血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)教学文案
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法 实验报告
蛋白质含量测定——双缩脲试剂法实验报告一、实验目的1、掌握双缩脲试剂法测定蛋白质含量的原理和方法。
2、学会使用分光光度计进行比色测定。
3、熟悉标准曲线的绘制和应用，能够通过标准曲线计算样品中蛋白质的含量。
二、实验原理双缩脲试剂是由硫酸铜和酒石酸钾钠在碱性条件下生成的淡蓝色的络合物。
当含有两个或两个以上肽键的化合物与双缩脲试剂反应时，会形成紫色的络合物。
蛋白质分子中含有多个肽键，因此在碱性条件下能与双缩脲试剂反应产生紫色复合物。
颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，在一定范围内符合朗伯比尔定律，可通过比色法测定其吸光度，进而计算出蛋白质的含量。
三、实验材料与仪器1、材料（1）标准蛋白质溶液：称取结晶牛血清白蛋白（BSA） 10mg，用蒸馏水溶解并定容至 100ml，配制成100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
（2）待测蛋白质溶液：＿____（3）双缩脲试剂：称取硫酸铜（CuSO4·5H2O） 15g 和酒石酸钾钠60g，分别用蒸馏水溶解，然后混合，加入 300ml 10%氢氧化钠溶液，并用蒸馏水定容至 1000ml，摇匀，避光保存。
2、仪器（1）分光光度计（2）离心机（3）移液器（4）容量瓶（100ml、50ml）（5）试管及试管架四、实验步骤1、标准曲线的绘制（1）取 6 支干净的试管，按下表加入试剂：｜管号｜ 1 ｜ 2 ｜ 3 ｜ 4 ｜ 5 ｜ 6 ｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜标准蛋白质溶液（ml）｜ 0 ｜ 02 ｜ 04 ｜ 06 ｜ 08 ｜ 10 ｜｜蒸馏水（ml）｜ 10 ｜ 08 ｜ 06 ｜ 04 ｜ 02 ｜ 0 ｜｜蛋白质含量（μg）｜ 0 ｜ 20 ｜ 40 ｜ 60 ｜ 80 ｜ 100 ｜（2）向各管中加入 4ml 双缩脲试剂，摇匀，在室温（20-25℃）下放置 30 分钟。
（3）以第 1 管为空白对照，在 540nm 波长处用分光光度计测定各管的吸光度（A）值。
（4）以蛋白质含量（μg）为横坐标，吸光度（A）值为纵坐标，绘制标准曲线。
第二部分 血清总蛋白含量测定
第二部分血清总蛋白含量测定（双缩脲法）技能训练指导
一、实训目的
1. 加强对蛋白质分子结构及性质的认识。
2. 掌握双缩脲法常规测定血清总蛋白含量的原理和方法。
二、实训内容
血清总蛋白含量的测定
三、实训仪器与材料
1．待测血清新鲜血（自制羊血清或人血清）
2．标准血清市售专用的标准血清（70g/L）
3．双缩脲试剂市售专用的双缩脲试剂
4．蒸馏水
5．刻度吸管（0.1ml3支、5ml1支）
6．洗耳球1个、试管3支、试管架、722分光光度计
四、实训操作
1．取3支试管编号，按下表操作：
2．各管混匀，置37C0水浴箱保温15分钟。
3．使用722型分光光度计，选取波长540nm，以空白管调零，分别读取各管的A值。
4. 计算公式：
测定管浓度（g/L）=测定管A值/标准管A值Ⅹ70（标准管浓度）
（参考值：60~80 g/L）
六、实训清场
1．血清集中处理。
所有玻璃器皿按要求清洗干净，摆放整齐。
2．操作台面整洁，有破损器材，主动报告实验室老师并做好登记。
临床生化检验：3-血清总蛋白测(双缩脲法)
优点
准确性好、精密度高、 灵敏度高。 特异性高、准确度好、 精密度高、操作简单方 便，显色稳定。
灵敏度高、达双缩脲法 的100倍。
快速简便、无损样品
灵敏、简便、快速，干 扰因素较少
简便、不需特殊仪器
缺点
适用范围
操作复杂，费时
用于标准蛋白质 的定值、对其他 方法校正等
灵敏度低
试剂与器材
双缩脲试剂盒 成分：硫酸酮、酒石酸钾钠、NaOH 、碘化钾
总蛋白质标准液（44.1g/L） 蒸馏水 混合血清 可见分光光度计 水浴锅
操作步骤
取3支试管，做好标记，按下表操作：
加入物（ml） 血清 蛋白标准液 蒸馏水 双缩脲试剂
B
S
U
-
-
0.06
-
0.06 -
0.06
-
-
3.0
血清总蛋白测定 (双缩脲法）
医学检验系临床生化检验教研室
实验目的
掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理 熟悉血清总蛋白的临床意义；
总蛋白测定经典和常见的方法比较
方法
凯氏定氮法
双缩脲法
Lowry法 （Folin酚法 ）
紫外 分光光度法 考马斯亮蓝法 （Bradford）
化学比浊法
灵敏度
0.2~ 1.0mg氮 1～20mg 20～250ug
干扰物质多、操作 要求严格计时
为临床测定血清 总蛋白首选方法 。
适用于测定单一 蛋白质及测定蛋 白质含量较少的 标本如脑脊液
灵敏度低、干扰物 较多
常用于较纯的酶 和免疫球蛋白测 定
不同蛋白质与染料 常用于需求更高 结合力不一致，对 呈色灵敏度的蛋 比色杯有吸附作用 白电泳
血清总蛋白测定标准操作规程
血清总蛋白测定标准操作规程1.实验原理：（双缩脲法）本试剂采用双缩脲反应，即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与两价铜离子反应生成蓝紫色络合物，其中每个铜离子与五至六个肽键络合。
双缩脲反应被广泛应用于临床检验，具有简便、快速可靠的特点。
在试剂中加入碘化物有助于防止碱性铜络合物的自动还原，反应形成的蓝紫色物质与样本中总蛋白浓度成正比，通过测定520-560nm 处吸光度值的变化，即可计算出样本中总蛋白的浓度。
+2u C +蛋白质−−→−-OH Cu 蛋白质复合物 2.试剂主要组成成分3.样本要求：新鲜无溶血血清，勿使用肝素抗凝血浆。
22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法：仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程）5.参考范围：6.检验结果的解释6.1线性范围：在给定的样本/试剂比例和条件下测定时，本试剂线性范围可达100g/L 。
样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V ）的氯化钠溶液稀释样本。
最大稀释5倍。
6.2单位换算：g/dL=g/L ×0.17检验结果的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在540nm 处吸光度大于0.200时不能使用。
8.产品性能指标8.1试剂外观：蓝色透明液体，无悬浮物及沉淀物。
8.2装量：不低于标识值8.3空白吸光度：在540nm处，光径1cm时，空白吸光度A≤0.200。
8.4分析灵敏度：在540nm处，光径1cm时，测量70g/L的总蛋白，吸光度差△A≥0.1508.5线性区间：试剂的线性区间为[30.0-100.0]g/L，在此线性区间内：a）线性相关系数r应不小于0.995；b）线性相对偏差不超过±6.0%。
8.6精密度8.6.1重复性：重复测试（70.0±10.0）g/L的样本，所得结果的变异系数（CV）应≤2.0%8.6.2批间差：重复测试（70.0±10.0）g/L的样本，所得结果批间相对极差（R）应≤5.0%8.7准确性：相对偏差应不大于±5.0%。
血清总蛋白测定(双缩脲(精)
实验目的
⒈掌握双缩脲法测定总蛋白的原理及注 意事项。
⒉熟练测定操作步骤。 ⒊了解TP测定的主要临床意义。
实验原理
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜 离子作用生成紫红色的络合物，产生的颜 色强度在一定范围内与蛋白质的含量成正 比，与同样处理的蛋白标准液比较，经计
潴留。 ②摄入量不足和消耗增加：营养不良、慢性肠胃炎、严
重结核病等。 ③合成障碍：肝脏疾病。 ④蛋白质丢失：严重烧伤时大量血浆渗出，肾综合症等。
算或查标准曲线即可求出血清蛋白质含量。
蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与铜 离子作用生成紫红色的络合物与两分子尿 素缩合后生成的双缩脲在碱性溶液中与铜
离子作用形成的紫色物质的反应相似，故 称之为双缩脲反应。
双缩脲结构: NH2试剂:
H2N—OC—NH—CO—
试剂
双缩脲试剂：称取硫酸铜 (CuSO4·5H2O)3.0g,溶于500mL新鲜制 备的蒸馏水或刚煮沸冷却的去离子水中， 加酒石酸钾纳(NaKC4H4O6·4H2O)9.0g， 碘化钾5.0g，待完全溶解后，加入 6mol/L Na2OH 100ml,最后加蒸馏水 至10白质标准液：市售。
实验操作
加 入 物(mL) 待测血清 蛋白标准液 蒸馏水 双缩脲试剂
U(测) 0.1 -
4.0
S(标) 0.1
4.0
B(空) 0.1 4.0
混匀,置37℃水浴6分钟，以”B”管校”0”, λ=546nm比色,读取A 值计算。
实验结果及报告
3、双缩脲试剂中酒石酸钾钠的作用是络合铜离子，以维 持铜离子在碱性溶液中的溶解性；碘化钾能防止两价铜 离子还原．
4、高脂，黄疸及溶血标本应作清空白对照来校正误差。 含脂类极多的血清，加入双缩脲试剂后会出现混浊，可 用乙醚3ml抽提后再进行比色．
双缩脲法测定血清总蛋白实验报告
双缩脲法测定血清总蛋白实验报告实验报告：双缩脲法测定血清总蛋白摘要：本实验采用双缩脲法测定血清总蛋白浓度。
通过对比实验组和对照组样本的比色反应，得出了血清总蛋白的浓度。
实验结果表明，该方法简便、可靠、准确，适用于血清总蛋白的浓度测定。
实验目的：1.掌握双缩脲法测定血清总蛋白浓度的基本原理和方法。
2.了解比色法在实验中的应用及操作技巧。
3.验证双缩脲法测定血清总蛋白浓度的可靠性和准确性。
实验方法：1.取不同浓度的血清标准品6个，分别标注不同浓度和编号。
2.取待测样品6个，标注不同编号。
3.将标准品和待测样品加入10ml离心管中，每个管中各加入1ml蒸馏水。
4.在离心管中分别加入1ml蛋白试剂A和B，摇匀，并放置15分钟。
5.加入1ml无水乙醇摇匀。
6.在1ml离心管中加入1ml0.1mol/L NaOH溶液，使溶液转为蓝色。
7.在250nm处比色计测定吸光度（对照组样本的吸光度为0）。
8.计算出样品的血清总蛋白浓度。
实验结果：对照组样本吸光度为0，实验组6个样本的吸光度如下表：编号吸光度S1 0.163S2 0.344S3 0.516S4 0.688S5 0.860S6 1.032标准品的吸光度如下表：编号吸光度浓度G1 0.163 0.7g/LG2 0.344 1.4g/LG3 0.516 2.0g/LG4 0.688 2.8g/LG5 0.860 3.4g/LG6 1.032 4.1g/L通过双缩脲法测定，我们计算出每个实验组样本的血清总蛋白浓度。
编号浓度（g/L）S1 0.7S2 1.4S3 2.0S4 2.8S5 3.4S6 4.1实验结论：1.通过双缩脲法测定血清总蛋白，准确地测定了实验组样本的血清总蛋白浓度。
2.双缩脲法测定血清总蛋白浓度的方法简便、可靠、准确，适用于血清总蛋白浓度测定。
基础生化实验 第三个实验 双缩脲
双缩脲法测定蛋白质含量（考核实验）一、教学目的与要求：①加强对蛋白质的有关性质的认识；②掌握双缩脲法测定蛋白质含量的原理和方法；③对学生所学进行综合的测试。
二、教学实验原理：蛋白质含有两个以上的肽键，因此有双缩脲反应。
在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量氨基酸成分无关，因此利用此进行比色测定蛋白质含量。
在一定条件下，未知样品的溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540—560nm下比色，可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知的蛋白质浓度，标准蛋白溶液可以用结晶的牛（或人）血清白蛋白、卵清蛋白或酪蛋白粉末配制。
除-CONH-有此反应外，-CONH2-，-CH2-，NH2-，-CS-CS-NH2，等基团亦有此反应。
三、考核主要内容1、标准曲线的制作取6支干净的试管，按0→5编号，然后按下表依次加入试剂，充分混匀，在室温下放置半小时，以管为空白，在550nm波长处测定消光值（OD），以各管蛋白质含量（毫克）横坐标，OD值为坐标，画出标线。
2、样品测定：取样品液1.0 ml，同法进行，测其OD值，对照标准曲线求得未知液蛋白质浓度。
3、分光光度计的使用：规定每组在10min以内全部完成操作（共测6支管）；同时注意操作是否规范。
4、成绩的计算：此次的实验占30%（包括平时的表现及实验报告的完成情况和完成质量），平时的五次实验共占70%，每次实验按总分为5分为满分进行打分，总评折合成百分制。
四、实验注意事项：①标准样品的浓度为：10μg/ml；②实验过程中不得过问他人，同组人可以配合进行；③实验报告在课堂上独立完成，同组人数据相同，不得抄袭他人数据，一旦发现以零分处理；④实验过程若出现失误应向老师汇报后再进行重做；⑤对实验结果进行简单的分析.一、实验目的：1.掌握分光光度计的使用方法。
2.掌握标准管法测物质含量的方法。
3.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。
血清总蛋白测定(双缩脲试剂法)精编版
实验材料
样品：大牛血清
试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）
器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球
设备：1100分光光度计、水浴锅
实验步骤
取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：
加入物（ml）
B (空白）
S （标准）
U（待测）
二、实验原理
（一）：双缩脲反应
在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管
依据公式算出结果
四、结果与讨论：
（一）：实验结果
1、实验现象：
a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；
b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。
（二）：结果讨论
查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是44.586g/L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：
1、成功的方面：
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血清总蛋白测定(双缩
脲试剂法)
生物化学实验报告
姓名：
学号：
专业年级：
组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称血清总蛋白测定（双缩脲试剂法）
实验日期2014-11-21 实验地点第五实验室
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1、掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作；
2、熟悉血清总蛋白的临床意义；
3、了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
二、实验原理
（一）：双缩脲反应
在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这个反应叫做双缩脲反应。
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2），因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发生双缩脲反应，生成紫红色络合物；蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围内有良好的线性关系。
三、材料与方法：
实验材料
样品：大牛血清
试剂：双缩脲试剂、蛋白质标准液（70g/L）、生理盐水（0.9%）
器材：试管、加样枪、刻度吸管、洗耳球
设备：1100分光光度计、水浴锅
实验步骤
取3支试管，做好标记(B空白对照，S标准液，U为待测大牛血清)，按下表操作：加入物（ml） B (空白）S （标准）U（待测）
大牛血清（1：10）- - 0.5
- 0.5 -
蛋白标准液（1：
10）
0.9%氯化钠溶液0.5 - -
双缩脲试剂 4.0 4.0 4.0
a.各管混匀，观察各试管颜色
b.将各试管置于37℃水浴锅中加热20min，观察颜色
c.将试管中的液体倒入比色杯中，置于1100分光光度计的样品槽内，在波长540nm，以空白管调零，测S和U管吸的光度。
d.测定结束后，将比色杯中的样品回收进试管
依据公式算出结果
四、结果与讨论：
（一）：实验结果
1、实验现象：
a、在实验中首先加入双缩脲试剂，再依次加入0.9%氯化钠溶液、蛋白质标准液、相应的大牛血清后溶液没有明显的颜色变化，呈淡蓝色透明状；
b、水浴20分钟之后，B试管试管显淡蓝色；S试管和U试管显浅紫色且S试管的颜色比U试管的颜色稍深。
2、实验数据：
管号测定次数平均吸光度 1 2 3
S 0.187 0.188 0.187 0.1873
U 0.120 0.119 0.119 0.1193 3、结果计算：
将大牛血清和蛋白标准液的平均吸光度带入公式：血清总蛋白（g/L)=(Au/As)X蛋白质标准液浓度（g/L),得出结果：血清总蛋白=44.586g/L
（二）：结果讨论
查阅资料得知，大牛血清总蛋白含量一般为60-80g/L,可是，实验结果却是
44.586g/L,即使按照实验要求及步骤操作,结果还是出现了比较大的误差，实验结果经过讨论，分析如下：
1、成功的方面：
a.在本次试验出现了预期的结果：S和U试管溶液显淡紫色，B试管显淡蓝色。
S和U 试管显淡紫色是因为蛋白质发生了双缩脲反应，但是由于蛋白质的含量偏少显色较浅，B试管显浅蓝色的原因是B试管中没有发生任何反应，显双缩脲试剂的淡蓝色。
b.水浴，吸光度测试等环节都能够按照预定的步骤进行，操作比较严谨。
2、误差分析：
a.所测得的蛋白质含量偏低，可能是由于样品存储不当，造成待测的大牛蛋白水解，待测样品中的蛋白质总量本身就很低
b.待测的大牛蛋白溶液正常，但是，标准蛋白溶液的浓度比标示的高，造成测量结果偏低
c.操作过程有偏差，由于量取蛋白质溶液的量比较少，在每个加样步骤的少量偏差，都会造成结果误差较大
五：结论
样品的蛋白质含量偏低
复习思考题
1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠和碘化钾？
双缩脲试剂
2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后加入？
3.简述血清总蛋白测定的临床意义。