甲型肝炎病毒--IgM检测ELISA法作业指导书
甲肝的血清检测操作规程002
甲型肝炎病毒IgM抗体检测（HAV-IgM）操作规程文件号：WH-MY-002版本：第2版共： 3 页2009年3月1日起实施本规程每2年复审一次复审日期：2009年2月27日复审人：雷凤珠规程编写者：王莉红审批者：王金成批准日期：2009年2月28日检验科主任：雷凤珠1、检验目的：用于甲型肝炎的早期诊断。
2、检测原理：本试剂在微孔条上预包被羊抗人－IgM(u链)，配以酶标抗原（HAV-HRP）及TMB显色剂等其他试剂，采用捕获法原理检测人血清(或血浆)中的甲肝IgM抗体（HAV-IgM）。
3、试剂和仪器：3.1试剂：北京万泰生物药业有限公司3.2试剂盒组成：3.3试剂稳定性：原装试剂在2－8℃避光保存，有效期6个月。
3.4仪器：3.4.1 YB-DX23D电动吸引器（上海医疗设备厂）3.4.2 TE-B型定时微量振荡器（江苏泰县）3.4.3 37℃孵箱（天津实验仪器厂）4、标本：4.1静脉抽取空腹患者标本3.0ml(真空采血管)，将血液放置在37℃水浴箱中30分钟后，分离血清。
4.2样品收到后不要急于分离血清，以免血块收缩不良造成结果假阳性。
4.3溶血标本不能用于检测，因溶血可造成假阳性结果出现。
4.4用完的标本，应在样品管上注明日期，放置在2－8℃冰箱中保存一周。
4.5样品放置一周后，逐管加入1：50的84消毒液，并放置4小时后，装入医疗垃圾带由专人按医疗垃圾处理。
5、操作5.1操作步骤：5.1.1配液：将25ml浓缩洗涤液（20×）用蒸馏水或去离子水稀释至500ml备用。
5.1.2编号:将样品对应微孔按序号编号,每板应设阴、阳性对照各2孔和空白对照1孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步相同），5.1.3加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴、阳性对照50ul。
5.1.4温育：置37℃温育20分钟。
5.1.5洗涤：将孔内液体用吸引器吸干，用洗涤液充分洗涤5遍，用吸引器吸干。
5.1.6加酶：每孔加入酶标试剂2滴（100ul）,轻轻振荡混匀。
测定甲型肝炎IgM抗体的ELISA改良法
测定甲型肝炎IgM抗体的ELISA改良法
许执文;谢汝瑛
【期刊名称】《浙江省医学科学院学报》
【年(卷),期】1992(003)003
【总页数】2页(P37-38)
【作者】许执文;谢汝瑛
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】R446.61
【相关文献】
1.捕获ELISA法测定抗EV71-IgM抗体用于EV71感染早期诊断 [J], 林裕龙;温坤;王压娣;晋晶;车小燕
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甲肝抗体IGM的检测课件
ELISA类型
夹心法 间接法测抗体 竞争法 捕获法
捕获法测IgM抗体
血清中针对某些抗原 的特异性 IgM 常 和特异 性IgG同时存在，后者会 干扰IgM 抗体的测定 。 因此测定 IgM 抗 体多用 捕获法
➢ 包被抗体：用抗人μ链抗体包被固相载体上,形成固相抗 人μ链;
➢ 加入病人的血清标本; ➢ 加入特异性抗原试剂;， ➢ 加入针对特异性抗原的酶标抗体， ➢ 加底物显色．
抗HAV总抗体 抗HAV-IgM
临床意义
• 血清中抗HAVIgM出现于感染的早期(发病后数日)抗体的效价很快升 到峰值并持续较长时间(2-4周),经1-2个月后抗体的效价和阳性率明 显不降,于3个月后消失.因此抗HAVIgM阳性,尤其是效价较高时,表明 处于感染的早期,被公认为早期诊断甲肝的依据,是区别是急性感染 还是慢性感染的有力佐证。
甲型肝炎病毒IgM抗体的测定 (捕获法)
黄艳
酶联免疫吸附试验（ELISA法）
将抗体(抗原)包被在固相表面后，按不同的步骤加入 待测抗原(抗体)和酶标抗体(抗原)，充分反应后用洗涤的方 法，使固相上形成的抗原抗体复合物与其他物质分离，洗 去游离的酶标抗体(抗原)，最后加入底物，根据酶对底物 催化的显色反应程度，而对标本中的抗原(抗体)进行定性 或定量。
操作步骤
1．将微孔条固定在支架上，按顺序编号。 2．分别将待测标本，阴、阳性对照100μl（2滴）加入相应的 孔中，设空白对照孔。置37℃20分钟。 3．洗涤：甩去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，共 三次，每次洗后均需扣干。 4．每孔加HA·Ag50μl，酶结合物50μl（空白对照除外），振 荡混匀，置37℃20分钟。 5．洗涤：重复上述3 6．显色：每孔加显色剂A液50μl，再加显色剂B液50μl，振荡 混匀，置37℃15分钟。 7.每孔加终止液50μl
甲型肝炎病毒IgM抗体操作步骤
甲型肝炎病毒IgM抗体操作步骤1．检验目的：检测人血清或血浆中的抗HA V-IgM。
2．检测原理：本品系用抗人-IgM（u链）包被的微孔板，配以纯甲型肝炎抗原（HA V-Ag）和酶标记的甲型肝炎病毒抗体（抗HA V-HRP）及其它试剂，采用捕获法原理，检测人血清或血浆中的抗-HA V-IgM。
34．操作：4.1 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有结晶析出应充分溶解）浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。
4.2 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。
4.3 加样：待测样本用生理盐水作1：1000稀释，每个样本检测孔加入稀释样本100 uL。
设阴阳对照各1孔，每孔加入100 uL，并设空白对照1孔。
4.4 温育：置37℃温育20分钟，室温平衡2分钟。
4.5 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。
4.6 加抗原、酶：每孔加入抗原（HA V-Ag）30 uL、酶标记抗体50uL（1滴），充分混匀。
4.7 温育：置37℃温育20分钟。
4.8 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完后扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。
4.9 显色：每孔加底物A、B各50uL，轻拍混匀，置37℃暗置15分钟。
4.10 终止：每孔加终止液50uL，混匀。
4.11 测定：用酶标仪单波长450nm/630nm测定各孔OD值（用单波长测定需设定空白对照一孔，30分钟完成测定，并记录结果）。
5. 结果判定：5.1 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD均值N×2.1阴性对照OD值低于0.050←0.050计算，高于0.050按实际OD值计算。
5.2结果判定：样品OD值S/C.O.≥1者为HA V-IgM阳性样品OD值S/C.O.＜1者为HA V-IgM阴性5.3 失效：如果阳性对照OD均值小于0.05，则表明不正常的操作或试剂盒已变质损坏。
在此情况下，应再次仔细阅读说明书，并用新的试剂盒重新测试。
甲型肝炎病毒IgM( HAvIgM )标准操作程序SOP文件
文件编号： ABCD-SOP-01-14AB C D 医院 免疫实验室［前言］这种抗体是感染甲肝病毒（HAV ）后病人血中最早出现的一种抗体，属于HAV衣壳抗体。
［原理］Z 本试剂盒采用捕获法检测人血清或血浆中的甲肝IgM 抗体。
具有简便、快速、准确、样本不需稀释等优点，适用于甲型肝炎的早期诊断。
试剂自生产日起避光贮存于2-8℃,有效期内稳定。
［标本的收集与处理］标本为无溶血血清。
［操作步骤］1、加样：将包被板预先编号。
设空白对照1孔，阴、阳性对照各2孔。
力口阴、阳性对照血清各50ul 于相应孔内，其余各孔分别加入50ul 待测样本（不能稀释）, 轻轻振荡后封板。
2、温育：置37℃水浴箱温育30分钟。
3、洗涤：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置2分钟，扣去洗涤液，重复4次，最后一次在吸水纸上拍干。
4、加酶:除空白对照孔外,每孔加入HA.Ag50ul ,酶标记物溶液50ul,轻轻振荡后封板。
5、温育：置37℃水浴箱温育30分钟。
6、洗涤：同步骤3洗涤7、显色：每孔加底物液A 1滴（50ul ）.底物液B1滴（50ul ）,轻拍混匀后,置37℃水浴15分钟，目测结果或加入终止液1滴（50ul ）用酶标仪判读。
［结果判定］1、目测法：在白色背景下观察各孔颜色，无色或极淡兰色判为阴性，呈明显 甲型肝炎病毒IgM （ HAvIgM ） 版序：abed 页码：第1页，共2页［试剂组成］1、包被板条2、阴性对照血清3、阳性对照血清4、醵标记物溶液5, HA. Ag［试剂厂家］深圳月亮湾生物工程有限公司［试剂的稳定性与贮存］ 6、底物液A 7、底物液B 8、终止液 9、浓缩洗涤液 （用蒸储水1： 20稀释后使用）文件编号：ABCD-SOP-01-14 兰色判为阳性。
AB C D医院免疫实验室版序：abed甲型肝炎病毒IgM( HAvIgM ) 页码：第2页，共2页2、酶标仪检测法(选择波长450nm)：用空白孔校零，测定各孔吸光度0D值。
人甲肝病毒IgG抗体(HAV-IgG)ELISA试剂盒使用说明书
人甲肝病毒IgG抗体（HAV-IgG）ELISA试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于检测人血清，血浆及相关液体样本中人甲肝病毒IgG抗体（HAV-IgG）水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗原夹心酶联免疫法（ELISA）测定标本中人甲肝病毒IgG抗体（HA V-IgG）。
用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，可与样品中甲肝病毒IgG抗体（HA V-IgG）相结合，经洗涤除去未结合的抗体和其他成分后再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中人甲肝病毒IgG抗体（HA V-IgG）的存在与否。
试剂盒组成：样本处理及要求：1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
胸腹水、脑脊液参照实行。
4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。
通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。
离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清。
保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5. 组织标本：切割标本后，称取重量。
加入一定量的PBS，PH7.4。
甲型肝炎病毒--IgM检测(ELISA法)作业指导书
甲型肝炎病毒--IgM检测(ELISA法)作业指导书1.原理本法是用抗人μ链捕获待测血清中特异性IgM，然后用HAV与特异性—IgM 抗体反应，再加酶标记抗M抗体，最后加底物显色。
2.标本采集2.1采集前病人准备：受检者应空腹。
2.2标本种类：血清或血浆。
2.3标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。
3.标本储存：2-8°C保存不应超过1周，-20°C不应超过3个月，-70°C长期保存，应避免反复冻融。
4.标本运输：密封，室温运输。
5.标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。
6.试剂6.1 试剂名称：抗HAV—IgM检测ELISA试剂盒6.2 试剂生产厂家：xx技术研究所6.3 包装规格：48Test/Kit6.4 试剂盒组成：包被反应板，样品稀释液，酶标记抗体，阳性对照血清，阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，密封袋。
6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。
7.仪器设备7.1仪器名称：自动酶标仪7.2仪器厂家：Rayto7.3仪器型号：RT-2100C8操作步骤8.1平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。
8.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。
8.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号。
8.4加样品稀释液：用加样器在微孔反应条板孔中加入样品稀释液，每孔100μl，空下四孔准备加对照。
8.5加标本和留空白：将每份待检标本各5μl分别加入已有样品稀释液的各孔中，留下一孔不加标本作空白对照，标好位置。
8.6加对照：在预先空下的四孔中用加样器分别加入阴性对照一孔，阳性对照三孔，每孔100μl，标好位置。
对照应在所有标本加完以后再加，以保证阈值准确性。
免疫标准操作程序SOP
标准操作程序[目的]保证检测结果准确可靠。
[该SOP变动程序]本标准操作程序的变动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经专业主管、科主任批准签字。
[标本的采取和保存]采静脉血2ml，分离血清备用。
也可以使用血浆标本进行检测。
标本宜新鲜，无污染，避免溶血，避免反复冻融，不可用NaN3防腐。
[测定原理]采用兔抗-人IgMu链包被反应被，加入待测标本，同时加入HA V Ag，抗HA V-HRP，如待测标本中含有抗-HA V-IgM时，就能与包被兔抗-人IgMu链结合，并且与HA V Ag,抗-HA V-HRP 结合成复合物，加TMB底物产生显色反应，反之则无显色反应。
[操作步骤]1.将待测标本用生理盐水作（1：1000）稀释，每孔加入稀释标本100ul，设阴、阳性对照各2空，每孔加入阴性对照（或阳性对照）100ul（或2滴），并设空白对照一孔，封板，置37度孵育20分钟。
2.洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。
手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各空，静置5秒，甩干，重复三次后拍干。
3.每孔加入HA V Ag30ul（或一滴），酶结合物50ul（或一滴），（空白对照孔不加），充分混匀，封板，置37度孵育20分钟。
4.洗板机洗板：选择洗涤5次程序洗板后拍干。
手工洗板：弃去孔内液体，洗涤液注满各空，静置5秒，甩干，重复三次后拍干。
5.每孔加显色剂A液、B液各50ul（或一滴），充分混匀，封板，置37度孵育10分钟。
6.每孔加入终止液50ul（或一滴），混匀。
7.用酶标仪读数，取波长450nm（建议使用双波长的酶标仪比色，参考波长630nm），先用空白孔校零，然后读取各孔OD值。
[结果判断]样品OD值除以阴性对照平均OD值大于或等于2.1判断为阳性，否则为阴性阴性对照OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算[临床意义]血清中HA V—IgM在亚临床期即已出现，其滴度在感染后3个月维持在1000以上，早被公认为早期诊断甲型肝炎的依据。
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甲型肝炎病毒--IgM检测ELISA法作业指导书
1.原理
本法是用抗人μ链捕获待测血清中特异性IgM，然后用HAV与特异性—IgM抗体反应，再加酶标记抗M 抗体，最后加底物显色。
2.标本采集
2.1采集前病人准备：受检者应空腹。
2.2标本种类：血清或血浆。
2.3标本要求：采集病人静脉血2ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。
3.标本储存：2-8°C保存不应超过1周，-20°C不应超过3个月，-70°C长期保存，应避免反复冻融。
4.标本运输：密封，室温运输。
5.标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。
6.试剂
6.1 试剂名称：甲型肝炎病毒IgM抗体诊断试剂盒6.2 试剂生产厂家：厦门新创生物药业股份有限公司6.3 包装规格：96Test/Kit
6.4 试剂盒组成：
HAV-IgM酶联板1块96孔，，酶标试剂1瓶，阳性对照血清1管，阴性对照血清1管，20*浓缩洗涤液，底物A 1瓶，底物B 1瓶，终止液1瓶，封口膜1张，密封袋1套。
6.5 试剂储存条件及有效期：2-8°C避光保存，有效期6个月。
7.仪器设备
7.1仪器名称：酶标仪
7.2仪器厂家：上海三科
7.3仪器型号：MC—318
8操作步骤
8.1平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25°C），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。
8.2配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。
8.3编号：将微孔条固定于支架，按序编号每板应
设阴性对照3孔，阳性对照2孔，空白1孔。
8.4加样：分别在相应孔中加入待测样品或阴，阳性对照50微升。
8.5温育（一）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温
育20分钟。
8.6洗涤（一）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。
8.7加酶：除空白孔外，分别在每孔中加入酶标记
抗体100 l，轻拍混匀。
8.10 温育（二）：充分混匀，加上封板膜，置37℃温育40分钟。
8.11 洗涤（二）：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。
8.12 显色：每孔加入底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗处15分钟。
8.13 终止：每孔加终止液50μl，混匀。
8.14 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。
9. 结果判断与分析
9.1 临界值（C.O.）的计算：临界值＝阴性对照孔OD 值N×2.1，阴性对照OD均值大于0.1时应重新试验，小于0.05时以0.05计算。
9.2 结果判定：样品OD值S/C.O>=1者为阳性
样品OD值S/C.O<1者为阴性
10. 质量控制：每次均应有阴阳对照，其OD值应在要求范围内。
11.参考值范围：阴性
12. 临床意义：血清中抗HAV-IgM在亚临床期即已出现，其滴度在感染后3个月维持在1000以上，已被公
认为早期诊断甲型肝炎的依据。
13. 操作性能：特异性强，灵敏度高，重复性好。
14. 方法局限性
15. 注意事项
15.1 每板建议设阴阳性对照血清各两孔，设空白对照时，不加样品及酶标记抗体，其余各步相同。
15.2 洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。
15.3 加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。
如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。
滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。
注意勿将试剂滴在孔壁上。
15.4 所有样品都应按传染源处理。
15.5 封口膜使用说明
15.5.1 微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。
在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。
15.5.2 微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其他因素对实验带来的非预期的影响。
15.6不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。
16. 当检测系统（仪器）不能工作时，所采取的补救措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正常后复查。
17. 参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。
全国临床检验操作规程（第二版）410页。
18. 其它：必须按规定使用经中国药品生物制品检定所检定并贴有“检定合格”防伪标签的试剂。