热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α 突触核蛋白毒性的作用
热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α突触核蛋白毒性的作用
热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中α-突触核蛋白毒性的作用【摘要】目的探讨HSP70在因α-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病(PD)细胞模型中的作用及其机制。
方法构建过表达野生型和PD相关突变型(A53T)α-突触核蛋白质粒，转染人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染表达HSP70的质粒。
采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中α-突触核蛋白表达量的改变;采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型活力的变化。
结果转染HSP70后，细胞模型α-突触核蛋白表达减少，细胞活性增加。
结论HSP70通过降低α-突触核蛋白表达水平对PD细胞模型发挥保护作用。
【关键词】α-突触核蛋白;热休克蛋白70;过表达α-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白,具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。
近年研究发现，α-突触核蛋白基因过表达或突变可引起α-突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。
研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70)就是其中之一。
HSP70是分子伴侣家族中的一员,作为一种重要的应激蛋白,能与错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成;除此之外，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1，2〕。
在果蝇及酵母的PD模型中发现，HSP70能减轻α-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3，4〕,而HSP70抑制α-突触核蛋白毒性可能与其能够与α-突触核蛋白相互作用，阻止α-突触核蛋白纤维样聚集，降低α-突触核蛋白表达量有关〔5，6〕。
为进一步证实HSP70在α-突触核蛋白所致PD 的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过降低α-突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。
帕金森病相关基因异常诱导自噬障碍
帕金森病相关基因异常诱导自噬障碍李佳昱;于兰;陈敏【摘要】帕金森病(Parkinson's disease,PD)是一种常见的多因素和基因异质性神经退行性疾病.自噬是进化上高度保守的细胞代谢途径,具有细胞保护作用.最近的研究表明自噬与PD密切相关,α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)、PINK1和Parkin 等PD相关基因编码的蛋白都可以参与自噬的调控,被认为与PD的发病机制相关.本文阐述了几种重要PD相关基因在自噬途径中的作用,为PD发生发展并最终靶向PD治疗的研究提供新线索.【期刊名称】《广东医学》【年(卷),期】2019(040)010【总页数】5页(P1351-1355)【关键词】帕金森病;自噬;α-突触核蛋白;PINK1;Parkin【作者】李佳昱;于兰;陈敏【作者单位】桂林医学院基础医学院广西桂林541001;桂林医学院人体解剖学教研室广西桂林541001;桂林医学院附属医院科研科广西桂林541001【正文语种】中文【中图分类】R742.5;Q753帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种年龄相关的慢性神经退行性疾病[1]，具有以动作迟缓、静止性震颤等运动症状为主的临床表现。
过去PD被认为是一种完全特发性疾病，但近20年的研究表明遗传学对该疾病也有重大贡献，所有PD病例中估计有15%是家族性的[2]。
尽管PD的发病机制复杂，但目前公认的氧化还原失衡、线粒体功能损伤、受损蛋白质稳态异常，甚至是家族性PD的相关致病基因突变，都被证实涉及自噬相关途径障碍[3-4]。
类似地，越来越多的证据表明，自噬对神经元存活至关重要，其失调导致神经变性[5]。
1 自噬途径与PD1.1 自噬溶酶体途径(autophagy-lysosome pathway，ALP)的分子机制泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)和ALP是机体正常生理状况下修复或消除异常蛋白质的两种最主要的途径[6]。
α-突触核蛋白在帕金森病中的作用
α-突触核蛋白在帕金森病中的作用翟骁;段国礼;沈下贤;陈晓【摘要】帕金森病(PD)患者的路易小体中存在大量α-突触核蛋白寡聚体.目前认为,寡聚体的形成和增多与氧化应激损伤及氧化修饰息息相关.氧化修饰包括硝化修饰和多巴胺氧化加合.α-突触核蛋白作为分子标志物,可能成为临床治疗帕金森病的新途径.%Alpha-synuclein oligomers are the main composition of the Lewy body in patients with Parkinson's disease , they may be associated with oxidative stress damage and oxidative modification. The oxidative modifications include nitrative modification and dopamine oxidative adduction. Serving as a biomarker, a-synuclein may become a new target for clinical treatment.【期刊名称】《基础医学与临床》【年(卷),期】2012(032)012【总页数】3页(P1481-1483)【关键词】α-突触核蛋白;氧化应激;氧化修饰;帕金森病【作者】翟骁;段国礼;沈下贤;陈晓【作者单位】第二军医大学研究生管理大队,上海200433;第二军医大学研究生管理大队,上海200433;第二军医大学研究生管理大队,上海200433;第二军医大学研究生管理大队,上海200433【正文语种】中文【中图分类】R742.5Abstract:Alpha-synuclein oligomers are the main composition of the Lewy body in patients with Parkinson's disease，they may be associated with oxidative stress damage and oxidative modification．The oxidative modifications include nitrative modification and dopamine oxidative adduction．Serving as a biomarker，α-synuclein may become a new target for clinical treatment．Key words:α-synuclein;oxidative stress;oxidative modification;Parkinson's disease帕金森病(Parkinson's disease，PD)是常见神经退行性疾病。
热休克蛋白70与临床相关性疾病的研究进展
虫国塞旦医型；Q!!生!旦筮!!鲞箍j塑堡塾i望笪!』!旦塑型照!望!垡!!!丛!堂堕些丛翌：!Q!!：y!!：!!：堕!：i热休克蛋白70与临床相关性疾病的研究进展陶伍元张文武热休克蛋白是1962年发现的一种机体在各种应激因素刺激下产生的一种特殊蛋白，保护细胞免受有害刺激造成的损伤，具有多种生物学功能，在热休克蛋白家族中研究较多的是热休克蛋白70(H eat s hock pr ot e i nTO，H S P70)。
近年来研究发现H SP70与呼吸、血液、神经、自身免疫系统等疾病密切相关，具有重要的基础研究和临床应用前景。
结合相关文献对H SP70与临床相关性疾病的研究进展做如下综述。
1热休克蛋白(H SP)概述自1962年H SP被首次发现以来，目前不同类型的H SP已被证实。
H SP是一组分子量为8～110K D a的蛋白家族，按其分子量大小可分为H SP27、H SP32、H SP47、H SP60、H SP70、H S P90、H SP110。
H SP70是细胞含量最丰富的一类H SP家族，它分为组成性(cons t i t uen t)的热休克蛋白70(H SC73)和诱导性(i nduced)热休克蛋白70(H SP72)。
H SP是生物体在各种应激因素，如炎症、创伤、手术、休克、缺血再灌注等的作用下产生的一组特殊蛋白质，它能保护细胞免受各种有害刺激所造成的损伤，促进受损细胞的自身修复，且具有多种生物学功能，帮助蛋白质折叠、装配、跨膜转运、稳定和再折叠细胞受损蛋白，具有抗炎症、抗氧化及抗凋亡作用…。
2热休克蛋白70与临床相关性疾病2．1呼吸系统疾病：急性肺损伤(acut e l un g i nj ur y，A LI)是机体在感染、创伤、休克、缺血～再灌注等致病因素刺激下激活机体单核巨噬细胞系统，导致炎症介质：核因子一kB(nucl ear fa c—t or—K B，N F—K B)、肿瘤坏死因子(t um or necr os i s f act o r—al pha，TN F一0【)、白细胞介素一6(i nt er l euki n一6，I L一6)、细胞问粘附分子(i nt er ce l l ul ar ad hes i o n m ol ecul e，I C A M)等的释放，在炎症细胞的共同参与下，呈级联放大的瀑布样炎性反应，造成肺血管内皮细胞、肺上皮细胞受损及肺泡毛细血管膜通透性增加，引起肺间质和肺泡水肿，最终可导致通气／血流比例严重失调引起低氧血症，严重者可导致急性呼吸窘迫综合征和多器官功能衰竭。
α-突触核蛋白与帕金森病
α－突触核蛋白与帕金森病<a rel='nofollow' onclick="doyoo.util.openChat();return false;"href="#">【摘要】α-突触核蛋白是一种中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，与帕金森病的发病有密切的关系。
α-突触核蛋白在各种生理，环境因素的影响下异常表达和聚集，通过一系列的氧化应激等生化反应，产生了对神经元的毒性作用，从而参与了帕金森病的发生。
对α-突触核蛋白的化学性质，聚集的机制及其影响因素的了解与研究，将会十分有利于帕金森病的预防和治疗。
【关键词】α-突触核蛋白；帕金森病；路易小体Alpha - synapse nucleoalbumin and Parkinson sicknessZHANGYanchaoZHANGNanDIAO Jianping【Abstract】Alpha - the synapse nucleoalbumin is thesoluble protein which one kind of central nervous system synapse, expresses, gets sick the morbidity with Parkinson to have the close relationship. Alpha - the synapse nucleoalbumin in each physiology, under environmental factor's influence exceptionally expresses and gathers, through biochemistry and so on a series of oxidized stress responded, has produced to neuron's toxic effect, thus participated in the occurrence which Parkinson gets sick. To Alpha - the synapse nucleoalbumin's chemical property, the accumulation mechanism and influencing factor's understanding and the research, will be very advantageous the prevention which and the treatment will get sick in Parkinson.【Key words】Alpha - synapse nucleoalbumin; Parkinson sickness; Louis minute帕金森病是一种中老年人常见的运动障碍疾病，以黑质多巴胺能神经元变性缺失和路易小体形成为病理特征，临床上表现为静止性震颤，运动迟缓，肌强直和姿势步态异常等。
癫痫患儿血清α-突触核蛋白和热休克蛋白70的表达及临床意义
组,而癫痫1组、癫痫2组的 C-WISC 评分低于癫痫3组,差异有统计学意义(P<0.05)。Pearson线 性 相 关 分
析显示,血清α-Syn、HSP70水平与 C-WISC 评分呈 负 相 关,而 与 P300 潜 伏 期 及 血 清IL-1β、IL-6、CRP、TNF-α
水平呈正相关(P<0.05)。结论 与健康儿童相比,癫痫患儿血清α-Syn、HSP70水平明显增高,二者水平变化
摘 要:目的 探讨癫痫患儿血清α-突触核蛋白(α-Syn)、热休克蛋白70(HSP70)的变化,分析二者与认知
功能、事件相关电位、血清炎症细胞因子的关系。方法 选取该院 2016 年 8 月至 2019 年 8 月收治的癫痫患儿
105例作为癫痫组,根据癫痫类型进一步分为癫痫1组(癫痫频发)、癫 痫 2 组(癫 痫 持 续 状 态)、癫 痫 3 组(非 频
热休克蛋白70对细胞凋亡调控的研究进展分析
热休克蛋白70对细胞凋亡调控的研究进展分析马广鹏【摘要】细胞凋亡是与机体组织自我稳定机制有关的主动的程序性死亡,是细胞在一定生理和病理条件下遵循自身程序的生理性死亡.热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是广泛存在于原核和真核细胞中的一组结构上高度保守的多肽,HSP 70家族因具有分子伴侣、细胞保护、抗细胞凋亡、抗氧化以及参与免疫应答等多种重要生理功能而成为研究热点.【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2011(033)010【总页数】4页(P827-830)【作者】马广鹏【作者单位】科技部中国农村技术开发中心,北京100045【正文语种】中文【中图分类】S852.61细胞凋亡是与机体组织自我稳定机制有关的主动的程序性死亡，是细胞在一定生理和病理条件下遵循自身程序的生理性死亡。
热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是广泛存在于原核和真核细胞中的一组结构上高度保守的多肽，HSP 70家族因具有分子伴侣、细胞保护、抗细胞凋亡、抗氧化以及参与免疫应答等多种重要生理功能而成为研究热点。
HSP是一组在结构上高度保守的多肽，广泛存在于自然界原核、真核细胞中。
根据HSP的相对分子质量，主要的HSP被分成6个家族：大分子量HSP家族、HSP90家族、HSP70家族、HSP60家族、小分子量HSP家族和泛素[1]。
其中HSP70家族是最保守、最重要的一族，在大多数生物中含量最多，由于在应激反应中的敏感性，以及在临床实践中的各种作用而成为研究的热点[2]。
HSP70家族成员众多，它们在进化上高度保守，种属间同源性高，并且在正常细胞内和应激状态下均有表达。
当进入应激状态时，机体通过对HSP70 mRNA的优先翻译和增强其稳定性等调控机制来以适应变化的需要。
HSP70家族具有多种重要的功能，业已证明其在充当分子伴侣、细胞保护、抗细胞凋亡、抗氧化以及在免疫应答中都发挥着重要作用[3-7]。
帕金森病或因免疫系统“犯糊涂”
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帕金森病或因免疫系统“犯糊涂”
作者：
来源：《恋爱婚姻家庭·养生版》2017年第09期
帕金森病患者脑部一种名为α-突触核蛋白的蛋白质会异常积聚，导致附近分泌多巴胺的神经元死亡。
医学界曾认为，α-突触核蛋白会“毒死”神经元，破坏神经系统的信号传导，导致帕金森病。
但事实上，这种蛋白质也许并不直接杀死神经元，而是诱导患者自身的免疫系统把神经元当成异物去攻击。
美国哥伦比亚大学等机构的研究人员分别提取帕金森病患者和健康人的血样，与神经元分泌的一些蛋白质碎片混合，然后对比两者的免疫反应。
结果发现，健康人的血液对这些蛋白质碎片反应很小，而帕金森病患者血液里的T细胞则对α-突触核蛋白的碎片產生了强烈的免疫
反应。
这表明，患者的免疫系统对α-突触核蛋白有“记忆”，也就是说曾经接触并攻击过这种蛋白质及其附近的神经元。
研究人员计划在接下来的实验中阻断上述免疫反应，观察这一做法能否遏制病情发展。
热休克蛋白70抗肿瘤免疫的研究
热休克蛋白70抗肿瘤免疫的研究王顺利;杨耀琴【期刊名称】《同济大学学报（医学版）》【年(卷),期】2006(027)0z1【摘要】热休克蛋白（heat shock proteins，Hsps）也称为应激蛋白（stress proteions）是一类高度保守的广泛存在于原核和真核生物中的蛋白质，它参与多种胞内蛋白的折叠、装配及转运。
近年研究发现，Hsps在诱导抗肿瘤免疫中发挥着独特的作用。
从肿瘤组织中获得的Hsps事实上以非共价键方式与不同的肿瘤抗原肽（肿瘤排斥抗原）结合，形成多种Hsps一多肽复合物，具有肿瘤特异的免疫原性，Hsps中以Hsp70，gp96作用最强。
Hsps携带的抗原肽指令庞大，可以结合所有肿瘤抗原成分，活化多个CTL克隆，无需免疫佐剂即可激发有效、持续的抗肿瘤免疫效应，这对克服肿瘤的异质性、对抗肿瘤逃逸和治疗转移癌有明显帮助，也为肿瘤免疫治疗开辟了一条新途径。
Hsp70是肿瘤免疫治疗研究中研究得最广泛的热休克蛋白之一。
本文就这方面的研究进展作一综述。
【总页数】4页(P18-21)【作者】王顺利;杨耀琴【作者单位】同济大学医学院肿瘤细胞研究室,上海,200092;同济大学医学院肿瘤细胞研究室,上海,200092【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.肺癌热休克蛋白70-多肽复合物的抗肿瘤免疫效应研究及其与热证的相关性 [J], 王洪琦;胡晨霞;胡玲;申维玺;赵健;祁岩超;韩霞;李建国;张正2.热休克蛋白70的抗肿瘤免疫效应研究 [J], 孟凡东;傅庆国;郭克建;郭仁宣3.热休克蛋白在肝细胞癌形成、增殖、复发、转移及抗肿瘤免疫中的作用研究 [J], 吴嘉仪;李高鹏;罗葆明4.热休克蛋白70抗肿瘤免疫的研究进展 [J], 黄丽5.热休克蛋白gp96抗肿瘤免疫的研究进展 [J], 岳培彬;杨树德;黄常志因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白细胞毒性及其机制研究
帕金森病患者血浆增强α-突触核蛋白细胞毒性及其机制研究李杰;谢秀娟;宋炜;潘维花;杨巍巍;于顺【摘要】目的研究帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者血浆对α-突触核蛋白(α-synuclein,α-Syn)细胞毒性的影响及其机制.方法将重组人α-Syn加入PD和对照血浆中,采用免疫印迹法及酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法鉴定α-Syn寡聚体和磷酸化形成情况.在原代神经培养基中加入终浓度为5μmol/L的α-Syn单体及寡聚体,同时添加30％(体积分数)PD血浆、正常人血浆和胎牛血浆,孵育14 d后,MTT及流式细胞技术观察细胞死亡情况.酶活力试剂盒检测各组原代神经元中蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)酶活力.结果 PD患者血浆较正常受试者(normal subject,NS)血浆可促使更多的α-Syn 磷酸化和寡聚化.与NS血浆相比,添加到原代神经元培养物中的PD血浆导致更多细胞在细胞外α-Syn存在下死亡,同时伴有PP2A活力降低.结论 PD患者血浆中可能通过降低PP2A酶活力使α-Syn发生磷酸化,导致其聚集并进一步使得原代培养神经元死亡.【期刊名称】《首都医科大学学报》【年(卷),期】2019(040)002【总页数】7页(P244-250)【关键词】α-突触核蛋白;血浆;帕金森病;原代神经元;磷酸化【作者】李杰;谢秀娟;宋炜;潘维花;杨巍巍;于顺【作者单位】北京市大兴区中西医结合医院神经内科,北京100076;北京市大兴区中西医结合医院神经内科,北京100076;北京市大兴区中西医结合医院神经内科,北京100076;北京市大兴区中西医结合医院神经内科,北京100076;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053;首都医科大学宣武医院神经生物学研究室,北京100053【正文语种】中文【中图分类】R742帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是继阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)之后的第二大神经系统常见退行性疾病。
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热休克蛋白70减轻帕金森病细胞模型中a突触核蛋白毒性的作用（作者： _________ 单位：___________ 邮编：___________ ）【摘要】目的探讨HSP70在因a-突触核蛋白过表达或突变所致的帕金森病（PD）细胞模型中的作用及其机制。
方法构建过表达野生型和PD相关突变型（A53T）a-突触核蛋白质粒，转染人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y）细胞后得PD细胞模型;然后在细胞模型中转染表达HSP70的质粒。
采用免疫印迹检测转染HSP70细胞模型中a- 突触核蛋白表达量的改变；采用MTT法检测转染HSP70后细胞模型活力的变化。
结果转染HSP70后，细胞模型a-突触核蛋白表达减少，细胞活性增加。
结论HSP70通过降低a-突触核蛋白表达水平对PD 细胞模型发挥保护作用。
【关键词】a-突触核蛋白；热休克蛋白70;过表达a-突触核蛋白是一种在中枢神经系统突触前表达的可溶性蛋白，具有调节膜稳定性和神经可塑性等生理功能。
近年研究发现，a -突触核蛋白基因过表达或突变可引起a -突触核蛋白的错误折叠、有毒蛋白寡聚体和多聚体的形成，使其结构和功能障碍，从而启动一系列级联反应致多巴胺能系统损伤，最终导致帕金森病(PD)。
研究认为神经保护剂可能是治疗PD的一个新的有效途径，而热休克蛋白70(HSP70) 就是其中之一。
HSP70是分子伴侣家族中的一员，作为一种重要的应激蛋白，能与错误折叠的蛋白相互作用，阻止聚集物的形成；除此之外，HSP70还有助于错误折叠蛋白的降解〔1, 2〕。
在果蝇及酵母的PD模型中发现，HSP70能减轻a-突触核蛋白的毒性及其引起的神经细胞凋亡〔3，4〕，而HSP70抑制a-突触核蛋白毒性可能与其能够与a-突触核蛋白相互作用，阻止a -突触核蛋白纤维样聚集，降低a -突触核蛋白表达量有关〔5, 6〕。
为进一步证实HSP70在a-突触核蛋白所致PD的作用，本实验首次在神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)PD模型中检测了HSP70的作用及机制，发现HSP70可以通过降低a -突触核蛋白水平发挥对PD细胞模型的保护作用。
1材料与方法1.1实验材料SH-SY5Y细胞购自ATCC公司;限制性内切酶购自Takara 公司;QIAprep TIP100 Kit 购自QIAGEN 公司;人胎脑cDNA 文库、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine2000 购自Invitrogen 公司;蛋白酶抑制剂cocktail 购自Sigma 公司;anti- a-synuclein 204 抗体、anti-beta-actin抗体购自Santa cruz公司;聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自Millipore 公司。
1.2方法1.2.1质粒构建以人胎脑cDNA文库为模板，PCR获得a-突触核蛋白可编码序列(CDS序列)以Not I和Hi nd皿连接到pCDNA3.1真核表达载体中，通过overlap PCR方法，构建A53T突变体，同样以Not I禾和Hi nd皿连接到pCDNA3.1 真核表达载体中。
按照QIAprep TIP100 Kit Protocol抽取并纯化质粒，测序证实。
pCDNA3.1-HSP70 质粒由湘雅二医院肝移植中心李杰群博士惠赠。
1.2.2细胞培养与转染SH-SY5Y细胞采用含10%FBS的高糖DMEM培养液，置于37 °C，5%CO2的培养箱培养。
转染严格按照Lipofectamine2000说明书进行。
用不含FBS的DMEM培养基洗涤细胞2次，24孔细胞培养板每孔加入含2山Lipofectamine2000及0.8⑷质粒DNA、不含FBS的DMEM培养基500 山在37 C，5%CO2的培养箱中孵育3 h，改用含10%FBS的DMEM 培养基继续孵育48 h。
1.2.3免疫荧光将稳定表达蛋白的SH-SY5Y细胞接种到有盖玻片的24孔板中，用含10% FBS的DMEM培养于37C、5% CO2 培养箱中36 h后，弃去培养基，3.7%的多聚甲醛/磷酸缓冲液(PBS) 室温下固定15 min。
PBS 洗2次，每次5 min。
0.2%的Trit on X-100/PBS 透化10 min，PBS 洗2 次，5% 牛血清白蛋白(BSA) 圭寸闭液，室温圭寸闭30 min。
加入1 400稀释的anti- a-synuclein204 一抗室温孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min。
5%BSA封闭液，室温封闭20 min。
加入1 ：00稀释的anti-鼠lgG-Cy2二抗100 “，避光室温下孵育60 min。
1 XPBS洗3次，每次5 min。
4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染细胞核，室温，避光反应 2 min。
PBS洗2次, 每次5 min。
去离子水洗1次，封片，用激光共聚焦显微镜扫描和照相。
124免疫印迹取细胞，吸去培养基，加入2X十二烷基硫酸钠(SDS)sample buffer(125 mmol/L Tris HCI , 20% Glycerol , 4% SDS , 0.1% bromphenol blue, pH 6.8)加入蛋白酶抑制剂cocktail裂解细胞，超声后，使用蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。
均取20⑷总蛋白经18% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并电转移至PVDF膜上。
以5%脱脂奶粉封闭1 h后，加入相应一抗，4 C过夜，Tris缓冲生理盐水溶液(TBST)洗膜后，加入对应的辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育60 min，TBST洗膜后，电化学发光免疫分析法(ECL)发光，曝光。
内参照为鼠抗-actin单克隆抗体。
1.2.5细胞活力测定调节SH-SY5Y细胞密度约5X104/ml，以100 "/孔接种于96孔板，24 h后分别转染pCDNA 3.1+HSP70;a-突触核蛋白野生型+ PCDNA3.1；a-突触核蛋白野生型+HSP70; a-突触核蛋白A53T+PCDNA3.1; a-突触核蛋白A53T+HSP70;每种处理设3个复孔，24 h后每孔加5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)，继续培养 4 h。
弃培养基，每孔加二甲基亚砜(DMSO)100 “振荡混匀，待颗粒溶解后置于酶标仪上，空白孔调零，以570 nm波长检测各孔吸光度值。
1.3统计学分析利用SPSS11.5软件进行统计分析，用t检验进行两组间差异比较。
2结果2.1PD细胞模型的构建a -突触核蛋白野生型和突变型A53T在转染SH-SY5Y细胞后，胞浆和胞核都有分布，以胞浆分布为主，部分细胞a-突触核蛋白呈点状分布，可能为其聚集体。
免疫印迹也显示，SH-SY5Y细胞中a-突触核蛋白野生型和突变型A53T都得到了过表达，说明PD细胞模型构建成功。
见图1A、B。
2.2HSP70对PD细胞模型中a -突触核蛋白的影响了探讨HSP70对PD细胞模型中过表达的a -突触核蛋白的作用，将HSP70 与a-突触核蛋白进行了共转染，通过免疫印迹检测HSP70对a-突触核蛋白表达的影响。
结果显示，无论是在a -突触核蛋白野生型还是突变型PD细胞模型中，HSP70均能降低a-突触核蛋白的表达。
见图2。
A:免疫荧光检测a -syunclein野生型（左图）与A53T突变体（右图）在SH-SY5Y中的表达。
一抗为anti a-syunclein 鼠单克隆抗体，二抗为cy2标记的anti mouse IgG 抗体。
蓝色为DAPI染色的细胞核。
B: western印迹检测a-syunclein在SH-SY5Y中的表达。
一抗为anti a -syunclein 鼠单克隆抗体，二抗为HRP标记的anti mouse IgG 抗体。
内参为细胞骨架蛋白beta act in。
图1 a-syu ncle in过表达PD模型的建立Western印迹检测a-syunclein与HSP70共转染后，HSP70对a-syunclein 野生型和突变性表达量的影响。
一抗为anti a-syunclein 鼠单克隆抗体，antiHSP70单克隆抗体，二抗为HRP标记的anti mouse IgG抗体。
内参为细胞骨架蛋白B -actin。
图2HSP70降低a -synuclein的表达量2.3HSP70对PD细胞模型活力的影响转染野生型和突变体a -突触核蛋白后，SH-SY5Y细胞活性明显降低，说明a -突触核蛋白对SH-SY5Y具有毒性作用，PD细胞模型建立成功。
而增加HSP70的表达后，对比a -突触核蛋白野生型(a synuclein WT)+ pCDNA3.1组和a-突触核蛋白突变型(a-synucleinA53T)+pCDNA3.1 组，表达HSP70能分别提高a-synuclein WT 和a-synuclein A53T 引起的细胞活性降低(P0.01)，见表1。
表1MTT检测HSP70对过表达a-syunclein SH-SY5Y细胞活性的影响3讨论a-突触核蛋白是一种分布于中枢神经系统突触前末梢，约15~20 kD的可溶性蛋白质。
自然状态下呈一种非折叠构象，不形成明显的三维结构，但其N末端2/3的序列可以形成一系列双极性区域，可能介导其与膜结构的结合；当高浓度或异常修饰时，构象改变形成寡聚体甚至是聚集体，具有细胞毒性〔7，8〕。
与单体不同，这类寡聚体富含8片层结构，在原子力显微镜及电镜下，可以观察到这类寡聚体形成过程中，一般先呈包含20〜30个a-突触核蛋白分子的圆状结构;随后因彼此聚合形成链状结构，最终转化为稳定的纤维状结构。
这种由单体向纤维状结构的改变，可能是a-突触核蛋白产生毒性作用的重要原因〔5，10〕。
研究进一步发现，与家族性PD有关的a-突触核蛋白A53T及A30P突变蛋白在体外均可以促进寡聚体的形成，同时，野生型a-突触核蛋白的过量表达也可以导致寡聚体的增加〔11，12〕。
当机体无法处理有毒的a -突触核蛋白中间体时，可能会导致a - 突触核蛋白形成聚集体，最终导致PD的发生〔11，13，14〕。
分子伴侣作为一类介导协助蛋白形成与维持天然构象的重要细胞因子，在a突触核蛋白蛋白结构状态转换过程中可能发挥着很重要的调控作用。
实验表明，路易小体中除a -突触核蛋白外，还含有其他蛋白质，而HSP是其中重要的蛋白之一〔15〕。
当a突触核蛋白本身结构的改变或分子伴侣、降解系统出现异常时，a -突触核蛋白的毒性作用就体现出来了。
在模型动物的研究中发现，分子伴侣(HSP70、HSP40)的表达可减轻a-突触核蛋白的细胞毒性。
譬如，在PD果蝇模型中，HSP70的表达可以减轻或阻止a -突触核蛋白引起的神经元损伤;而在酵母中HSP70水平的增加也可以有效地减缓或抑制PD的发生〔3，4〕。