双缩脲法总蛋白测定..
总蛋白实验测定实验报告
一、实验目的1. 掌握双缩脲试剂法测定血清总蛋白的原理和方法；2. 熟悉实验操作步骤，提高实验技能；3. 了解血清总蛋白的临床意义及检测方法。
二、实验原理血清总蛋白（Total Protein，TP）是指血液中所有蛋白质的总和，包括白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原等。
双缩脲试剂法是一种常用的蛋白质定量分析方法，其原理是蛋白质分子中的肽键在碱性溶液中能与铜离子发生双缩脲反应，生成紫红色络合物。
该络合物在540nm处的吸光度与蛋白质含量在一定范围内呈线性关系，通过测定吸光度可计算出蛋白质含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：（1）血清样本：采集患者空腹静脉血，分离血清；（2）双缩脲试剂：硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾；（3）NaOH溶液：6.0mol/L；（4）蛋白质标准液：60～70g/L；（5）试管、移液器、分光光度计等。
2. 仪器：（1）分光光度计；（2）恒温水浴锅；（3）移液器；（4）试管架。
四、实验步骤1. 标准曲线的绘制：（1）取6支试管，分别加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL蛋白质标准液；（2）向各试管中加入6.0mol/L NaOH溶液1.5mL；（3）向各试管中加入双缩脲试剂A液1.0mL；（4）混匀，室温放置10分钟；（5）向各试管中加入双缩脲试剂B液4.0mL；（6）混匀，室温放置10分钟；（7）以空白管调零，在540nm波长下测定吸光度；（8）以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 血清总蛋白的测定：（1）取血清样本0.5mL，按照步骤1的操作进行测定；（2）以标准曲线为依据，计算血清总蛋白含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：根据实验数据绘制标准曲线，计算线性回归方程。
2. 血清总蛋白测定：根据标准曲线，计算血清总蛋白含量。
3. 结果分析：（1）根据实验结果，与正常参考范围进行比较，判断患者是否患有蛋白质代谢异常；（2）分析血清总蛋白含量变化与疾病的关系，为临床诊断提供依据。
总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)
总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)简介：总蛋白(Total Protein ，TP)由白蛋白和球蛋白组成。
对于生物体液(血清、尿液、脑脊液)中总蛋白质含量的测定，一般要基于如下两个假设：1、所有蛋白质分子由纯多肽组成，含氮量的质量百分比为16%；2、体液中含有数百个蛋白质分子，每个分子对测定反应都具有非常相似的特性。
目前常用的方法有：双缩脲法、紫外分光光度法、染料结合法、凯氏定氮法、沉淀法等。
Leagene 总蛋白检测试剂盒(双缩脲比色法)多用于人或动物血清、血浆、组织等样本中的总蛋白含量测定。
双缩脲反应的原理是在呈蓝色的碱性硫酸铜溶液存在的情况下，铜离子与肽键形成有色螯合的铜复合物，呈紫色，所产生的颜色密度与参与反应肽键数成比例。
可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长。
双缩脲法测定蛋白浓度兼容性亦很好，不受大部分样本中其他成分的影响，但易受铜离子螯合剂影响。
本试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
组成：自备材料：1、 离心管或小试管2、 水浴锅或恒温箱3、 比色杯4、 分光光度计操作步骤(仅供参考)：1、 取蛋白标准配制液或稀释液加入到蛋白标准中，充分溶解后配制成的蛋白标准溶液，配制后可立即使用，溶解后的蛋白标准溶液应-20℃保存。
亦可按自己试验要求继续进行稀释，如稀释至1mg/ml 。
特别提示：待测蛋白溶解于什么样的稀释液中，蛋白标准也宜溶解于什么样的稀释液中。
例如待测蛋白溶解于蔗糖中，亦取蛋白标准溶解于蔗糖中。
一般也可以用NaCl 或PBS 作为溶解总蛋白标准品的稀释液。
编号 名称TC0547 120T Storage试剂(A): 双缩脲试剂 250ml 4℃ 试剂(B): 蛋白标准 20mg RT 试剂(C): 蛋白标准配制液 5ml RT 试剂(D): 双缩脲空白试剂(备选) 100ml4℃ 使用说明书1份2、样本处理：血清、血浆样本直接取检测。
对于组织样本，按组织质量(g)：生理盐水比例，加入生理盐水或PBS，冰浴下匀浆后，离心，取上清待检。
血清总蛋白测定标准操作规程
血清总蛋白测定标准操作规程1.实验原理：（双缩脲法）本试剂采用双缩脲反应，即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与两价铜离子反应生成蓝紫色络合物，其中每个铜离子与五至六个肽键络合。
双缩脲反应被广泛应用于临床检验，具有简便、快速可靠的特点。
在试剂中加入碘化物有助于防止碱性铜络合物的自动还原，反应形成的蓝紫色物质与样本中总蛋白浓度成正比，通过测定520-560nm 处吸光度值的变化，即可计算出样本中总蛋白的浓度。
+2u C +蛋白质−−→−-OH Cu 蛋白质复合物 2.试剂主要组成成分3.样本要求：新鲜无溶血血清，勿使用肝素抗凝血浆。
22～25℃保存8小时，2～8℃保48小时，-20℃保存7天，样本不可反复冻融！4.检验方法：仪器法（详见DF-603/DI-600标准操作规程）5.参考范围：6.检验结果的解释6.1线性范围：在给定的样本/试剂比例和条件下测定时，本试剂线性范围可达100g/L 。
样本含量超出线性范围时，建议用0.9%（W/V ）的氯化钠溶液稀释样本。
最大稀释5倍。
6.2单位换算：g/dL=g/L ×0.17检验结果的局限性7.1结果的准确性依赖于仪器的校正和测定温度、时间的控制。
7.2若试剂浑浊或以水空白在540nm 处吸光度大于0.200时不能使用。
8.产品性能指标8.1试剂外观：蓝色透明液体，无悬浮物及沉淀物。
8.2装量：不低于标识值8.3空白吸光度：在540nm处，光径1cm时，空白吸光度A≤0.200。
8.4分析灵敏度：在540nm处，光径1cm时，测量70g/L的总蛋白，吸光度差△A≥0.1508.5线性区间：试剂的线性区间为[30.0-100.0]g/L，在此线性区间内：a）线性相关系数r应不小于0.995；b）线性相对偏差不超过±6.0%。
8.6精密度8.6.1重复性：重复测试（70.0±10.0）g/L的样本，所得结果的变异系数（CV）应≤2.0%8.6.2批间差：重复测试（70.0±10.0）g/L的样本，所得结果批间相对极差（R）应≤5.0%8.7准确性：相对偏差应不大于±5.0%。
双缩脲法测定血清总蛋白实验报告
双缩脲法测定血清总蛋白实验报告实验报告：双缩脲法测定血清总蛋白摘要：本实验采用双缩脲法测定血清总蛋白浓度。
通过对比实验组和对照组样本的比色反应，得出了血清总蛋白的浓度。
实验结果表明，该方法简便、可靠、准确，适用于血清总蛋白的浓度测定。
实验目的：1.掌握双缩脲法测定血清总蛋白浓度的基本原理和方法。
2.了解比色法在实验中的应用及操作技巧。
3.验证双缩脲法测定血清总蛋白浓度的可靠性和准确性。
实验方法：1.取不同浓度的血清标准品6个，分别标注不同浓度和编号。
2.取待测样品6个，标注不同编号。
3.将标准品和待测样品加入10ml离心管中，每个管中各加入1ml蒸馏水。
4.在离心管中分别加入1ml蛋白试剂A和B，摇匀，并放置15分钟。
5.加入1ml无水乙醇摇匀。
6.在1ml离心管中加入1ml0.1mol/L NaOH溶液，使溶液转为蓝色。
7.在250nm处比色计测定吸光度（对照组样本的吸光度为0）。
8.计算出样品的血清总蛋白浓度。
实验结果：对照组样本吸光度为0，实验组6个样本的吸光度如下表：编号吸光度S1 0.163S2 0.344S3 0.516S4 0.688S5 0.860S6 1.032标准品的吸光度如下表：编号吸光度浓度G1 0.163 0.7g/LG2 0.344 1.4g/LG3 0.516 2.0g/LG4 0.688 2.8g/LG5 0.860 3.4g/LG6 1.032 4.1g/L通过双缩脲法测定，我们计算出每个实验组样本的血清总蛋白浓度。
编号浓度（g/L）S1 0.7S2 1.4S3 2.0S4 2.8S5 3.4S6 4.1实验结论：1.通过双缩脲法测定血清总蛋白，准确地测定了实验组样本的血清总蛋白浓度。
2.双缩脲法测定血清总蛋白浓度的方法简便、可靠、准确，适用于血清总蛋白浓度测定。
总蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握双缩脲试剂法测定血清总蛋白的原理和操作步骤。
2. 了解血清总蛋白测定的临床意义和注意事项。
3. 培养实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理双缩脲试剂法是一种经典的蛋白质定量方法，其原理基于蛋白质分子中肽键与铜离子在碱性条件下形成紫红色络合物的特性。
在一定浓度范围内，蛋白质含量与紫红色络合物的吸光度成正比。
通过测定吸光度，可以计算出样品中的蛋白质含量。
三、实验材料1. 实验试剂：6.0mol/L NaOH溶液、双缩脲试剂（硫酸铜、酒石酸钾钠、碘化钾）、蛋白质标准液、待测血清样品。
2. 仪器：分光光度计、移液器、试管、烧杯、试管架等。
四、实验步骤1. 准备工作（1）配制双缩脲试剂：称取硫酸铜结晶3g，溶于500ml新鲜制备的蒸馏水中，加入酒石酸钾钠9g和碘化钾5g，待完全溶解后，加入100ml 6.0mol/L NaOH溶液，最后用蒸馏水定容至1L。
（2）配制蛋白质标准液：用定值参考血清或标准白蛋白配制蛋白质标准液，浓度为60～70g/L。
（3）将待测血清样品进行适当稀释。
2. 实验操作（1）取试管若干，编号，分别加入0.5ml蛋白质标准液、0.5ml待测血清样品（或稀释后的血清样品）和0.5ml蒸馏水作为空白对照。
（2）向每个试管中加入1.0ml双缩脲试剂，混匀。
（3）将试管置于水浴中加热5分钟，取出冷却至室温。
（4）用分光光度计在540nm波长处测定各管吸光度。
3. 数据处理（1）绘制标准曲线：以蛋白质标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
（2）根据待测血清样品的吸光度，从标准曲线上查得对应的蛋白质浓度。
五、实验结果与分析1. 标准曲线绘制：以蛋白质标准液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 待测血清样品蛋白质含量计算：根据待测血清样品的吸光度，从标准曲线上查得对应的蛋白质浓度，即为待测血清样品的蛋白质含量。
六、讨论、心得1. 双缩脲试剂法测定血清总蛋白是一种快速、简便、准确的方法，广泛应用于临床检验和生物化学研究。
测定总蛋白的方法
测定总蛋白的方法测定总蛋白的方法主要包括以下几种：1.双缩脲法：这是一种常用的蛋白质定量方法。
蛋白质中的肽键(-CONH-)在碱性条件下与Cu2+络合成紫红色复合物，产生的颜色强度在肯定范围内与蛋白质含量成正比。
双缩脲试剂与蛋白质中的肽键反应，形成紫色复合物，通过比色法或分光光度法测定其吸光度，进而推算出总蛋白的含量。
2.溴甲酚绿法：溴甲酚绿是一种酸性染料，它与蛋白质结合后颜色会发生变化。
通过测量溶液中颜色的变化，可以间接测定总蛋白的浓度。
3.凯氏定氮法：这是一种经典的蛋白质定量方法。
通过将样品中的蛋白质消解，使其中的氮转化为氨气，然后用酸吸收氨气并进行定量分析，从而计算出总蛋白的含量。
将血清与强酸一起加热消化，使血清中的含氮化合物转化为铵盐，再加碱使铵盐成为氨进经蒸馏分别出来，最终用酸滴定测定氮量，按每克氨相当于6.25g蛋白质计算蛋白质的浓度。
4.电泳法：电泳技术可以根据蛋白质的电荷和分子量差异将其分离，并通过染色或免疫印迹等方法进行定量或定性分析。
5.免疫分析法：利用特异性抗体与蛋白质的结合反应，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、免疫比浊法等，来检测总蛋白的含量。
6.质谱法：质谱技术可以精确测定蛋白质的质量和含量，常用于蛋白质组学研究和复杂样品中的总蛋白分析。
7.酚试剂法：蛋白质分子中的酪氨酸残基和色氨酸残基能够和酚试剂中的磷钨酸-磷钼酸反应生成蓝色化合物。
8.紫外分光光度法：蛋白质分子内的色氨酸、酪氨酸等芳香族氨基酸可使蛋白质溶液在280nm波特长有一汲取峰，依此性质可用于蛋白质定量。
9.染料结合法：在酸性环境中，蛋白质分子解离出的-NH3+，可与染料的阴离子产生颜色反应。
常用的染料有氨基黑、考马斯亮蓝等。
10.比浊法：用某些酸类(如二氯醋酸、磺基水杨酸等)和血清蛋白质结合产生沉淀，然后测定其浊度。
这些方法各有优缺点，如凯氏定氮法结果精确，但操作复杂；双缩脲法简便、精确、重复性好，但灵敏度稍差；紫外分光光度法敏感且简便，但受尿酸和胆红素干扰；染料结合法操作简便、重复性好、灵敏度高，但特异性不高；比浊法操作简便，但准确性较差。
实验十七双缩脲法测定血浆总蛋白质含量
实验十七双缩脲法测定血浆总蛋白质含量蛋白质生命的基础，任何生命离不开蛋白质，本实验为了提高同学们的自主动手能力，培养同学们有序化的操作能力，以便各同学在今后的工作中有更出色的表现，不仅能够丰富各同学的知识，而且也能够增强各同学的自信心。
1、实训应用：检测蛋白质的含量，例如:检测食品中蛋白质含量是否达到标准，检测血清中的蛋白质是否出现异常等等。
2、实训原理凡含有两个以上肽键的化合物在碱溶液中能与硫酸铜作用生成紫色或紫红色复合物，这一反应称为双缩脲反应。
蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连接起来的，因而可与双缩脲试剂发生颜色反应，且颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。
3．试剂的配制3.1 双缩脲试剂：称取硫酸铜1.5g加水100ml，加热助溶。
另取酒石酸钾钠6.0g，碘化钾5g，溶于500ml水中。
两液混匀后，在搅拌下加10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释至1000ml，储存在塑料瓶中。
此液可以长期保存。
若储存瓶中有黑色沉淀析出，需重新配置。
3.2 1%蛋白质标准溶液。
3.3 分光光度计。
4、主要器材本次实训分为六大组，每大组再分成四个小组，以下为本次实训要器材及数量：试管（150支） 500ml烧杯（6个）小烧杯（45个） 1000ml容量瓶（6个） 10ml量筒（46个）胶头滴管（46个）玻璃棒（6个）塑料瓶（6个）分光光度计（180个）移液管或10ml量筒（46个）5．实验安排本班生物实验分为六大组，本次实验每大组再分成四个小组，要求自主配试剂（人员自行安排，该洗的还是要洗一下）。
在配好本实验所需的试剂后，每组再分成两人一组完成本次实验.注意事项5.1分光光度计的盖要轻拿轻放，拿器皿时，手必须拿在粗糙面;器皿外有水时用吸水纸吸干，用擦纸一次擦干（不能来回擦拭）。
5.2使用时检查光测是否是透视比5.3使用前必须先打开盖子调0，盖上是出现100，连续两次出现0与100时，方可使用6．实训操作：6.1标准曲线的绘制：取小试管6支，按下表：表5-1 实训的具体操作1 2 3 4 5 6 1%蛋白质标准液（ml）0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 —0.9%NaCl(ml) 0.9 0.7 0.5 0.3 0.1 1.0 双缩脲试剂（ml） 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质浓度（ml）10 30 50 70 90 0按上表混合后，于370C水浴中放置15分钟，在520nm波长下比色;以第6管调节零点，测得各管的吸光度值。
血清总蛋白测定(双缩脲
血清总蛋白测定（双缩脲）1. 简介血清总蛋白是指血液中所有蛋白质的总和，包括白蛋白和球蛋白等。
血清总蛋白测定是一项常见的检验方法，用于评估患者的蛋白质代谢情况，以及某些疾病的诊断和监测。
双缩脲法是一种常用的血清总蛋白测定方法，本文将介绍该方法的原理、操作流程和结果解读。
2. 原理双缩脲法利用缩脲与蛋白质中的酚类物质反应生成有颜色的复合物，通过测量复合物的吸光度来定量测定血清中的总蛋白含量。
该方法具有简单、灵敏、快速等特点，被广泛应用于临床实验室及科研领域。
3. 操作流程3.1 样本处理从被检测者的静脉血中采集适量的血清样本，并放置在离心管中，离心10分钟将血清分离出来。
将分离得到的血清样本转移到干净的试管中。
3.2 加入试剂取适量的双缩脲试剂，按照其说明书的要求加入到试管中，与血清样本进行充分混合。
注意避免空气泡的形成。
3.3 酶解反应将试管放置于恒温水浴中，根据试剂的要求进行酶解反应。
一般情况下，反应时间为30分钟。
3.4 测定吸光度将反应体放入分光光度计中，设置波长为试剂说明书要求的波长，记录吸光度值。
3.5 统计结果根据标准曲线，计算出血清样本中总蛋白的含量。
4. 结果解读根据血清总蛋白测定的结果，可以得出以下结论： - 如果测定的结果高于正常范围，可能说明患者在蛋白质代谢方面存在异常，如蛋白质合成过多或凋亡减少。
- 如果测定的结果低于正常范围，可能说明患者在蛋白质合成方面存在问题，如肝功能受损或营养不足等。
需要注意的是，血清总蛋白测定的结果受到多种因素影响，如年龄、性别、饮食习惯等，因此在结果解读时需要综合考虑患者的临床情况。
5. 总结血清总蛋白测定是一种常用的检验方法，通过双缩脲法可以快速、准确地测定血清中的总蛋白含量。
该方法操作简单，结果解读可为临床医生提供重要的参考依据。
但需要注意的是，结果的解读需要综合考虑患者的临床情况，以及其他相关检验指标的结果，才能做出正确的诊断。
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计算
AU 血清总蛋白（g/L ） 蛋白质标准液浓度（g/L ） AS
生物化学与分子生物学实验教学中心
参考范围
正常成人60～80g/L 长久卧床者约低3～5g/L 60岁以上约低2g/L 新生儿总蛋白浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1年后 达成人水平。
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原理-2
蛋白质分子含有大量彼此相连的肽键（-CO-NH-），同样能 在碱性条件下与Cu2+发生双缩脲反应，生成的紫红色络合物 ，且在540nm处的吸光度与蛋白质的含量在10～120g/L范围 内有良好的线性关系。
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实验材料
样品：小牛血清 试剂：6.0mol/LNaOH溶液源自1～20mg灵敏度低
Lowry法 （Folin酚法） 紫 外 分光光度法 考马斯亮蓝法 （Bradford）
20～250ug
干扰物质多、操作 要求严格计时 灵敏度低、干扰物 较多 不同蛋白质与染料 结合力不一致，对 比色杯有吸附作用
50～100mg
快速简便、无损样品 灵敏、简便、快速，干 扰因素较少
小牛血清（1：10）
蛋白标准液（1：10） 0.9%NaCl 双缩脲试剂
0.5 4.0
0.5 4.0
0.5
4.0
各管混匀，置37℃20min，在波长540nm处比色， 以空白管调零，测各管吸光度。
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血清总蛋白测定数据处理表
测定次数 管号
1 S U 2 3
平均吸光度
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临床意义
血清总蛋白浓度降低
蛋白质合成障碍 蛋白质丢失增加 营养不良或消耗增加 血浆稀释
血清总蛋白浓度增高
蛋白质合成增加：多发性骨髓瘤 血浆浓缩：脱水、休克
生物化学与分子生物学实验教学中心
思考题
1.什么叫双缩脲试剂？为什么要在双缩脲试剂中 加入酒石酸钾钠和碘化钾？ 2.试剂配制过程中，为何NaOH要单独配制，最后 加入？ 3.简述血清总蛋白测定的临床意义。
1～5ug
化学比浊法
简便、不需特殊仪器
影响浊度大小因素 一般用于测定尿液 多，如加试剂手法 、脑脊液等蛋白质 、反应温度等 含量较低的样品 生物化学与分子生物学实验教学中心
原理-1
两分子尿素加热脱氨缩合成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2） ，因分子内含有两个邻接的肽键，在碱性溶液中可与Cu2+发 生双缩脲反应 ，生成紫红色络合物。
血清总蛋白测定 （双缩脲试剂法）
南方医科大学 生物化学与分子生物学实验教学中心
2013年秋季学期
实验目的
掌握双缩脲测定血清总蛋白的基本原理、操作； 掌握双缩脲试剂的配制； 熟悉血清总蛋白的临床意义； 了解双缩脲法测定血清总蛋白的特点和注意事项。
生物化学与分子生物学实验教学中心
总蛋白测定经典和常见的方法比较
方 法 灵敏度 优 点 缺 点 适用范围
凯氏定氮法 双缩脲法
0.2～1.0mg 氮
准确性好、精密度高、 灵敏度高。 特异性高、准确度性好 、精密度高、操作简单 方便，显色稳定。 灵敏度高、达双缩脲法 的100倍。
操作复杂，费时
用于标准蛋白质的 定值、对其他方法 校正等。 为临床测定血清总 蛋白首选方法。 适用于测定单一蛋 白质及测定蛋白质 含量较少的标本如 脑脊液 常用于较纯的酶和 免疫球蛋白测定 常用于需求更高呈 色灵敏度的蛋白电 泳
双缩脲试剂:硫酸酮、酒石酸钾钠、碘化钾 双缩脲空白试剂 蛋白质标准液（70g/L） 蒸馏水
器材：试管、烧杯、容量瓶、加样枪、刻度吸管、玻璃棒 设备：1100分光光度计、电子天平、水浴锅
生物化学与分子生物学实验教学中心
操作步骤
取3支试管，做好标记，按下表操作：
加入物（ml） B (空白） S 标准） U（待测）
生物化学与分子生物学实验教学中心
2013年秋季学期