SNP分子标记的原理及应用解读
SNP分析原理方法及其应用
SNPs检测方法
1.理想的检测SNPs的方法 的方法
——发现未知的SNPs，或 或检测已知的SNPs
(1) 灵敏度和准确度的要求 (2) 快速、简便、高通量 高通量、自动化 (3) 费用低廉
动脑筋的技术活，有意思 有意思，有趣，形式万变; 掌握基本原理,本质不离其中 本质不离其中
SNP分析原理方法及其应用 分析原理方法及其应用
卢大儒 复旦大学生命科学学院 遗传工程国家重点实验室
遗传分析内容
n
基因组: 染色体水平 DNA水平 基因突变 重复 重复, 缺失, 倒位,重排 甲基化 基因组不稳定 基因组不稳定 多态性: SNP STR, CNV
SNPs（single nucleotide polymorphisms) single nucleotide polymorphisms)
wt/w t wt/m
m/m
DNA序列上单个碱基对的置换、插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化 插入或缺失而引起可以遗传的基因结构的变化
突变（Gene Mutation)
单核苷酸多态（SNP）
n<0.1% n<0.1% n生殖细胞或体细胞
n150% n生殖细胞
SNP分子标记的原理及应用解读
SNP分子标记的原理及应用解读SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是指个体间在DNA序列中存在的单个碱基差异。
SNP是最常见的遗传变异形式，它在基因组中广泛存在，可以用来研究个体之间的遗传差异。
SNP分子标记技术通过检测SNP位点上的碱基差异，可以用来研究生物个体的遗传相关性、种群结构、物种起源、适应性以及疾病的遗传风险等。
SNP分子标记的原理是基于PCR（聚合酶链反应）技术，在PCR反应中引入荧光标记的引物来扩增感兴趣的SNP位点。
SNP位点上的碱基差异会导致引物与模板DNA序列的匹配性不同，从而影响PCR反应的效率和产物的数量。
这种差异可以通过凝胶电泳或者高通量测序等方法来检测。
1.遗传研究：SNP是人类基因组中最常见的遗传变异形式，可以用来研究个体之间的遗传差异。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以确定个体之间的亲缘关系、种群的遗传结构以及物种的起源演化等。
2.遗传性疾病的研究：SNP位点与许多遗传性疾病之间存在关联。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以确定个体对一些疾病的易感性风险，进而进行早期预防和干预。
3.个体化药物治疗：个体的基因差异可以影响药物的代谢和疗效。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以预测个体对一些药物的反应，进而实现个体化的药物治疗。
4.农业育种：SNP分子标记可用于农作物和家畜等的品种鉴定、个体选择和育种进展的监测等。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以选择具有优良特性的个体进行育种，提高农作物和家畜的产量和品质。
除了以上几个应用领域，SNP分子标记还可以应用于环境研究、种群遗传分析、疾病的诊断和预后、区域起源和扩散等方面。
由于其高度可重复性、高通量性和成本效益等特点，SNP分子标记已成为现代生命科学研究的重要工具之一、随着高通量测序技术的不断发展，SNP分子标记技术还将进一步发展和应用。
SNP分子标记的研究及应用
SN P 是 非 常 有 用 的 分 子 标 记 但 在 制 作 SN P 图~ SNP 分 型~ SNP 结 果 分 析 等 方 面 还 存 在 一 些 问 题: 首 先 制 作 SN P 图 理 论 上 需 要 约 500 个 有 代 表 性的个体 以开发一套密度至少在 100 000 左右的 SN P[12] 即使在多重 PCR 和 SN P 芯片发展方面取 得了很大进展 仍需要大量单个扩增反应对每个 SNP 进 行 靶 扩 增 但 成 本 太 高 一 般 实 验 室 难 以 开 展 该 工 作 统 计 学 上 的 准 确 性 需 要 增 加 SNP 的 密 度 但大批量扩增和检测反应所产生的错误信号也 随之增加 其次 难以确定用哪个 SN P 解决错误的 遗传问题 并对数据进行有效的分析 目前 对导致 复杂性状的多因素遗传基础还缺乏了解 经典的孟 德尔概念(两个等位基因 正常对异常) 常常被用于 分析复杂的问题 实际上 只有当导致复杂疾病的基 因仅有一个野生型和一个易感等位基因 并且等位 基因杂合度较低时 才能用统计学方法去分析遗传 标记与疾病表型的关系 连锁分析在确定复杂性状 的基因方面几乎未取得成功 遗传统计方法和工具 也有待于开发和完善 此外 SNP 还存在专利问题 因此 如果 SNP 的开发得不到足够的重视和经费支 持 那么大量的 SNP 和 cSN P 就可以被大 量 的 私人 研究机构开发与占有 这对 SNP 的研究与应用是很 不利的
SNP 在 单 个 基 因 或 整 个 基 因 组 的 分 布 是 不 均 匀 的[3]0 SN P 在 非 转 录 序 列 要 多 于 转 录 序 列 而 且 在转录区非同义突变(有氨基酸序列的改变) 的频 率 比其他方式突变的频率低得多0Halushka[3]等通 过对 75 个基因进行检测后 推测人类基因组有近百 万个 SNP 位点 其中大约有 50 万个在非编码区 估
SNP检测原理和应用
SNP的应用
1. 确定基因多态性和疾病的关系 2. 解释个体间的表型差异对疾病的易感程度 3. 对未来疾病做出诊断 4. 研究不同基因型个体对药物反应的差异，指导药物开 发及临床合理用药 5. 个体间SNP千差万别，通过SNP检测等技术进行法医 鉴定及个体识别
基因组制“物理图”、“序列图”和“转录图” 将SNPs 与人类基因组序列、物理和遗传图谱结合起来以 期在序列变异、疾病关联基因、种族遗传和基因组扫描等 方面作出进一步研究。 1998年，SNPs图谱，2227 个SNPs 定位和作图。 2001年，124万个SNPs的图谱。 目前超过500万个SNP位点，图谱未知。
疾病易感性研究中的应用
原理：SNPs被认为是一种稳定遗传的早期突变，与疾病 有着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超 过非患者时，即表明该标记与疾病关联，通过比较分析两 者的单倍型和研究连锁不平衡性，可将基因组中任何未知 的致病基因定位。
Horikawa 等，应用SNPs作为遗传标记通过基于连锁不 平衡的相关分析，在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现 了一个糖尿病易感基因———钙离子中性蛋白酶基因 (CAPN10基因)，该基因第三个内含子上的A/G多态性 (SNP43) 同2型糖尿病(2型DM) 连锁,该位点为纯合子G 的个体患2型DM 的风险增加，这是目前为止所发现的第 一个与2型DM相关的SNP，预示了SNP在DM相关基因研 究中的重要作用。
连锁不平衡性分析
原理：首先确定一批按一定间隔存在、覆盖整个基因组的 SNP标记，然后在特定群体中寻找这些SNP 标记与待研 究特征之间的关系，即确定与特征相关的SNP基因型，从 而确定导致生物出现特定性状的基因组区域。
Martin 等，为阿尔茨海默症(Alzheimer disease，AD) 的候选基因ApoE附近的SNP制图，在ApoE周围1.5Mb 的区域内为60个SNP分型，并通过家系连锁分析，在 ApoE基因两侧各40kb的区域内13个SNP中发现有7个连 锁，已有有力证据表明这7个SNP以及ApoE基因周围 16kb内另外两个SNP与AD连锁。
SNP分子标记在玉米非生物逆境抗性上的研究进展
SNP分子标记在玉米非生物逆境抗性上的研究进展【摘要】本文综述了SNP分子标记在玉米非生物逆境抗性研究中的最新进展。
首先介绍了SNP分子标记的原理，然后详细阐述了其在玉米抗逆性研究中的应用和与非生物逆境抗性的关联。
接着探讨了SNP分子标记在玉米育种中的前景以及在提高玉米产量和质量方面的作用。
结论部分指出SNP分子标记为提高玉米抗逆性提供了新途径，并在玉米育种和产量质量提升中具有重要意义和关键作用。
该研究为进一步深入理解玉米的抗逆机制和优化育种策略提供了重要参考。
【关键词】关键词：SNP分子标记、玉米、非生物逆境、抗性、研究进展、育种、产量、质量。
1. 引言1.1 研究背景玉米（Zea mays L.）是世界上最重要的粮食作物之一，也是许多国家的主要农业经济作物之一。
玉米在生长过程中遭遇到各种非生物逆境压力，如干旱、高温、盐碱等，这些逆境会严重影响玉米的生长发育和产量。
为了提高玉米的抗逆性，人们一直在寻找新的育种方法和技术。
近年来，随着分子生物学和遗传学的发展，SNP（Single NucleotidePolymorphism）分子标记技术逐渐成为研究玉米抗逆性的重要工具。
SNP分子标记具有高度多态性、高效快速和可靠性强等优点，在玉米抗逆性研究中具有巨大的潜力。
通过对SNP分子标记在玉米非生物逆境抗性中的应用以及与玉米抗逆性的关联进行深入研究，可以为玉米育种提供新的途径和方法，进一步提高玉米的产量和质量。
研究SNP分子标记在玉米抗逆性中的作用具有极其重要的意义和价值。
1.2 研究目的玉米作为世界上最重要的粮食作物之一，在面临各种非生物逆境胁迫时往往表现出不同程度的抗性。
通过对玉米种质资源的遗传多样性进行鉴定和利用，可以为玉米的育种工作提供重要参考。
本研究旨在利用SNP分子标记技术，研究玉米种质资源中的基因型差异和遗传多样性，探讨其在玉米非生物逆境抗性中的作用机制，以及为提高玉米产量和质量提供新的遗传资源和方法。
SNP技术及发展和应用
基本步骤
1. 测序引物和 DNA 模板杂交（ PCR 扩增的、单链的），与
酶和底物孵育。 2.四种dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反 应体系，如与模板配对，与引物的末端形成共价键， dNTP的焦磷酸基团（PPi）释放出来。 3.一系列的酶学反应，发出可见光信号。每个光信号的 峰高与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 4. ATP和未掺入的dNTP由三磷酸腺苷双磷酸酶降解，淬 灭光信号，并再生反应体系。 5.然后加入下一种dNTP。
SNP在畜牧中的应用
分析病毒、细菌基因的多态性，有助于人们了 解病毒、细菌的感染发病机制与耐药性机制。 对于耐药基因的检测可从两个方面实现：一是 通过基因表达诺芯片检测药物诱导基因表达的 改变来分析其耐药性；二是寡核苷酸芯片检测 基因组序列的SNP位点来分析耐药性。目前已 经生产出乙肝耐药、结核杆菌耐药以及艾滋病 耐药的SNP检测基因芯片，用于指导临床对病 人实施个体化治疗。
SNP的概念
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP),主要是指在基因组水平 上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态 性。它是人类可遗传的变异中最常见的一种。 占所有已知多态性的90%以上。SNP在人类基 因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对 中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更 多。
SNP在牛QTL定位上的应用
出生体重、断奶前日增重和饲养期日增重是对肉牛生 产有重要影响的生长性状，这些基因QTL定位将提高 育种进程，在育种过程中应给予考虑。U等(2002a，b) 将出生重、断奶前日增重及饲养期日增重的QTL已经 精确定位于牛5号染色体上。Li等(2004)研究表明， my／5基因的SNP与生长性状之间显著相关。W．Ge 等(2000)根据牛生长激素受体基因cDNA序列和人类的 生长激素受体基因序列设计特异性引物，利用PCR— RFLP技术，检测到了牛生长激素受体基因上的4个 SNP，它们分别为T—C(位于76bp)、G—A(位于 22bp)、T—C(位于229bp)和A—G(位于257bp)。
SNP分子标记的原理及应用
SNP分子标记的原理及应用SNP（单核苷酸多态性）是一种常见的遗传变异形式，其是指在基因组中，单个核苷酸发生变异所引起的差异。
SNP分子标记是通过检测SNP位点的变异情况来确定个体之间的遗传差异。
SNP分子标记具有高度的稳定性和高通量检测的优势，因此被广泛应用于遗传学、基因组学、生物学研究以及医学诊断等领域。
首先，SNP位点的检测是指对目标DNA样本中的SNP位点进行筛查和确定。
目前常用的SNP检测方法有PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）、TaqMan探针法、等位基因特异性扩增等。
其中，PCR-RFLP是最为常用的方法之一、该方法通过PCR扩增目标DNA片段，然后利用特异性内切酶切割PCR产物，根据不同SNP位点的限制酶切模式进行分析，从而确定SNP位点的变异型。
而TaqMan探针法是一种高度特异性的SNP鉴定方法，通过引入特异性的TaqMan探针来区分不同SNP位点的变异型。
等位基因特异性扩增方法则是通过引入特异性引物和探针，根据SNP位点上的变异基因特异性扩增PCR产物，以确定SNP位点的变异情况。
SNP分子标记的应用非常广泛。
在人类遗传学和基因组学研究中，SNP分子标记被广泛应用于基因关联研究、人类种群遗传结构分析、基因组遗传图谱构建等。
在农业和动植物遗传改良领域，SNP分子标记被用于作物和家畜的选育和品种鉴定。
此外，SNP分子标记也被应用于药物代谢研究、疾病预测和诊断、亲子鉴定等医学领域。
总之，SNP分子标记具有高度的稳定性和可靠性，能够有效地开展高通量、精确和快速的遗传研究与分析，成为现代遗传学研究和应用的重要工具。
SNP分子标记的原理及应用解析
1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度 不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电 泳技术。
2. 等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
管经强激光激发，核酸分子解吸附为单电荷离子，电场中
离子飞行时间与离子质量成反比，通过检测核酸分子在真 空管中的飞行时间而获得样品分析物的精确分子量，从而 检测出SNP位点信息。☺
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及 荧光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机 器本身出错的概率非常低； （2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质 都能被检测出来； （3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左 右），此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应，即通常所说 的4重反应； （7）兼容性强：质谱仪还能在核酸的其它方向，以及蛋白质组学、 微生物鉴定等领域也能应用。 （8）质谱技术是“一管式操作”，即反应体系在生化学实验过程 中始终在一个试管内反应，没有多次转移，这样就减少被污染的概 率。
SNaPshot PCR产物纯化
乙醇沉淀法: 11 个步骤, > 1 小时
Add reagents
Seal plate & incubate
Centrifuge
Empty plate
Add reagents
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
检测出来。
等位基因特异核苷酸片段分析( ASO) ，基因芯片和动态等 位基因特异性杂交( DASH) 等。
SNP 的应用
种族遗传学 T a n g 等研究了来自世界五个地区(中国、马来、高加 索、印度和非洲) 人群的MDR1 基因的单倍体和连锁不
平衡特征,发现具有e12/ 1236T2e21/ 2677T2e26/ 3435T
亚型的单倍型m h 5 在非洲人群以外的四种人群中高度
表达,而具有e12/ 1236C2e21/ 2677G2e26/ 3435C 亚型的
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知 基因突变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突 变类型和具体位置。
1.3 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温度 不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开的电 泳技术。
2. 等位基因特异 PCR ( AS-PCR)
AB——New Master Mix
定量分析 高灵敏
TaqMan® Gene Expression MasteTaqMan® Genotyping Master Mix
4. 等位基因特异性杂交
等位基因特异性杂(Allele specific hybridization ,ASH) 根据核苷酸探针和互补的目的片段进行杂交，完全匹配和 有错配两种情况下杂交复合体稳定性的不同而将 SNP 位点
单倍型mh7 在非洲人群中占了1/ 3 以上,进一步证明了 种族间的表形差异。
疾病易感性研究 原理：SNPs 被认为是一种稳定遗传的早期突变,与疾病有 着稳定的相关性。当一个遗传标记的频率在患者明显超过 非患者时 ,即表明该标记与疾病关联 ,通过比较分析两者的 单倍型和研究连锁不平衡性 , 可将基因组中任何未知的致 病基因定位。 Horikawa 等应用 SNPs作为遗传标记通过基于连锁不平衡 的相关分析 , 在墨西哥裔美国人群和北欧人群中发现了一 个 DM 易感基因 , 该基因第三个内含子上的 A/ G 多态性 (SNP43) 同2 型糖尿病(2 型DM) 连锁,该位点为纯合子G的 个体患2 型DM 的风险增加,这是目前为止所发现的第一个 与2 型DM 相关的SNP ,预示了SNP 在DM 相关基因研究中 的重要作用。
3. RT-PCR
实时荧光PCR 技术( RT-PCR )一种通过检测 PCR 过程中和 PCR 之后产生的荧光信号来区分等位基因类型的SNP 检测技 术, 同时基于荧光能量转移原理( FRET) 。每检测一个SNP 位 点需要一条探针, 其3‘ 端连有淬灭剂基团, 5’ 端连有荧光剂基 团, 最终与SNP 位点完全匹配时探针结构被破坏, 从而发出荧 光而被检测。
原理：根据 SNP位点设计特异引物,其中一条链(特异链)的3′末端与 SNP位点 的碱基互补(或相同) ,另一条链(普通链)按常规方法进行设计,因此,AS-PCR 技术是一种基于SNP的PCR标记。因为特异引物在一种基因型中有扩增产 物,在另一种基因型中没有扩增产物,用凝胶电泳就能够很容易地分辨出扩 增产物的有无,从而确定基因型的 SNP。
等位基因特异PCR（AS-PCR）; RT-PCR; 等位基因特异性杂交; 引物延伸法--单碱基延伸法; DNA直接测序法; 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法；
1.1 RFLP法
原理：利用限制性内切酶的酶切位点的特异性，用两种或 两种以上的限制性内切酶作用于同一 DNA 片断，如果存 在 SNP 位点，酶切片断的长度和数量则会出现差异，根 据电泳的结果就可以判断是否SNP位点。
SNP分子标记的原理 及应用
、
SNP 的概念
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，指 由于单个核苷酸碱基的改变而导致的核酸序列的多态性。在 不同个体的同一条染色体或同一位点的核苷酸序列中，绝大 多数核苷酸序列一致而只有一个碱基不同的现象，即SNP。 它包括单碱基的转换, 颠换、 插入及缺失等形式。
1.2 单链构象多态性(SSCP)
原理：单链DNA 在中性条件下会形成二级结构，不同 的二级结构在电泳中会出现不同的迁移率。这种二 级结构依赖于碱基的组成，单个碱基的改变也会影 响其构象，最终会导致在凝胶上迁移速度的改变。 在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这 样在凝胶上的迁移速率不同，出现不同的条带，检 测SNP。
SNP 的特点
（1）密度高 S N P在人类基因组的平均密度估计为 1\1000 bp , 在整个基因组的分布达 3×106个。 （2）富有代表性 某些位于基因内部的S N P 有可能 直接影响蛋白质结构或表达水平, 因此, 它们可能代 表疾病遗传机理中的某些作用因素。 （3）遗传稳定性 与微卫星等重复序列多态性标记相 比, SNP 具有更高的遗传稳定性。 （4）易实现分析的自动化 SNP标记在人群中只有两 种等位型(allele) 。这样在检测时只需一个“ + \- ”或 “全\无”的方式,这使得基于S N P的检测分析方法易实 现自动化。
遗传育种的应用 检测水稻SNP，研究优良性状与SNPs的关联关系，指 导育种。
SNP的检测方法
基于以下9 种基本原理: 1. 以结构为基础;
1.1 限制性片段长度多态性法 （RFLP ）; 1.2 单链构象多态性法 （SSCP ）; 1.3 变性梯度凝胶电泳 （DGGE ）;
2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
药物基因组学研究
SNPs 可以精细地反映个体的遗传差异,SNPs 位点与个 体的药物反应进行相关分析,从而确定基因在药物作用 中的功能和意义。这样既可以根据患者的遗传特性设 计治疗方案,实现“个性化治疗”,提高药效，降低药物 的毒副作用,又可以在临床试验阶段为特定的药物选择 合适的受试者,提高效率,减少费用。