生物化学技术原理总复习

5.硫酸铵盐析
6.羟基磷灰石柱层析 7.PAGE
0.048
0.016 0.012
3367
3133 3100
71.7
200.0 255.0
102.0
286.0 365.0
17
15 15
比活力 = 活力单位数／毫克蛋白 纯化倍数 = 每步的比活力／粗抽提液的比活力 收得率 = 每步的总活力/粗抽提液总活力×100％
紫外光谱法
A.测定核酸含量
构成核酸的碱基组分是分光法测定核酸含量的依据。 在测定过程中，DNA或RNA溶液浓度的增加或降低， 会使其在波长260nm的消光值(A260) 随之增加或降低， 二者之间成正比关系。
用A260／A280比值可确定DNA和RNA的纯度：
纯DNA比值为1.8 纯RNA的比值为2.0 当比值小于1.8/2.0时，样品污染了蛋白质或酚类物质 ＞ 1.8/2.0 时，表明有RNA污染或有异硫氰酸残存
第三节 细胞的破碎
1、研磨法
一、机械破碎 二、溶胀和自溶 三、化学处理
2、组织捣碎器法 3、超声波法： 4、压榨法： 5、冻融法
四、生物酶降解
第五节 浓 缩
常用的浓缩方法有下面几种:
沉淀法 吸附法 超过滤法 透析法 减压蒸馏法 冰冻干燥法 超速离心法
浓缩样品时应注意：
保护样品的生物活性，因此除了减压蒸馏浓缩法 外，其余的浓缩方法均应在4℃进行（除例外）； 操作过程中要保持样品有相对高的回收率；
基团和亲水基团之间比例的差异）,通过改变溶液的某 些性质（如pH、极性、离子强度、金属离子等），能 使抽提液中有效成分的溶解度发生变化而沉淀。
可通过选择适当的抽提溶剂使欲分离的有效成分最 大溶解，而杂质最小溶解；或者相反。从而达到分 离的目的。
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二、蛋白质沉淀法
生物大分子物质的制备
第一节 材料的选择与处理
一、材料的选择
1. 生物材料
一般可以分为两大类： 天然生物材料：一般是指在自然界易采集的、目的 物含量较高的生物个体、器官或组织。 人工生物材料：又分为三种： 新品种材料，组织培
养材料，生物产品与生物制品材料。
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有效成分
11．分配系数（K）
指某一组分在固定相与流动相中含量的比值。 常用K表示。
K = Cs/Cm
Cs: 固定相中的浓度 Cm: 流动相中的浓度。
K为热力学常数：与组分性质、固定相性质、流动相
性质及温度有关。实验条件固定，K仅与组分性质有关， 是层析中分离纯化物质的主要依据。
12. 迁移率（或比移值） :
表1-7 L-门冬酰胺酶的纯化
步骤 1.粗抽提液 2.氯化锰处理 3.冰冻融解 4.DEAE-纤维素层析 总蛋白 /g 30 7.64 5.58 0.113 总活力 /u 21000 15017 14872 5025 比活力 u/mg 0.7 2.0 2.7 44.5 纯化倍数 1 2.8 3.8 63.5 收得率 % 100 72 71 24
生物化学技术原理及应用
总复习
考试题型
一、填空题（每空0.5分，共10分）
二、选择题（每题1分，共10分)
三 、判断正误（每题1分，共10分）
四、名词解释(每题3分，共12分) 五、简答题（每题6分，共24分） 六、实验分析及设计题（3小题，共34分）
生物化学研究技术方法
生物化学研究技术：
– 分离技术
4．操作容量（或交换容量）
即在特定条件下，某种成分与基质反应达到平 衡时，存在于基质上的饱和容量；
一般以每克(或毫升)基质结合某种成分的毫摩尔 数或毫克数来表示。( mmol/g, mg/g, mmol/ml, mg/ml )
其数值越大，表明基质对该成分的结合力越强。
床体积(Vt)
床体积是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积( Vt )。 Vt是基质的外水体积(V0)和内水体积(Vi)以及自身体积(Vg) 的总和，即: Vt = V0 + Vi + Vg 外水体积(V0) ：指基质颗粒之间体积的总和 内水体积(Vi ) ：指基质颗粒内部体积的总和 基质体积(Vg) ：指基质自身所具有的体积 都随床体积和基质性质变化而变化 洗脱体积(Ve)：洗脱体积是指某一成分从柱顶部到底部 的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相体积。
样品，会导致样品体积大量增加。
– 透析法：使用透析袋，通过透析作用改变蛋白质
溶液中的盐浓度。该法较温和，分级效果好；但 仅用于精确、样品体积小的试验中。
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(4) 脱盐
常用的脱盐方法：凝胶过滤法、透析法。 透析法脱盐的原理是分子扩散运动。 其具体操作是：
把待脱盐溶液装入有一定孔径的透析袋， 扎紧袋口(袋内留有适当空间，以免引起透析袋 胀裂)，漂在水或适当的透析液中，要防止透析 液从袋口进入。
第三章 吸附层析
吸附层析(adsorption chromatography) 又称色层法或色谱法。
3．层析
以基质为固定相(柱状或薄层状)， 以液体或气体为流动相， 有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行 分配、吸附或交换作用， 最终使混合物得到分离的过程。
指在一定条件下，某一组分在相同时间内，在
固定相中移动的距离与流动相中移动距离之比值 （R f ）。
Rf ＝ 在固定相中移动的距离 在流动相中移动的距离
R f ≤1。
K增加，Rf减少；反之， K减少，Rf增加。
正相色谱与反相色谱
正相色谱（normal phase partition chromatography，NPC）
在尽可能短的时间内完成；
样品的分子量与方法及工具要匹配。
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第六节 纯化方案的设计与评价
纯化方案： 是指在纯化某一物质过程中，将几种分离方法 (如沉淀法、离子交换层析、葡聚糖凝胶过滤等)有
机地互补联合、灵活应用的总称。
纯化方案的评价方法
对纯化过程中每一步收集到的溶液要进行：
沉淀、吸附、膜分离（过滤、透析等）、离心、层析、电泳等
– 分析检测技术
电泳、层析、质谱、光谱、电化学技术、分子标记等
– 分子生物学研究技术
基因重组、分子杂交、PCR与反转录、核酸测序、免疫技术、 生物芯片等等
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生物大分子物质的制备
第一章 生命大分子物质的制备
生命大分子物质
是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有 效成分以外的其他物质则统称杂质。 有效成分在材料中存在的特点

有效成分的含量一般较少
如胰脏中胰岛素的含量小于其鲜重的百万分之一。

有效成分稳定性较差
大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感，易 被微生物分解变质。

选用的材料不同，有效成分的含量就不同
通常是指：动物、植物和微生物在进行新陈代谢时所 产生的蛋白质(包括酶)和核酸等有机化合物的总称。
生物大分子物质在生物体内具有各种生理活 性，这些活性的产生与其结构有着密切关系， 因此，分离此类物质不能用一般的化学分离方 法，而是采用比较特殊的生化分离方法。
生物大分子物质的制备
生物大分子的制备
1. 生物材料的选择 2. 细胞的破碎 3. 生物分子的抽提 4. 生物分子的浓缩 5. 有效成分纯度和性质分析
分级效果好（有的一步分级沉淀就可除去75％以上杂蛋白） 有稳定蛋白质结构的作用
将硫酸铵盐析的蛋白质臵低温下保存一年，其性质没有变化
价格低廉，废液可以肥田
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硫酸铵盐析
– 固体法：使用固体硫酸铵，适用于大体积样品
– 饱和溶液法：较固体法温和，但不适用于大体积
生物大分子物质的制备
制备方法的选择– 生物来自分子制备方法的选择是以生物大分子的理
化性质为依据的。
生物大分子的理化性质与分离纯化方法的选择
理化性质 分子大小和形态 溶解度 电荷差异 生物功能专一性 分离及纯化方法 差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、萃取、分配层析、结晶 电泳、等电聚焦、离子交换层析 亲和层析
在吸附层析中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。 在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点；
吸附位点通过范德华力(中性分子彼此距离非常近时， 产生的一种微弱电磁引力)和静电引力与蛋白质和核 酸等生物分子结合； 其结合力的大小与各种生物分子的结构和吸附剂的性 质有密切关系。
常用的吸附剂
极性的：羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、 人造沸石等 非极性的：活性炭等
指固定相的极性高于流动相的极性，因此，在这种 层析过程中非极性分子或极性小的分子比极性大的分子 移动的速度快，先从柱中流出来。 反相色谱（ reversed phase partition chromatography，RPC ）
是指固定相的极性低于流动相的极性，在这种层析 过程中，极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而 先从柱中流出。 一般来说，分离纯化极性大的分子（带电离子等）采用 正相色谱（或正相柱），而分离纯化极性小的有机分子 （有机酸、醇、酚等）多采用反相色谱（或反相柱）。
最佳加样量与踏板理论
踏板理论是把整个层析柱长 （ L ）比喻为蒸馏塔，在某一段 柱长范围内溶质在固定相和流动 相之间达到平衡，这一段柱长便 相当于一个理论踏板的高度（H）， 踏板理论数（Ｎ）便表示柱内溶 质谱带的分布。
样品高度H
柱长 L
柱长 L 踏板理论数N ＝ 样品高度H
第一节 吸附柱层析
基本原理