实验三、蛋白质的盐析分离和凝胶层析曹志贱
凝胶分离蛋白实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶分离蛋白的基本原理和方法。
2. 掌握凝胶分离蛋白的实验操作步骤。
3. 通过实验，验证凝胶分离蛋白的可行性。
二、实验原理凝胶分离蛋白实验是利用凝胶的分子筛作用，根据蛋白质分子大小和形状的差异进行分离。
实验中，将蛋白质样品加入凝胶层析柱中，通过洗脱液的作用，使不同大小的蛋白质在凝胶中停留不同的时间，从而实现分离。
三、实验材料1. 凝胶层析柱2. 蛋白质样品3. 洗脱液4. 试剂：考马斯亮蓝、乙醇、乙酸、苯酚等5. 仪器：紫外分光光度计、凝胶成像系统、离心机等四、实验步骤1. 制备凝胶层析柱：将凝胶层析柱装满凝胶，确保凝胶紧密填充。
2. 准备蛋白质样品：将蛋白质样品与适量的洗脱液混合，使其成为均匀的溶液。
3. 加样：将制备好的蛋白质样品加入凝胶层析柱中。
4. 洗脱：用洗脱液对凝胶层析柱进行洗脱，收集不同时间的洗脱液。
5. 分析：将收集到的洗脱液进行考马斯亮蓝染色，用紫外分光光度计测定吸光度，分析蛋白质的分离效果。
6. 结果记录：记录实验过程中观察到的现象和结果。
五、实验结果与分析1. 蛋白质分离效果：通过考马斯亮蓝染色，观察到不同大小的蛋白质在凝胶层析柱中分离效果良好，表明凝胶分离蛋白实验成功。
2. 蛋白质纯度：根据洗脱液吸光度变化，分析蛋白质的纯度。
实验结果表明，分离得到的蛋白质纯度较高。
3. 实验误差分析：实验过程中可能存在的误差有凝胶层析柱制备不均匀、样品处理不当等。
为减小误差，应严格控制实验条件，提高实验精度。
六、实验结论凝胶分离蛋白实验成功实现了蛋白质的分离，证明了凝胶分离蛋白的可行性。
实验结果表明，凝胶分离蛋白具有操作简便、分离效果良好、纯度高等优点，是一种有效的蛋白质分离方法。
七、实验讨论1. 实验过程中，凝胶层析柱制备是关键步骤。
为提高分离效果，应确保凝胶层析柱制备均匀。
2. 实验过程中，样品处理对分离效果有较大影响。
应严格控制样品处理条件，提高实验精度。
3. 实验结果与分析表明，凝胶分离蛋白是一种有效的蛋白质分离方法，具有广泛的应用前景。
实验三 凝胶过滤法分离蛋白质
实验三凝胶过滤法分离蛋白质【实验目的】了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
【基本原理】凝胶过滤其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。
凝胶过滤的主要装置是填充凝胶颗粒的层析柱。
目前使用较多的凝胶时交联葡聚糖凝胶（商品名是Sephadex）。
这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
其交联高的小号胶Sephadex-G-25适用于脱盐。
当在填充好凝胶颗粒的层析柱顶加入被分离的分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时，小分子物质可进入胶粒内部，而受排的大分子不能进入胶粒内部，由此二者在洗脱过程所经路程长短不同而得以分离。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路程短，最先流出；而渗入胶粒内部的小分子物质受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出；通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按由大到小的顺序流出实现分离的目的。
凝胶过滤的操作条件温和，适于分离不稳定的化合物。
凝胶颗粒不带电荷，不与被分离物质发生反应，因此溶质回收率接近100%，而且设备简单、分离效果好、重现性强，凝胶柱还可反复使用，所以广泛应用于蛋白质等大分子物质非分离纯化、分子质量测定、脱盐等用途。
在含有血红蛋白（M w=64500）的溶液中加入过量的高铁氰化钾（K3Fe（CN）6，M w=327.25）,血红蛋白与高铁氰化钾反应生成高铁血红蛋白（MetHb）。
为了除去多余的高铁氰化钾，等到较纯的MetHb（红褐色）洗脱较快，而小分子高铁氰化钾（黄色）洗脱较慢，从而达到将MetHb完全分离出来的目的。
【实验试剂、材料和器材】（一）试剂（1）0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：称取磷酸氢二钠20.7472g和磷酸二氢钠3.1167g，溶于约900mL的蒸馏水中，调pH值到7.0，最后定容到1000mL。
实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析
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蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
• 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）
• 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶 解等）
• 蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有 机溶剂）
• 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点 分离）
• 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、 HPLC）
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二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过 滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下 进行。
三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸 碱变性等）
四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
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蛋白质的进一步纯化（细分级）
• 一、透析和超过滤
• /~cmg/
• / • 赵永芳. 生物化学技术原理及应用.北京. 科学出版
社.2002 • 沈同 王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002
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２、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
• 蛋白质的盐析分级分离 • SephadexG-25脱盐 • 盐离子的跟踪检测 • ＵＶ检测蛋白质
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凝胶层析原理
• 凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等 。
• 对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全
被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体
积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进
入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的
体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程
球蛋白分离实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握盐析法分离蛋白质的原理和基本方法；2. 掌握凝胶层析法分离蛋白质的原理和基本方法；3. 通过实验，了解球蛋白的特性及其分离纯化过程；4. 验证实验结果，提高实验操作技能。
二、实验原理1. 盐析法：利用蛋白质在不同浓度的盐溶液中溶解度差异，通过沉淀和溶解的方式实现蛋白质的分离。
在实验中，清蛋白和球蛋白在高浓度中性盐溶液中（常用硫酸铵）溶解度不同，清蛋白溶解，球蛋白沉淀。
2. 凝胶层析法：根据蛋白质与无机盐类之间分子量的差异，通过凝胶颗粒的网孔分离蛋白质。
分子直径大的蛋白质不能进入凝胶颗粒的网孔，而分子直径小的无机盐能进入凝胶颗粒的网孔，从而达到去盐的目的。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：血清、硫酸铵、Sephadex G-25凝胶柱、醋酸纤维素薄膜、染色剂、缓冲液等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、凝胶层析仪、紫外检测仪、移液器、烧杯、试管等。
四、实验步骤1. 盐析法分离球蛋白（1）取一定量的血清，加入等体积的半饱和硫酸铵溶液，充分混匀。
（2）将混合液在4℃下静置过夜。
（3）将混合液以3000r/min离心10分钟，收集沉淀。
（4）将沉淀用少量去离子水洗涤，重复洗涤两次。
（5）将洗涤后的沉淀溶解于适量去离子水中，得球蛋白粗制品。
2. 凝胶层析法纯化球蛋白（1）将Sephadex G-25凝胶柱用去离子水充分浸泡，使其充分膨胀。
（2）将球蛋白粗制品加入凝胶柱中，让其自然流出。
（3）收集流出的蛋白质溶液，得纯化后的球蛋白。
3. 球蛋白鉴定（1）将纯化后的球蛋白用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定其纯度。
（2）观察电泳图谱，判断球蛋白的纯度。
五、实验结果与分析1. 盐析法分离球蛋白通过实验，观察到清蛋白溶解于硫酸铵溶液中，而球蛋白沉淀，说明盐析法可以有效地分离清蛋白和球蛋白。
2. 凝胶层析法纯化球蛋白通过凝胶层析法，观察到蛋白质在凝胶柱中分离，纯化后的球蛋白分子量较小，表明凝胶层析法可以有效地去除无机盐，纯化球蛋白。
沪科教版选修1生物技术实践《蛋白质的提取和分离》评课稿
沪科教版选修1生物技术实践《蛋白质的提取和分离》评课稿摘要本文是对沪科教版选修1生物技术实践课程中《蛋白质的提取和分离》这一实验的评课稿。
本文将从实验目的、实验原理、实验过程、实验结果及讨论、实验评价等方面对该实验进行详细描述和评价。
1. 实验目的本次实验的目的是让学生了解蛋白质的提取和分离技术的原理和方法，并通过实际操作掌握蛋白质的提取和分离过程。
2. 实验原理蛋白质的提取和分离是通过一系列的化学和分离方法，将混合物中的蛋白质分离出来。
通常的提取和分离方法包括碱解法、酸解法、溶解法等。
在本次实验中，我们采用了酸解法，利用酸性环境下蛋白质的溶解性进行提取。
具体操作流程如下： 1. 准备样品：准备需要提取的蛋白质样品，如鸡蛋白、牛奶等。
2. 酸解：将样品与酸性溶液（如盐酸）混合，使蛋白质溶解于溶液中。
3. 过滤：将溶液过滤，去除杂质和固体颗粒。
4. 蛋白质沉淀：向过滤后的溶液中加入饱和盐溶液，蛋白质在饱和盐溶液中会沉淀出来。
5. 蛋白质分离：将蛋白质沉淀进行离心、洗涤等处理，最终得到分离的蛋白质。
3. 实验过程本次实验的实验过程如下：步骤1：准备样品 - 准备需要提取的蛋白质样品，如鸡蛋白或牛奶。
步骤2：酸解 - 取一定量的样品，加入适量的酸性溶液（如盐酸），搅拌均匀。
步骤3：过滤 - 将酸解的样品通过滤纸或滤膜进行过滤，去除杂质和固体颗粒。
步骤4：蛋白质沉淀 - 将过滤后的溶液中加入饱和盐溶液（如硫酸铵），搅拌均匀。
- 静置一段时间，观察到有白色沉淀产生。
步骤5：蛋白质分离 - 将产生的蛋白质沉淀用离心机进行离心分离，去除上清液。
- 重复离心和洗涤的步骤，直至洗涤液中不再有颜色。
- 最后用无菌去离子水洗涤蛋白质沉淀。
4. 实验结果及讨论本次实验的实验结果可以通过观察蛋白质提取和分离的过程得出。
观察到酸解后的样品溶液变得浑浊，说明蛋白质溶解于溶液中。
经过过滤后，观察到溶液中有白色沉淀生成，这是蛋白质在饱和盐溶液中沉淀的结果。
实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析
• 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通过交 联剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联剂添加越 多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。以G-x表示型 号，后面的数字可以看出交联度，数字越小，胶联度越大 。
• SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100300µm，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积流出 ，盐等小分子从内水体积流出。
实验步骤（一）卵球蛋白的沉淀
实验步骤（二）卵球蛋白的脱盐
注意事项
• 实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用 ，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
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实验成绩评分方法
• 实验预习情况（10%） • 实验操作情况（30%） • 实验报告情况（30%） • 实验考试成绩（20%） • 实验素质（遵守实验室规则和道德行为
）（10%）
本学期实验课安排
9月11日 生化实验常规仪器的使用
4学时
9月18日
蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐 6学时
11月13日 DNA定量和纯度测定
6学时
11月20日 DNA变形和复性以及Tm值得测定
6学时
11月27日 蔗糖酶的制备及各步比活力的测定
8学时
12月4日 底物浓度对酶活性的影响及km值测定
8学时
12月11日 正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件
8学时
12月18日 氨基转换反应的定性鉴定
6学时
12月25日
二、有机溶剂沉淀分离
有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于 过滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低 温下进行。
蛋白质的盐析实验报告
一、实验目的1. 了解蛋白质盐析的原理和方法。
2. 掌握蛋白质盐析实验的基本操作步骤。
3. 分析蛋白质盐析过程中可能出现的现象及其原因。
二、实验原理蛋白质盐析是指在蛋白质溶液中加入一定浓度的中性盐，使蛋白质从溶液中沉淀析出的过程。
这是因为中性盐中的离子与蛋白质分子争夺水分子，破坏了蛋白质的水化层，导致蛋白质溶解度降低，从而发生沉淀。
蛋白质盐析是一个可逆过程，当降低盐浓度或去除盐离子时，蛋白质可以重新溶解。
盐析过程中，蛋白质的沉淀和溶解受多种因素影响，如盐的种类、浓度、pH值、温度等。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋清、硫酸铵、蒸馏水、pH试纸、移液器、试管、烧杯、搅拌器等。
2. 实验仪器：电子天平、恒温水浴锅、显微镜等。
四、实验步骤1. 准备蛋清溶液：取新鲜鸡蛋，轻轻敲破蛋壳，取出蛋清，按新鲜鸡蛋清1份，九份0.9%NaCl溶液的比例稀释配制蛋清液，混匀，用四层纱布过滤后备用。
2. 配制硫酸铵溶液：称取适量硫酸铵，溶于适量蒸馏水中，配制成所需浓度的硫酸铵溶液。
3. 盐析实验：将蛋清溶液分为若干份，分别加入不同浓度的硫酸铵溶液，充分搅拌，观察蛋白质沉淀情况。
4. 沉淀与溶解实验：将沉淀的蛋白质用蒸馏水洗涤，观察蛋白质是否能够重新溶解。
5. 分析实验现象：记录蛋白质沉淀和溶解的情况，分析实验结果。
五、实验结果与分析1. 实验现象（1）随着硫酸铵浓度的增加，蛋清溶液中蛋白质沉淀逐渐增多。
（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大。
（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解。
2. 实验分析（1）蛋白质盐析过程中，随着硫酸铵浓度的增加，蛋白质溶解度降低，导致蛋白质沉淀。
（2）当硫酸铵浓度达到一定值时，蛋白质沉淀量达到最大，说明此时蛋白质溶解度最低。
（3）继续增加硫酸铵浓度，蛋白质沉淀量不再增加，说明蛋白质已经达到饱和状态。
（4）用蒸馏水洗涤沉淀后的蛋白质，部分蛋白质重新溶解，说明盐析是一个可逆过程。
蛋白质的盐析实验报告
蛋白质的盐析实验报告蛋白质的盐析实验报告引言：蛋白质是生命体内最基本的分子之一，它们在细胞内发挥着重要的生物学功能。
了解蛋白质的性质和结构对于深入研究生物学和医学领域具有重要意义。
蛋白质的盐析实验是一种常用的方法，可以通过溶液中添加盐类来使蛋白质发生沉淀，从而进一步研究其性质和结构。
本实验旨在探究蛋白质的盐析现象及其影响因素。
材料与方法：1. 蛋白质溶液：选取适量的蛋白质样品，溶解于适量的缓冲液中，调节pH至所需范围。
2. 盐溶液：选取不同种类和浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。
3. 试管：清洁干净的试管，用于混合蛋白质溶液和盐溶液。
4. 离心机：用于离心实验样品，分离沉淀和上清液。
5. 分光光度计：用于测定上清液中蛋白质的浓度。
实验步骤：1. 准备蛋白质溶液：将适量的蛋白质样品溶解于缓冲液中，调节pH至所需范围。
2. 准备盐溶液：选取不同种类和浓度的盐溶液，如氯化铵、硫酸铵等。
3. 将蛋白质溶液和盐溶液按照一定比例混合，轻轻摇匀。
4. 放置混合液在室温下静置一段时间，观察是否出现沉淀。
5. 将混合液置于离心机中，以适当的速度离心一段时间，使沉淀和上清液分离。
6. 取出上清液，用分光光度计测定蛋白质的浓度。
结果与讨论：在本次实验中，我们选取了不同种类和浓度的盐溶液，与蛋白质溶液按照一定比例混合。
在观察和离心过程中，我们发现不同盐溶液对蛋白质的盐析现象有着不同的影响。
首先，我们发现盐溶液的种类对蛋白质的盐析现象有着重要的影响。
以氯化铵为例，当其浓度逐渐增加时，蛋白质的盐析现象逐渐明显。
这是因为氯化铵中的氯离子和铵离子与蛋白质中的极性基团发生相互作用，从而导致蛋白质分子间的相互作用增强，形成较大的聚集体，最终发生沉淀。
其次，我们还观察到盐溶液的浓度对蛋白质的盐析现象有着明显的影响。
随着盐溶液浓度的增加，蛋白质的盐析现象逐渐加剧。
这是因为盐溶液的浓度增加会导致溶液中盐离子的浓度增加，从而增强了与蛋白质分子间的相互作用，使其更容易形成沉淀。
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机溶剂）； ➢ 蛋白质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点
分离）； ➢ 进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、
HPLC）； ➢ 鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，
淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）； ➢ 含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）。
SDS PAGE电泳法：测定亚基数 超速离心：成分均一 其它：如, 结晶法……
蛋白质分级分离方法(粗分级)
一、盐析 二、有机溶剂沉淀 三、选择性沉淀法(等电点、热变性、酸碱变性等) 四、吸附法 五、重金属盐沉淀法
蛋白质的进一步纯化(细分级)
一、透析和超过滤 二、层析(色谱,Chromatography)分离 1.气相色谱(色谱仪) 2.液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱
实验三
蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐
【实验目的与要求】
(1)了解蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术； (2)学习蛋白质的盐析分级分离原理； (3)学习蛋白质凝胶层析分离原理。
蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术
➢ 材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）； ➢ ➢ 破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解
液。 ➢ 为什么不用氯化钡？因为氯化钡易同蛋白质形成
沉淀。 ➢ 记录结果：
1 23 4 5 6 789 - - + +++ ++ + - - -
思考题
1. 蛋白质的沉淀作用还有哪些方法？哪些是 变性了？哪些没有变性？在分离蛋白质时 常使用哪些方法？
2. 柱层析有哪些种类？其分离物质的基本原 理？
预习实验四
凝胶层析
大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只 能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为 外水体积）；而小分子不被排阻，可自由扩散，渗透 进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走 （所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入 凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出 柱外，而大分子先从柱中流出。这样样品经过凝胶层 析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分 离的目的。
A280
3、ＵＶ检测蛋白质
蛋白质脱盐洗脱曲线 6 5 4 3 2 1 0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 洗脱液（ml)
蛋白质洗脱曲线记录方式
4、盐离子的检测
➢ 用醋酸钡检测溶液中的硫酸根离子。 ➢ 灵敏度高，与溶液中的硫酸根离子可以形成白色
的沉淀。同时不能同蛋白质形成沉淀。 ➢ 实验中要设对照，即加入双蒸水和醋酸钡检测溶
➢ SephadexG-25粗：吸水量2.5ml/g，干粒子直径100300µm，筛孔40-60。大部分蛋白质分子从外水体积 流出，盐等小分子从内水体积流出。
【实验内容与操作】
1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离； 2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐； 3、ＵＶ检测蛋白质； 4、盐离子的检测。
蛋白质的定量测定：考马斯亮析法
有机溶剂沉淀法
层析法
电泳法
电学法 等电聚焦
离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析……。
超速离心法
纯度、Mw 和pI测定
层析法：凝胶过滤;高效液相色谱法 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层 析等） 3.高效液相色谱（色谱仪）
谢谢欣赏
THANK YOU FOR WATCHING
1、蛋白质（卵球蛋白）的盐析分级分离
2、蛋白质（卵球蛋白） SephadexG-25脱盐
2.5
10管
ml
注意事项
➢实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次 实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中； ➢样品溶液的浓度大一些好，但粘度不宜大，加 样体积通常为凝胶柱床体积的1%-10%； ➢洗脱用的液体与凝胶溶涨和凝胶平衡时所用的 一样； ➢ 洗脱速度要恒定； ➢凝胶暂时不用时，要加防腐剂（如0.02%叠氮 化钠溶液）； ➢ 再次使用凝胶时可再生后使用。
【实验原理】
蛋白质的盐析
用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白 质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性 盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子所带的电荷 被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析 出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析 作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比 分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使 不同分子量的蛋白质分别析出。
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
凝胶层析载体
➢ 用作凝胶的载体物质有交联葡聚糖、聚丙烯酰胺和琼 脂糖等。使用最多的是交联葡聚糖。
➢ 交联葡聚糖的商品名为Sephadex,是由链状葡聚糖通 过交联剂1—氯代—2，3—环氧丙烷交联而成。交联 剂添加越多，孔径越小，吸水量也越小；反之越大。 以G-x表示型号，后面的数字可以看出交联度，数字 越小，胶联度越大。