E-cadherin的比值,表明西黄丸浸液抑制了 EGF 诱导的EMT。
实验结果表明,西黄丸浸液可能通过抑制EMT的发生来抑制肿瘤细胞迁移能力和肿瘤干细胞。
同样采用紫杉醇处理细胞96 h后,检测细胞上清中PGE2炎症通路的细胞因子PGE2、IL-6和IL-8的水平,发现紫杉醇能诱导细胞分泌更高量的PGE2、IL-6和IL-8;而联用西黄丸则明显抑制紫杉醇诱导升高的PGE2、IL-6和IL-8的蛋白水平。
并且检测IL-8的相对mRNA水平发现,紫杉醇同样上调其基因水平;而联用西黄丸浸液则抑制了这种上调。
这说明紫杉醇能诱导PGE2炎症通路中细胞因子PGE2、IL-6和IL-8的水平升高,而西黄丸可以抑制紫杉醇化疗诱导升高的PGE2、IL-6和IL-8的水平。
接下来检测其下游STAT3的水平发现,用0、25、50、75、150、3000μL/mL西黄丸浸液处理细胞24 h后,西黄丸浸液能抑制STAT3的磷酸化水平;浓度越大,抑制效果越明显,具有浓度相关性(P<0.01)。
紫杉醇化疗诱导96 h发现,P-STAT3上调;而联用西黄丸浸液可以抑制紫杉醇诱导的P-STAT3上调。
VEGF位于STAT3下游,主要参与肿瘤细胞新生血管的生成。
检测VEGF的相对mRNA水平发现,西黄丸浸液能有效抑制紫杉醇诱导升高的VEGF的相对mRNA水平。
结论体外实验证明,西黄丸浸液可以降低因紫杉醇化疗刺激而升高的乳腺癌干细胞表型和标志物,具有抑制乳腺癌干细胞的作用。
此外,西黄丸浸液能抑制紫杉醇化疗模型诱导激活的PGE2炎症通路,降低紫杉醇诱导升高的PGE2、IL-6、IL-8等炎症因子的水平,进而抑制其下游STAT3
和VEGF的激活。
这提示我们,西黄丸抑制乳腺癌干细胞可能与其抑制化疗诱导激活的PGE2炎症通路有关,这可能是西黄丸延缓乳腺癌化疗耐药的分子机制之一。
同时,本实验对PGE2及其下游炎症因子动态变化的研究,为深入挖掘这些炎症因子的临床意义提供了实验基础,也为扩大西黄丸的临床用药范围提供了客观
依据。