转染步骤及经验（精华）
细胞转染步骤
细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基,“米”字形摇晃。
当细胞生长到50％-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系:(6cm盘)2。
4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基.混匀后室温静置10—15min孵育。
3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6.再过6h加入G418，进行筛选(始终在6cm盘中进行）,使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变,只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时,可考虑药物浓度减半.筛选出稳定表达的cell。
8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul,在96孔板中加入培养基150ul/孔,在加入细胞悬液10ul/孔,待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm 盘增殖。
2.伴随着细胞的生长,可能最后会变成细胞簇,故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9.单克隆鉴定:提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10.先做RT-PCR筛选一部分,在做western继续筛选一部分.所需物品:1。
转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3。
24孔板；4.6孔板；5.6cm盘；6。
G418 7. 1mlHEPES液。
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
细胞转染步骤
细胞转染步骤细胞转染是一种将外来脱氧核糖核酸（DNA）或核苷酸序列引入细胞内的技术。
这个过程可以用于研究基因功能、病毒感染和基因治疗。
在细胞转染过程中，有几个重要步骤需要注意。
下面是一个关于细胞转染步骤的简要介绍。
第1步：提取DNA或RNA在细胞转染前，需要先准备好DNA或RNA。
其中，DNA可通过PCR扩增、酵母合成，或从细胞中提取。
RNA则可通过反转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR）反转录，然后进行DNA扩增。
第2步：选择转染方法目前有很多种不同的细胞转染方法，包括电穿孔、热休克、化学转染等。
要选择适合的转染方法，需要考虑许多因素，如细胞类型、转染效率和毒性等。
常用的转染剂有聚乙烯醇、脂质体、钙磷酸盐等。
第3步：制备转染复合物转染复合物是转染时添加的液体溶液，用于将DNA或RNA引入细胞。
制备复合物通常需要将DNA或RNA与转染剂混合，然后使其与乙醇或其他化学物质形成稳定的颗粒，最终形成复合物。
转染时需要将制备好的转染复合物直接加入培养基中，让细胞与其接触。
接触后，DNA或RNA会被吸附到细胞表面并被内吞到细胞内部。
转染过程通常需要一定程度的时间，具体时间取决于细胞类型和转染复合物的选用。
第5步：培养和维护转染成功后需要对细胞进行培养和维护。
这通常需要注意以下几个因素：1）细胞浸润度：细胞密度应该适合，以便观察细胞形态和产物的表达量。
2）培养基成分：为了保持细胞生长，需要选择适当的培养基成分。
3）药物筛选：转染后可能需要添加药物对细胞进行筛选，以便筛选出目标基因。
4）稳定性维护：为了保证目标基因稳定的表达，需要适当地维护和稳定细胞系。
以上是细胞转染过程中的几个关键步骤。
在进行细胞转染时，需要注意步骤的顺序和方法的选择，以便提高转染效率和成功率。
瞬时转染实验步骤
瞬时转染实验步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，可用于将外源DNA或RNA导入到目标细胞中，以研究基因表达和功能。
本文将介绍瞬时转染实验的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.1 制备转染试剂：根据所需的转染试剂种类，准备相应的试剂。
常用的转染试剂包括有机溶剂转染试剂（如Lipofectamine 2000）、阳离子聚合物转染试剂（如Polyethylenimine，简称PEI）等。
1.2 制备转染质粒：准备含有目标基因的转染质粒。
转染质粒应进行质粒提取、纯化并测序确认。
1.3 培养细胞：细胞应在培养皿中充分培养至70%～90%的浓度，以保证转染效率。
1.4 预热培养基：将足够的培养基提前预热至37℃，以用于细胞培养和转染。
二、转染操作步骤2.1 向细胞培养皿中加入转染试剂：按照转染试剂的使用说明书，向培养皿中加入适量的转染试剂，并在无血清培养基中混合均匀。
2.2 加入转染质粒：将准备好的转染质粒溶液滴加入培养皿中，注意避免空气泡。
2.3 孵育细胞：将培养皿放置在37℃的培养箱中孵育一定时间，通常为4～6小时。
2.4 更换培养基：在转染后适当时间内更换含有血清的培养基，以保证细胞正常生长。
2.5 收获样品：根据实验设计和研究目的，选择合适的时间点收获转染后的细胞样品。
三、注意事项3.1 转染试剂浓度：转染试剂的浓度应根据实验目的和细胞类型进行优化，以达到最佳的转染效果。
3.2 转染时间和转染效率：转染时间过长或过短都可能影响转染效果，应根据实际情况进行调整。
3.3 质粒浓度和纯度：转染质粒应具有足够的纯度和浓度，以确保转染效果。
3.4 细胞密度和状态：细胞应在良好的状态下进行转染，过高或过低的细胞密度都会影响转染效果。
3.5 实验控制组：应设置适当的对照组，以进行比较和验证实验结果的可靠性。
总结：瞬时转染实验是一种常用的基因转染技术，通过适当的实验操作步骤和注意事项，可获得可靠的实验结果。
细胞转染的技巧
细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。
本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。
细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。
目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。
一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。
常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。
在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。
2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。
一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。
3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。
过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。
二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。
电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。
在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。
2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。
3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。
三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。
病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。
lio转染操作步骤精
Stealth? RNAi or siRNA Transfection以24孔板为例，其余规格的转染见表11 中板，细胞密度为30-50%适宜。
注意：根据转染后细胞检测时间长短决定细胞中板密度，如果转染后需要长时间后检测，则细胞中板密度适当降低，已避免细胞过度生长导致存活降低。
2 第二天（24-36小时后）每个孔转染方式如下：A 将20pmol siRNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将1ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
3 转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Plasmid DNA TransfectionDNA(ug):lipo 2000(ul)=1:2-3转染时细胞密度越高，转染效率，表达效率也越高，并且可以降低细胞毒性。
1 中板。
贴壁细胞：0.5-2X105 cells/well，第二天待细胞密度达到90%以上时转染悬浮细胞：4-8X105 cells/well，中板后随即转染。
2 转染。
A 将0.8ug DNA溶于50ul Opti-mem无血清培养基中。
B 将2ul lipo2000溶于50ul Opti-mem无血清培养基中，混匀室温放置5min。
C 将A B两管混合，放置20min。
转染期间，将24孔板培养基换成无血清培养基，每孔400ul。
将C管mix加入24孔板对应孔中，4-6小时候换成有血清培养基。
Table 1. Culture Shared reagents DNA transfection RNAi transfection*：中板密度根据不同细胞不同实验有所不同，这里仅提的数据仅供参考**：6孔板细胞质粒转染量1-2ug足以。
***：6cm dish细胞质粒转染量4-6ug足以。
转染步骤及经验(精华)
转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内地一种专门技术.分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典地磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导地技术；生物介导方法：有较为原始地原生质体转染，和现在比较多见地各种病毒介导地转染技术.理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点.病毒介导地转染技术，是目前转染效率最高地方法，同时具有细胞毒性很低地优势.但是，病毒转染方法地准备程序复杂，常常对细胞类型有很强地选择性，在一般实验室中很难普及.其它物理和化学介导地转染方法，则各有其特点.需要指出地一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优地转染结果，可能都需要对转染条件进行优化.影响转染效率地因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法地操作细节（见后文）.二、转染操作流程（以常用地孔板为例）()细胞培养：取孔培养板，以密度铺板，℃培养箱中培养至～汇合.(不同细胞略有不同，根据实验室优化地条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞).()转染液制备：在管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用地量)液：用不含血清培养基稀释μ ，终量μ，液：用不含血清培养基稀释对应量地转染试剂，终量μ；轻轻混合、液（混匀），室温中置分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染.()转染准备：用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清及地培养液.()转染：把复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，℃温箱置～小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养.三、转染注意事项. 血清. 阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物地形成.．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用地培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化.. 对于对血清缺乏比较敏感地细胞，可以使用一种营养丰富地无血清培养基Ⅰ培养基，或者在转染培养基中使用血清.对血清缺乏比较敏感地贴壁细胞，建议使用.无血清培养基()很好用，有条件地话，就用它代替洗细胞两遍，注意洗地时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面.如果洗地太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多..抗生素（）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染地培养基添加物.这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞地通透性，使抗生素可以进入细胞.这降低了细胞地活性，导致转染效率低.所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素.这样，在转染前也不必润洗细胞.对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是选择性抗生素地竞争性抑制剂.另外，为了保证无血清培养基中细胞地健康生长，使用比含血清培养基更少地抗生素量..细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳地生长状态再做.有文献说传代不要超过代.细胞复苏后地代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代地细胞去做，细胞地形态都会发生变化.大多数已建立地细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合地细胞地混合物.细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化.这会导致和转染相关地细胞行为地变化.如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜地细胞可能会恢复原先地转染活性.因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养地细胞以恢复最佳结果.或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系地细胞系现在有售..细胞铺板密度用于转染地最佳细胞密度根据不同地细胞类型或应用而异.因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死.一般转染时，贴壁细胞密度为，悬浮细胞密度为×细胞，确保转染时细胞没有长满或处于静止期.因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本地传代步骤很重要.铺板细胞数目地增加可以增加转染活性和细胞产量.细胞地融合度必须要达到才能做，.启动子地选择获得高转染活性所需选择地启动子依赖于选用地细胞系和要表达地蛋白.启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性.同其他启动子，如和（劳斯肉瘤病毒）相比，在中其活性最高.这三种病毒启动子在细胞来源地细胞系，如中组成表达水平较低.转染后在培养基中加入和可以激活细胞中启动子，而单就足以激活和（人骨髓瘤白细胞）中地启动子.启动子地表达在含有大抗原（存在于和）时会提高，因为大抗原可以刺激染色体外地合成.量高质量地对于进行高效地转染至关重要.转染地质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素.浓度不要低于.产物表达：小时表达最高；蛋白表达最高..瞬时和稳定表达及监测转染后，转入基因地表达可以在－天内检测到.仅有一部分转入细胞地被转运到细胞核内进行转录并最终输出到细胞质进行蛋白合成.几天内，大部分外源会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了.瞬时表达分析检测未重组质粒上基因地表达.因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件地影响.瞬时表达分析所需地人力和时间比稳定表达少，但因为摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心.为了进行稳定表达，转入地基因必须能和细胞同步复制.在转染地质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此.在一小部分转染地细胞中，加入地通过重组整合到基因组上.包含整合地细胞很少，必须通过对药物地抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定.稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需地时间更长.但得到地细胞系可以做为蛋白生产地稳定来源或用于得到转基因动物.瞬时转染和转染效率地监测，基因地瞬时表达在小时内就结束了.这种快速地瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤地效率.可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目地细胞中不含此蛋白或水平很低.常用地报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（），绿色荧光蛋白（），荧光素酶（或）以及半乳糖苷酶（），结合简单地检测步骤，可以做为监测转染条件地一种方便灵敏地方法..稳定转染细胞系地筛选连同带有药物抗性地筛选标记基因一起转染目地基因是建立稳定转染细胞系最常用地方法.氨基糖苷磷酸转移酶基因（或）可以合成酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对选择性抗生素（）地抗性.抗生素抗性基因可以与目地基因在同一个质粒上，也可以在不同地质粒上.如果两个不同地质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子.对于两种不同质粒地共转染，带有目地基因地质粒和带有筛选标记地质粒间地比例为或更高以保证抗性克隆带有转染地目地基因.阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株地高效方法.瞬时转染效率地改进一般也会提高稳定转染效率.比如，使用试剂得到地细胞抗生素抗性克隆地数目比单独使用增加了大约倍（图）.要进行稳定地表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力.生长地细胞比不分裂地细胞更快地受到抗生素地影响.转染后，在开始筛选前等待小时，使细胞表达足够量地抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护.转染后小时倒掉培养基，加入含有抗生素地培养基，抗生素地浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞.因为许多因子影响到筛选所需地抗生素地最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第章实验步骤）.筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量地抗生素存在条件下，细胞会分裂次.在次培养细胞时使用较低剂量地抗生素，一般是筛选剂量地一半.筛选后地细胞一般是离散地克隆，根据实验目地不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆地计数..蛋白表达和培养基地选择哺乳动物细胞系合成可溶地，翻译后修饰地蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达地蛋白更有可能有生物活性.稳定转染地细胞可以合成大量地重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白.常用地细胞系包括，和.提供克隆地，，和细胞，来源于经筛选转染效率更高地亚细胞系.这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基.重组蛋白地大规模生产一般在稳定转染地悬浮细胞中进行.这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白.使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长.用于蛋白生产地细胞地转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行.但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白地纯化.无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一地或大量地蛋白（但比添加血清地培养基低得多）.无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分地抽提物.限定化学成分地培养基不含有蛋白或未知组成地成分.多种多样地配方使您可以选择最适合您应用地一种.在含血清时转染地细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分地培养基.在部分情况下（如，，和），对于已适应无血清或无蛋白培养基地细胞，可以使用其培养基进行转染（图）.其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染地成分.在这些情况下，有必要在诸如或Ⅰ等培养基中进行培养和转染.。
一般转染操作步骤
一般转染操作步骤
1、稀释转染试剂
将6ul转染试剂FuGENE加到装有90-98ul预热到室温培养基的无菌聚丙乙烯管中，立即混匀，室温放置5min。
注：勿将未稀释的转染试剂FuGENE碰到管壁，造成稀释不充分。
2、制备转染物
加2ug的质粒DNA至稀释的转染试剂中，立即混匀，室温放置15min。
注：勿超过45min，否则影响转染效率。
3、添加转染物至细胞培养液
将2-10ul的转染物加到含有100ul细胞培养液的96孔板中，轻轻吸打或者左右摇晃10-30S以充分混匀。
推荐：5ul作为起始点
4、孵育培养
置于CO2培养箱中，培养24-48h检测。
转染试剂FuGENE：DNA=3:1
质粒DNA浓度：0.2-1 ug/ul
96孔板每孔2-10ul转染物成分：0.15-0.6ul的转染试剂+0.04-0.2ug的质粒DNA。
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转染步骤及经验（精华）转染步骤及经验（精华）一、基础理论转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。
二、转染操作流程（以常用的6孔板为例）（1）细胞培养：取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37C 5%CO2培养箱中培养至70%?90%汇合。
（不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞）。
（2）转染液制备：在EP管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用的量） A液：用不含血清培养基稀释1-10卩g DNA终量100 yL, B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100 uL轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。
（3）转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL 不含血清及PS的培养液。
（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37C温箱置6?8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。
三、转染注意事项1.血清A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。
B?一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。
C.对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEM I培养基，或者在转染培养基中使用血清。
对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。
无血清培养基OPTI-MEM （GIBICO）很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。
如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。
2?抗生素（PS）抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。
这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。
这降低了细胞的活性，导致转染效率低。
所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。
这样，在转染前也不必润洗细胞。
对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。
另外，为了保证无血清培养基中细胞的健康生长，使用比含血清培养基更少的抗生素量。
3?细胞状态这点非常重要，不要急于求成，一定要让细胞处于最佳的生长状态再做。
有文献说传代不要超过17代。
细胞复苏后的3代左右时细胞状态最好，不要用传了很多代的细胞去做，细胞的形态都会发生变化。
大多数已建立的细胞系都是非整倍体，原代培养包括了表达不同基因组合的细胞的混合物。
细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。
这会导致和转染相关的细胞行为的变化。
如果随时间发现这种变化，融化一管新鲜的细胞可能会恢复原先的转染活性。
因此，如果观察到转染效率降低，可以试着转染新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。
或者，几种来源于经筛选，转染效率较高细胞亚系的细胞系现在有售。
4?细胞铺板密度用于转染的最佳细胞密度根据不同的细胞类型或应用而异。
因转染试剂对细胞有毒害作用，细胞太少，容易死。
一般转染时，贴壁细胞密度为70%-90%，悬浮细胞密度为2-4 X 106细胞/ml，确保转染时细胞没有长满或处于静止期。
因为转染效率对细胞密度很敏感，所以在不同实验间保持一个基本的传代步骤很重要。
铺板细胞数目的增加可以增加转染活性和细胞产量。
细胞的融合度必须要达到90%才能做，5?启动子的选择获得高转染活性所需选择的启动子依赖于选用的细胞系和要表达的蛋白。
CMV启动子在大多数细胞类型中可以获得高表达活性。
同其他启动子，如SV40和RSV （劳斯肉瘤病毒）相比，在BHK-21中其活性最高。
这三种病毒启动子在T细胞来源的细胞系，如Jurkat中组成表达水平较低。
转染后在培养基中加入PHA-L和PMA可以激活Jurkat细胞中CMV启动子，而单PMA就足以激活KG1 和K562 （人骨髓瘤白细胞）中的CMV启动子。
SV40启动子的表达在含有大T抗原（存在于COS-1 和COS-7）时会提高，因为大T抗原可以刺激染色体外的合成。
6.DNA 量高质量的DNA对于进行高效的转染至关重要。
转染的质粒一定纯度好、浓度高、无内毒素。
浓度不要低于0.35ug/ul。
产物表达：48小时mRNA表达最高；72h蛋白表达最高。
7?瞬时和稳定表达及监测DNA转染后，转入基因的表达可以在1—4天内检测到。
仅有一部分转入细胞的DNA被转运到细胞核内进行转录并最终输出mRNA 到细胞质进行蛋白合成。
几天内，大部分外源DNA会被核酸酶降解或随细胞分裂而稀释；一周后就检测不到其存在了。
瞬时表达分析检测未重组质粒DNA上基因的表达。
因此，表达水平与位置无关，不会受到周围染色体元件的影响。
瞬时表达分析所需的人力和时间比稳定表达少，但因为DNA摄入效率和表达水平在不同实验中差异较大，实验必须很小心。
为了进行稳定表达，转入的基因必须能和细胞同步复制。
在转染的质粒自发整合到宿主基因组上时就会如此。
在一小部分转染的细胞中，加入的DNA通过重组整合到基因组上。
包含整合DNA的细胞很少，必须通过对药物的抗性筛选进行扩增或通过表型变化进行鉴定。
稳定基因表达实验需要数周，如果需要验证蛋白产量，所需的时间更长。
但得到的细胞系可以做为蛋白生产的稳定来源或用于得到转基因动物。
瞬时转染和转染效率的监测，基因的瞬时表达在24-72小时内就结束了。
这种快速的瞬时表达非常适用于验证质粒表达和监测转染步骤的效率。
可以使用报告基因来确定优化条件，其表达蛋白易检测，在目的细胞中不含此蛋白或水平很低。
常用的报告基因包括氯霉素乙酰转移酶（CAT）,绿色荧光蛋白（GFP）,荧光素酶（Lux或Luc）以及b-半乳糖苷酶（b-gal）,结合简单的检测步骤，可以做为监测转染条件的一种方便灵敏的方法。
8?稳定转染细胞系的筛选连同带有药物抗性的筛选标记基因一起转染目的基因是建立稳定转染细胞系最常用的方法。
氨基糖苷磷酸转移酶基因（APH或neor）可以合成APH酶，通过磷酸化使药物失活，从而提供对GENETCIN选择性抗生素（G418 Sulfate ）的抗性。
抗生素抗性基因可以与目的基因在同一个质粒上，也可以在不同的质粒上。
如果两个不同的质粒同时转染，两个质粒都可能整合形成稳定转化子。
对于两种不同质粒的共转染，带有目的基因的质粒和带有筛选标记的质粒间的比例为3:1或更高以保证抗性克隆带有转染的目的基因。
阳离子脂质体试剂提供了一种建立稳定转染株的高效方法。
瞬时转染效率的改进一般也会提高稳定转染效率。
比如，使用LIPOFECTAMINE PLUS 试剂得到的NIH 3T3细胞GENETICIN抗生素抗性克隆的数目比单独使用LIPOFECTAMINE 增加了大约3倍（图17）。
要进行稳定的表达分析，在转染后次培养细胞，低密度铺板，给予生长空间，在几天或数周内保持筛选压力。
生长的细胞比不分裂的细胞更快的受到GENETICIN 抗生素的影响。
转染后，在开始筛选前等待48-72小时，使细胞表达足够量的抗性酶，保证在开始筛选时可以自我保护。
转染后48-72小时倒掉培养基，加入含有GENETICIN 抗生素的培养基，抗生素的浓度根据剂量反应曲线确定，足够杀死未转染细胞。
因为许多因子影响到筛选所需的GENETICIN抗生素的最佳浓度，包括细胞类型，培养基和血清浓度等，所以有必要对每种细胞作一个剂量反应曲线，确定最佳浓度（参见第7章实验步骤）。
筛选最多可能需要一周时间，因为在致死剂量的GENETICIN抗生素存在条件下，细胞会分裂1-2次。
在次培养细胞时使用较低剂量的抗生素，一般是筛选剂量的一半。
筛选后的细胞一般是离散的克隆，根据实验目的不同，可以分别纯化（克隆），收集进行大量培养或染色并进行抗性克隆的计数。
9?蛋白表达和培养基的选择哺乳动物细胞系合成可溶的，翻译后修饰的蛋白，比细菌，真菌或昆虫细胞中表达的蛋白更有可能有生物活性。
稳定转染的细胞可以合成大量的重组蛋白，而瞬时转染细胞可以快速表达，迅速地合成小量蛋白。
常用的细胞系包括CHO，293和COS-7。
Invitrogen提供克隆的293-F, 293-H，COS-7和CHO-S细胞，来源于经筛选转染效率更高的亚细胞系。
这些细胞也可用于无血清和限定化学成分培养基。
重组蛋白的大规模生产一般在稳定转染的悬浮细胞中进行。
这些细胞易于生长到高密度并合成更多蛋白。
使用基质珠做为固相支持可以使贴壁细胞悬浮生长。
用于蛋白生产的细胞的转染可以在添加有血清或无血清培养基中进行。
但更倾向于使用无血清培养基表达蛋白，因为血清蛋白会干扰下游表达蛋白的纯化。
无血清培养基一般针对某一特定细胞类型优化并有几类无血清培养基不需要添加血清，一般含有不均一的或大量的蛋白（但比添加血清的培养基低得多）。
无蛋白培养基不含蛋白但可能含有不明成分的抽提物。
限定化学成分的培养基不含有蛋白或未知组成的成分。
多种多样的配方使您可以选择最适合您应用的一种。
在含血清时转染的细胞可以适应无血清培养基，无蛋白培养基或限定化学成分的培养基。
在部分情况下（如293-F，293-H，COS-7和CHO-S），对于已适应无血清或无蛋白培养基的细胞，可以使用其培养基进行转染（图18）。
其他一些无血清培养基包含抑制阴离子脂质体介导转染的成分。
在这些情况下，有必要在诸如D-MEM或OPTI-MEMI等培养基中进行培养和转染。