SNP分型方法及科研应用
低密度snp液相芯片及其应用的制作方法
低密度snp液相芯片及其应用的制作方法摘要：一、低密度SNP液相芯片的概述二、低密度SNP液相芯片的制作方法1.芯片设计2.探针制备3.芯片封装与检测三、低密度SNP液相芯片的应用1.基因分型2.基因表达谱分析3.临床诊断与治疗四、总结与展望正文：一、低密度SNP液相芯片的概述低密度SNP液相芯片（Low-Density SNP Liquid Array Chip）是一种基于微流控技术的基因检测平台，具有高灵敏度、高准确性、高通量等特点。
它主要通过检测样品中特定基因序列的SNP（单核苷酸多态性）位点，为基因研究、疾病诊断和治疗等领域提供重要信息。
二、低密度SNP液相芯片的制作方法1.芯片设计低密度SNP液相芯片的设计主要包括两个方面：一是芯片布局，二是探针布局。
芯片布局主要考虑通道数、反应区大小、样品加载方式等因素，以实现高通量、高灵敏度的检测。
探针布局则根据需求选择合适的探针序列，以覆盖目标基因的SNP位点。
2.探针制备探针制备是低密度SNP液相芯片制作的关键环节。
通常采用化学合成法或生物合成法获得探针，然后通过特定方法将探针固定在芯片的反应区域。
探针固定方法有多种，如共价固定、吸附固定等。
3.芯片封装与检测芯片封装是将制备好的探针芯片进行保护、密封处理，以防止外界污染和探针降解。
封装方法有多种，如激光焊接、热压密封等。
检测环节则采用荧光检测、激光扫描等技术，对芯片上的SNP位点进行检测。
三、低密度SNP液相芯片的应用1.基因分型低密度SNP液相芯片可用于基因分型，通过对样本中特定基因的SNP位点进行分析，判断个体所属的基因型。
这对于遗传病筛查、基因关联研究等具有重要意义。
2.基因表达谱分析低密度SNP液相芯片可高通量地检测基因表达水平，有助于研究基因在特定条件下的表达模式和调控机制。
3.临床诊断与治疗低密度SNP液相芯片可用于发现与疾病相关的基因突变，为临床诊断、治疗和预后评估提供依据。
此外，它还可用于药物基因组学研究，指导个体化药物治疗。
SNP分析原理方法及其应用
SNPs检测方法
1.理想的检测SNPs的方法 的方法
——发现未知的SNPs，或 或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求 (2) 快速、简便、高通量 高通量、自动化 (3) 费用低廉
动脑筋的技术活，有意思 有意思，有趣，形式万变; 掌握基本原理,本质不离其中 本质不离其中
SNP分析原理方法及其应用 分析原理方法及其应用
卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室
遗传分析内容
n
基因组: 染色体水平 DNA水平 基因突变 重复 重复, 缺失, 倒位,重排 甲基化 基因组不稳定 基因组不稳定 多态性: SNP STR, CNV
SNPs（single nucleotide polymorphisms) single nucleotide polymorphisms)
wt/w t wt/m
m/m
DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化 插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化
突变（Gene Mutation)
单核苷酸多态（SNP）
n<0.1% n<0.1% n生殖细胞或体细胞
n150% n生殖细胞
SNP技术在医药领域中的发展与应用
SNP技术在医药领域中的发展与应用SNP(Single Nucleotide Polymophism)是指变异频率不低于1%的单核苷酸变异。
在整个人类的基因组中大约每1000个碱基就存在一个SNP，研究表明人类基因组上的SNP总量大概是300万个。
随着分子生物技术的不断完善与发展，SNP正在逐步成为第三代分子遗传学的标志,人体的许多性状表达差异、对药物或某种疾病的易感性程度等等都可能与SNP有关。
SNP将对疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等提供一个全新的工具。
一、SNP的概念SNP意为单核苷酸多态性，也就是研究个体之间1个碱基之间的微小差异。
基因组的序列组合有很多种，SNP仅仅是其中最为常见的一种，在临床治疗上有重要的地位。
由于人类的基因序列差异仅仅为0.1%[1]，同时SNP是由个人的遗传背景所决定，并且可以作为临床治疗上具有意义的诊断标志物（Marker），所以世界上大多经济发达国家都投入了大量的人力物力财力进行SNP的解析，以期达到本民族SNP特异性数据库。
二、SNP检测技术1、基于PCR的方法也叫AS-PCR，(ALLELE-SPECIFIC PCR)的办法。
主要原理是利用引物在扩增时3'端相对高的BASE要求,进行设计。
这个方法是最便宜的，已经商品化并且用于实际的检测之中。
2、基于酶切分型的方法依靠限制性内切酶的特异性进行单SNP的分型。
SNP突变与否，可能影响某个酶识别位点的存在或消失。
通过酶切产物的电泳条带，判断SNP的突变的情况，即纯和，野生纯和，和杂和子。
当没有直接可利用的酶切位点时，可以采用突变引物中个别BASE，从而凑成切点的设计，也叫做RG-PCR（Restriction site Generation PCR）。
三、SNP对医药科学研究的作用和意义1、提高新型药物筛选的准确性目前常用的常规筛选方法大致分为以下几种：基于高通量的与目标分子结构相结合的筛选法；通过解析蛋白质分级结构来选择合成目标产物；采用蛋白质芯片的方法进行杂交筛选。
SNP检测原理和应用
SNP检测原理和应用SNP（单核苷酸多态性）是指在基因组中存在的单个核苷酸变异，也是造成个体之间遗传差异的主要形式之一、SNP检测原理是通过不同的技术手段检测基因组的SNP位点，并将不同个体之间的SNP变异与疾病、药物反应等进行关联分析，从而用于研究和预测人类复杂疾病的发生机制和个体化治疗。
SNP检测的主要技术包括基于凝胶电泳的限制片段长度多态性（RFLP）、聚合酶链反应（PCR）扩增测序、DNA芯片技术和基因测序等。
其中，RFLP是早期应用最广的技术，主要通过特定限制酶酶切目标DNA片段，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，根据不同基因型的片段长度差异进行分型和分析。
PCR扩增测序技术则通过特定引物扩增目标DNA片段，再通过测序技术获得具体的SNP位点信息。
DNA芯片技术则通过固相杂交将DNA片段与特定的SNP探针结合，然后通过荧光标记的信号检测技术获得SNP位点信息。
而基因测序技术则是目前应用最广泛和高通量的SNP检测技术，通过测序获得整个基因组的SNP信息。
SNP检测的应用非常广泛。
首先，SNP检测可用于研究人类复杂疾病的发病机制。
复杂疾病的发生不仅受到环境因素的影响，还与多个基因的相互作用有关。
通过SNP检测，可以发现与复杂疾病相关的SNP位点，并进一步研究这些位点与疾病的关联关系以及其在疾病发生发展过程中的作用。
这为疾病预防、治疗和个体化医疗提供了重要的依据。
其次，SNP检测可用于预测个体对药物的反应和副作用。
由于个体对药物的反应存在巨大的差异，因此通过SNP检测可以发现与药物代谢、药物作用靶点相关的SNP位点，并据此预测个体对药物的反应。
这样可以实现个体化的用药方案，提高药物疗效，减少副作用。
此外，SNP检测还可以用于亲子鉴定、法医学鉴定、种群遗传学研究、植物和动物遗传改良等领域。
例如，通过SNP检测可以判断是否为亲生子女，鉴定遗传疾病的患者或罪犯，追溯人类的遗传演化历程，以及选择适应环境的作物和动物品种。
SNP分型技术简介
原理
质谱法是一种基于质谱技术的SNP分型方法。通过对PCR扩增产物进行
质谱分析，可以准确地确定SNP位点的碱基类型。
02
优点
质谱法具有高分辨率、高准确性和无需荧光标记的优点。该方法可以检
测多种类型的SNP，包括单核苷酸变异、插入/缺失等。
03
缺点
质谱法需要使用昂贵的质谱仪器，且对样本的纯度和质量要求较高。此
优点
TaqMan探针法具有高灵敏度、高特异性和可定量分析的 优点。同时，该方法可以实现高通量SNP分型，适用于大 规模样本的筛查和研究。
缺点
TaqMan探针法需要使用特定的荧光标记探针，成本较高。 此外，对于某些复杂的SNP位点或多态性区域，可能需要 设计多个探针以覆盖所有可能的变异类型。
质谱法
01
实验对照
设置合适的实验对照，以验证实验结果的可 靠性和准确性。
重复实验
进行必要的重复实验，以确保结果的稳定性 和可重复性。
质量控制
在实验过程中实施严格的质量控制措施，包 括试剂、仪器和实验操作等方面。
数据分析流程和方法选择
数据预处理
对原始数据进行清洗、整理和标准化 处理，以便于后续分析。
统计分析
采用适当的统计方法对数据进行分析， 如描述性统计、假设检验和方差分析 等。
亲子关系鉴定
通过分析被鉴定人的SNP信息，可以确定亲子关系，为家庭纠纷、 遗产继承等问题提供解决方案。
法医物证分析
SNP分型技术可以用于法医物证的分析和鉴定，如血迹、毛发等生 物样本的基因分型，为刑事案件的侦破提供证据。
05
实验设计与数据分
析方法论述
实验设计原则及注意事项
样本选择
确保样本具有代表性，避免选择偏差，同时 考虑样本量和多样性。
SNP分析原理方法及其应用
SNP分析原理方法及其应用SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是指在基因组中的一些位置上，不同个体之间存在的碱基差异，是常见的遗传变异形式之一、SNP分析是研究SNP在基因与表型之间关联性的方法，用于揭示SNP与遗传疾病、药物反应性等的关系。
本文将介绍SNP分析的原理、方法以及其应用。
一、SNP分析原理1.SNP检测技术：SNP检测技术包括基于DNA芯片的方法、测序技术、实时荧光PCR等。
其中，高通量测序技术是最常用的SNP检测方法，可以同时检测数千个SNP位点。
2.数据分析与统计学方法：通过SNP检测技术获得的数据可以分为基因型数据（AA、AB、BB等）和等位基因频率数据（A频率、B频率等）。
统计学方法常用的有卡方检验、线性回归、逻辑回归等，用于研究SNP与表型之间的关联性。
二、SNP分析方法1.关联分析：关联分析是研究SNP与表型之间关联性的基本方法。
常用的关联分析方法包括单基因型分析、单SNP分析、基因组关联分析（GWAS）等。
单基因型分析主要是比较单个SNP的基因型在表型不同组之间的差异；单SNP分析是研究单个SNP是否与表型相关；GWAS是通过分析数万个SNP与表型之间的关系来找到与表型相关的SNP。
2. 基因型预测：基因型预测是根据已有的SNP数据，通过统计模型来预测个体的基因型。
常用的基因型预测方法有HapMap、PLINK等。
3. 功能注释：功能注释是研究SNP位点的生物学功能，揭示SNP与基因功能、表达水平之间的关系。
常用的功能注释工具有Ensembl、RegulomeDB等。
三、SNP分析应用1.遗传疾病研究：SNP与遗传疾病之间存在着密切的关系。
通过SNP分析可以发现与遗传疾病相关的SNP位点，进一步揭示疾病发生的机制，为疾病的诊断、治疗提供依据。
2.药物反应性研究：个体对药物的反应性往往存在较大差异，这与个体的遗传背景密切相关。
snp芯片的原理及应用
SNP芯片的原理及应用1. 引言单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）是基因组中最常见的变异形式，它在人类疾病的研究中起着重要的作用。
SNP芯片是一种高通量基因分型技术，可以用来检测个体基因组中的上万个SNP位点。
本文将介绍SNP芯片的原理以及其在各个领域的应用。
2. SNP芯片的原理SNP芯片是一种将DNA序列多态性引入到DNA芯片上的高通量基因分型工具。
其基本原理如下：1.选择SNP位点：根据研究目的和基因组数据库的数据，选择与感兴趣的生物学过程或疾病相关的SNP位点。
2.设计引物：根据选择的SNP位点序列设计引物，通常采用探针杂交的方式。
引物的设计需要考虑SNP的位点和碱基对应情况。
3.制备芯片：将设计好的引物固定在芯片表面上，并将每个SNP位点的引物排列成阵列状，以便同时检测多个SNP位点。
4.样品准备：从被检测的个体中提取DNA样品，并使用PCR扩增目标SNP位点的DNA片段。
5.杂交：将扩增好的DNA样品加入到芯片上，利用引物与样品中相应DNA片段的互补序列形成特异性的杂交。
6.洗涤：通过洗涤过程去除未结合的DNA片段，使只有与芯片上相应引物杂交的DNA片段留在芯片上。
7.形成芯片图像：利用特定的扫描仪扫描芯片，根据芯片上不同位置的荧光信号强度来分析每个SNP位点上的基因型。
3. SNP芯片的应用SNP芯片在各个领域的应用非常广泛，下面列举了几个典型的应用示例：3.1. 人类遗传疾病研究SNP芯片在人类遗传疾病研究中发挥着重要作用。
通过比较病例组和对照组的SNP芯片数据，可以发现与疾病相关的SNP位点，进而研究疾病的致病机制和发展规律。
例如，在癌症研究中，SNP芯片常用于寻找与癌症发生和进展相关的遗传变异。
3.2. 农业育种SNP芯片在农业育种中的应用越来越广泛。
农业科学家可以利用SNP芯片分析大量的植物或动物个体，筛选出具有优良基因型的品种或个体，从而加快优质农产品的培育速度。
SNP分子标记简介
2.研究意义
1.作为第三代分子标记，用于疾病基因的定 位、克隆和鉴定。
2.基因多态性研究：研究SNPS本身对机体的 影响（生理特征、病理条件下的差异）
3.SNP的分类
1.根据基因组分布位置： 基 因 编 码 区 SNPs（cSNPs） 基 因 间 SNPs (iSNPs) 基 因 周 边 SNPs(pSNPs)
5.1 SNP的常用分型鉴定方法
1.基于酶切的 SNP 分型方法
聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)
一种或一种以上的限制性内切酶 DNA片段
存在SNP位点
酶切片段大小和数目出现差异
5.2 SNP的常用分型鉴定方法
2.基于杂交的分型方法
TaqMan 技术
5.3 SNP的常用分型鉴定方法
2.根据对生物遗传性状的影响： 蛋白编码SNP 非蛋白编码SNP
3.SNP的特点
1.遗传稳定性高
相比串联重复微卫星等多态性标记，SNP是基于单核苷酸的突变，突变频率较低，遗传 稳定性相对较高。
2.位点丰富且分布广泛
一般认为，在含30亿个碱基的人类基因组中，估计每1000个碱基可出现1个,那么整个基 因组中有超过300万个核苷酸多态位点。可以在任何已知或未知的基因内及其附近找到 SNP位点。
4.SNP的不足
• 开发成本较高，标记量少。在海洋水产养殖动物中，SNP 标记的开发和应用处于初级阶段，目前还未广泛应用于遗 传连锁图谱的构建。
5.SNP的筛选
1.大规模基因组测序
2. EST、GSSБайду номын сангаас公共数据库中发掘
5.SNP的常用分型鉴定方法
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SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
灵活的 多基因 研究方 案
PCR ARRAY产品形式
把感兴趣基因的qPCR Primers按一定的排布规律交联到 96-well-Plate中，可以形成以下模块方式：
核酸新技术及科研应用
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF 常规片段分
析 SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
科研 （核酸）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
目的
排除假阳性结果。
或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
态），相关位点可能不同。跟踪文献：
Genome-wide association study identifies a
举例
susceptibility locus for schizophrenia in Han Chinese at 11p11.2.（ Nat Genet.）
CNV分型示意图
CNV科研应用
高通量实验结果的验证 候选区段的研究 肿瘤相关基因的研究
高通量实验结果的验证
方法：
利用CGH研究结果（或NGS测序结果），在少数个体中发现了与性状相关 的CNV，则该结果需要在大样本量中进行验证。
目的
排除假阳性结果。 或者多基因决定的复杂性状，或者不同基因背景和不同环境（生活状
候选基因分析实例
举例
Functional variant in methionine synthase reductase
intron-1 significantly increases the risk of congenital
heart
disease
in
the
Han
Chinese
population.(Circulation)
候选基因分析实例
（新）实验思路
2012年9月5日，ENCODE项目的阶段性研究结果被整理成30篇论文发表于 《自然》（6篇），《基因组研究》（6篇）和《基因组生物学》（18篇） 上。研究结果显示，人类基因组内的非编码DNA至少80%是有生物活性的， 而并非之前认为的“垃圾” DNA （junk DNA）。
定量PCR重复 96次结果示 意图
终点法定量之殇：因PCR效率差异使得同一个实验却获得不同的PCR终产物浓度。
竞争性PCR原理
与实时荧光定量PCR比较，具有相同的准确性！
CNV分型示意图
Reference AC
AC
基因组
质粒DNA
PCR模板完全一样，仅多出2 个碱基，所以扩增效率一致 。 无论处于PCR扩增的哪个时 期，PCR终产物比值即初始 模板比值。
32
检测范例
利用本方法对野生型小鼠30-6与转基因小鼠30-1、26-4、26-6、26-7 的丘脑（H）与卵巢（O）mir505的3p和5p两种形式进行定量检测，扩增曲线 如下图和转基因相对表达量如右柱状图示。
33
miRNA科研应用
临床中miRNA的科研应用
选取少量 样本
NGS 或芯片
筛选表达 差异 miRNA
相同，两者用共同引物进行扩增，具备相同的扩增效率， PCR终产物的浓度比值反应了起始模板的浓度比值。
*无论PCR扩增是否存在平台期，这个规律一直存在！
竞争性PCR原理
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是通过每反应孔中存在相同的竞争性PCR模
板来校对PCR管内多重PCR的扩增差异，获得可靠的结果。
Replication Study Confirms Link between TSPAN18
Mutation and Schizophrenia in Han Chinese （Plos One）
GWAS 结果的验证
（新）实验思路：
GWAS阳性 不是原因 位点
重测序
是原因
功能实验
发现新 SNP
LD分析
筛选SNP
，大样本 量统计验
证
功能实验
候选基因分析
方法：
通过选择与性状可能相关的候选基因，用该候选基因的已知或重测序分析 得到标签SNP，通过大样本的统计分析验证该基因是否和该性状相关。
候选基因的来源包括（文献）：
功能分析的结果 模式动物的结果 GWAS的结果。
举例
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
SNP:最
常用的 分子遗 传学研 究方法
SNP分型原理
LDR（ligase detection reaction)
*Taq
高温
特异性高 温控循环，信号量大。
原理
只有检测点处的碱基互补配 对时，连接酶的连接反应才 能进行。
…… Six PLIN tag single nucleotide polymorphisms (rs7176403, rs8179078, rs6496589, rs8179043, rs894160, rs1052700) were genotyped in 1571 patients with stroke。。。 。。。。。。
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量
PCR-ARRAY MCF
传统遗 传学方 法，家 系分析
STR定义
微卫星标记（Microsatellite）也称为短串联重复序列 （STR）或简单重复序列（SSR），是广泛分布在真核生物
基因组中的简单重复序列。 STR: short tandem repeat SSR: simple sequence repeat
>D5S818 AGGAATGCTTTAGTGCTTTTTAGCCAAGTGATTCCAATCATAG CCACAGTTTACAACATTTGTATCTTTATCTGTATCCTTATTTAT ACCTCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTAT CTATCTTCAAAATATTACATAAGGATACCAAAGAGGAAAATCA CCCTTG
STR
miRNA
mRNA （lnRNA
）
目录
PCR-LDR
MCF
常规片段分 析
SYBR定量 SYBR定量 PCR-ARRAY
MCF
CNV：最
新的分 子遗传 位标
竞争性PCR原理
MCF：Multiplex Competitive Fluorescent-PCR(MCF-PCR ）
竞争性PCR基本原理 竞争性PCR技术是有一段竞争性序列，与目标基因序列基本
No Association of PLIN Polymorphisms With Hemorrhagic and
Ischemic Stroke（Stroke）
候选基因分析
标签SNP的选择：
hapmap计划的数据进行标签SNP（tag SNP）分析 重测序
5’UTR，3’UTR调控区 外显子及外显子内含子剪接区 “DNA百科全书”数据库中列出的序列
ENCODE （Encyclopedia of DNA Elements， DNA元素百科全书)项 目。
候选基因分析实例
基于“DNA元素百科全书”的科研流程
疾病相关 候选基因
查找 “调控区”
“百科全书” 研究结果
重测序
上个案例的 研究流程
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
12 genes-8 samples
24 genes-4 samples
32 genes-3 samples
48 genes-2 samples
96 genes-1 sample
翼和
客户基因 引物优化 引物固化
定制的PCR ARRAY
客户
Mix cDNA
优势
定制PCR array
无需优化
上机
不惧降解
肿瘤相关基因的研究
方法：
肿 瘤 样 本 中 ， 经 常 出 现 相 关 基 因 的 丢 失 （ LOH loss of heterozygosity 杂合性丢失）和扩增，对一定量的临床样本进行验证。 丢失！！
肿瘤组织是个混合物！！
科研 （核酸）
DNA 基因组
RNA 基因功能
SNP
CNV
STR
我公司采取的实验方法：改 进的stem-Loop引物与优化 的SYBR Green提高RT效率
一个说明： 最经典的miRNA荧光定量方法是Taqman实时荧光定量PCR方案，但因大多数 miRNA序列非常特异，SYBR方案已经满足检测需求。当然是如果对于一些家族 miRNA进行差异化鉴定，因为其序列仅有1个碱基差异，所以只能用Taqman方 法检测。
候选位点的来源包括（文献）：
模式动物的结果 CGH(或NGS）的结果。
举例
Independent estimation of the frequency of rare CNVs in the UK population confirms their role in schizophrenia（Schizophr Res.）