药物的体外抗菌试验
实验二部分清热药的体外抗菌实验PPT课件
黄芩
对肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、 白色念珠菌具有较强的抗菌作用， 对大肠杆菌具有一定的抗菌作用。
黄柏
对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌具 有较强的抗菌作用，对肺炎链球 菌、白色念珠菌具有一定的抗菌
作用。
抗菌效果与药物浓度的关系
黄连
随着药物浓度的增加，对金黄色葡萄球菌、大肠 杆菌的抗菌效果增强。
黄芩
实验二部分清热药的 体外抗菌实验ppt课件
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 实验结果 • 结论分析
01
实验目的
了解清热药抗菌作用
了解清热药对细菌的抑制作用
通过实验观察清热药对细菌生长的抑制作用，探究其抗菌效 果。
探究清热药抗菌机制
通过实验分析，探究清热药抗菌的主要成分和作用机制，为 后续研究提供理论依据。
体外抗菌实验方法
实验材料
不同种类的清热药、标准菌株、培养 基等。
实验步骤
制备药物稀释液、接种标准菌株、设 定对照组和实验组、培养细菌并观察 菌落生长情况、记录数据。
数据分析与处理
数据处理
对实验数据进行整理、统计和分析，计算抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低 杀菌浓度（MBC）。
结果分析
比较不同药物对不同细菌的抗菌效果，分析药物抗菌谱和抗菌活性，为临床用药 提供依据。
黄柏
主要对革兰氏阳性菌和阴性菌具有较强的抗菌作用，对白色念珠菌 也有一定的抗菌效果。
05
结论分析
清热药的抗菌作用评价
抗菌效果显著
抗菌谱广
实验结果显示，清热药在体外抗菌实验中 表现出显著的抗菌效果，对多种常见细菌 具有明显的抑制作用。
清热药对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌等 多种细菌均有抗菌作用，具有较广的抗菌 谱。
实验4 药物体外抗菌试验_PPT幻灯片
1、 K—B纸片法（学生操作）
纸片法常用于测定试验菌对各种抗生素 的敏感性，所以又叫做药物敏感试验，在 临床上可作为选择用药的重要依据。
操作步骤
1 培养试验菌：将菌种斜面培养物移种到肉 汤培养液中，37℃培养过夜，使菌液浓度 约为1.5×108cfu/ml.
最小抑菌浓度（MIC）：能抑制测试菌 生长的最低药物浓度即为MIC。
最小杀菌浓度（MBC）：能杀死测试菌 的最低药物浓度即为MBC。
试验测试(1h)
1、革兰氏染色 做好后请用油镜调好后举手示意
2、平板分区画线 做好后做好标记（学号）将平板扔到玻璃 缸中
2 涂布试验菌：用无菌吸管吸取一滴菌液滴 加在MHA平板上，用无菌涂布棒（L棒）将 菌液在整个平板上涂布均匀。
3 贴含药的滤纸片：用无菌镊子贴加含药滤 纸片。Байду номын сангаас
4 将平板倒置于37 ℃培养24h，观察结果， 测定抑菌圈的大小，并对照NCCLS的解释 标准来判断试验菌的药敏性。
2、连续稀释法
连续稀释法：人为配置连续梯度的药物 浓度来检测其抗菌能力，从而找出药物的 最小抑菌浓度。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
thweek药学实验四药物的体外抗菌试验
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查
三、耐药性的控制
1 、避免耐药菌传播（医院） 2 、合理用药 （1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。 （2）合理联合用药 3、 抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生 素等。 4 、耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合 理用药。
四、耐药性和青霉素酶的测定
1 、耐药性—药敏试验 2 、青霉素酶 耐药菌接平板培养 →加含青霉素的淀粉 → 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶 株）。
医疗用抗生素的特点
差异毒力大 生物活性强、有不同抗菌谱 不易使病原菌产生耐药性 毒副作用小，不易引起超敏反应 半衰期长，生物利用度高
抗生素的分类 抗生素产生菌的分离和筛选 抗生素的制备 抗生素的生物合成 抗生素的主要作用机制 抗药性 抗生素的单位及效价测定
（1）按化学结构分类
ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等 四环类—四环素、土霉素、金霉素 氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素 大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素 多肽类—多黏菌素、杆菌肽等 多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素 苯羟基胺类—氯霉素 蒽环类—柔红霉素、阿霉素 环桥类—利福霉素 其他
平板倍比稀释法
目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是 根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不 同浓度抗生素的平板上恒温培养16~18小时，可抑制细菌生长 的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低 药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药 物的抑菌或杀菌作用愈强。
磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合 成酶，而引起耐药。 （靶位的改变）
喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺 旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中， gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶， 引入负超螺旋至闭环双链DNA中。 （靶位的改变）
药物体外抗菌试验
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制.因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一)稀释法(结果示教)稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二)琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内,由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长,此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片.一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法:选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。
5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔,4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品,放在37℃，12—18小时，测定其抑菌圈直径。
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二、棋盘格法（check board test）
是由于在试验时,含两种不同浓度药物的试管排列呈 棋盘状而得名,用以评价两种药物同时用不同浓度进 行联合试验时的抗菌活性。 实验时排列6排试管，每排6管，共36管使成方块，A 及B药各以液体培养基进行稀释，A药各稀释度纵行 定量加入各管，B药各稀释定量按横排加入，两药 同时作单独抗菌实验对照。然后加入定量菌液，经 培养后观察结果。
影响试验结果，特别是中草药制剂往往含有 色素、杂质和鞣质等，这些均可造成错误结 果，应加注意。
抗菌试验的影响因素
4、对照试验： ❖ 为精确判断实验结果，试验时应设各种对
照，包括试验菌对照、已知药物对照及溶剂 和稀释液对照等。
❖ 在实际工作中，往往可见到体外实验有 作用的药物，进入机体后由于各种原因而失 效，有的药物毒性很大也不能用于临床。
❖ 滤纸片法： ❖ 制成含菌平板后，将滤纸片蘸取药液置
于平板上，培养后观察结果，量取抑菌圈直 径以此判断试验药物抑菌作用的强弱。
❖ 用于新药的初筛及临床的药敏试验。
❖ 挖沟法： ❖ 1、在琼脂平板上挖沟，沟两边垂直划线接种
各种试验菌，沟内加入药液。 ❖ 2、培养后，根据沟两边所生长的试验菌离沟
联合抗菌试验
在药学中，常需要检查两种抗菌药物在联合应用时的 相互作用以及抗菌药物与不同PH值或不同离子溶液 的相互影响。
加强药物抗菌作用的为协同（synergism）； 减弱药物作用的为拮抗（antagonism）； 互相无影响的为无关（indifference）； 作用二者之和为累加（addition）。
液体连续稀释法
❖ 1、在一系列的试管中用液体培养基将试验药 物作连续对倍稀释，使药物的浓度沿试管顺 序成倍递减。
❖ 2、再于各管中加入等量的实验菌，经 16～ 24 h培养后，与阴性及阳性对照管进行对照 观察。
❖ 3、将未长细菌的培养液取出，分别转种琼脂 平皿。如培养后重新长出试验菌，说明该药 仅有抑菌作用。如无菌生长则可以认为该药 物有杀菌作用。
微生物与药学的关系
❖ 1.某些微生物可以生产药物（微生物制药） ❖ 2.微生物可能会污染药品（药物的微生物检查） ❖ 3.某药物有能抑菌或是杀菌（药物的抗菌试验）
药物的体外抗菌 试验
药物的体外抗菌试验
❖ 用途： ❖ 抗菌药物的筛选、药物的抗菌谱测定及
临床药物敏感性试验等方面。
抑菌：即抑制微生物的生长繁殖，但不能杀死微 生物，在药物除去后微生物又能生长；
联合抗菌试验的常用方法
一、纸条试验（paper strip test）
即在已接种实验菌的平板表面垂直放置两条浸有一 种药液的滤纸条，培养后根据抑菌区的加强、减弱 或无影响来判断它们在联合应用时的效应。 图20-2是纸条实验的示意图。
图20-2是纸条实验的示意图。图中A列的两纸条中只有一条含 有抗菌药物，另一条不含抗菌药物；B列的两纸条均含有抗菌
连续稀释法
❖ 可用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和 最低杀菌浓度（MBC）。可以用液体培养基， 也可用固体培养基。
❖ 凡能抑制试验菌生长的最高药物稀释度为该 药的最低抑菌浓度 （Minimal inhibitory concentration，MIC）。
❖ 以培养后无细菌生长的最高药物稀释度为最 小杀菌浓度（Minimal bactericidal concentration，MBC）。
杀菌：即能杀死微生物，当药物除去后，微生物也不 能再生长繁殖。
两者并非绝对，只是在一定条件下相对而言。
常用的体外抑菌试验
琼脂扩散法 滤纸片法
❖
挖沟法
连续稀释法
琼脂扩散法
❖ 原理： 药物可以在琼脂培养基中自由扩散，形成一定浓度的含药
区域。 由于各种微生物对不同药物或同一药物不同浓度的敏感性
不同，因而形成一定大小的抑菌圈或抑菌距离，根据其大小， 可以了解药物的抗菌作用大小或是微生物对试验药物的敏感性。
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抗菌试验的影响因素
2、培养基 ❖ 抗菌试验的培养基应按试验菌的需求配制，如链球
菌常用含血清的肉汤培养基，抗真菌药物试验需用 沙氏培养基。 ❖ 培养基的酸碱度、电解质、还原性物质等均可影响 试验结果，实验时应尽可能排除各种影响实验结果 因素的掺入。 ❖ 经无菌检查合格。
抗菌试验的影响因素
3、抗菌药物 ❖ 药物的浓度、pH及含有的其他成分均可
的距离来判断药物对试验菌的抗菌作用强弱。
❖ 适用于在一个平板上试验一种药物对几种不 同试验菌的抗菌作用。
❖ 琼脂扩散法具有方法简便，技术要求不 高，易掌握操作的特点。但精确度不高，一 般能用于定性或初步判断其作用的强弱。
❖ 液体稀释法是一种测普遍 。
抗菌试验的影响因素
❖ 1、试验菌： ❖ 用专门的供应机构提供的标准菌株。 ❖ 北京卫生部药品生物制品检定所菌种保藏中
心。 ❖ 试验菌应合理保藏，用前加以纯化及生物学
特征鉴定。
❖ 所用的试验菌株应处于对数生长期，因此期 的微生物对外界因素变化最敏感。
❖ 试验结果的灵敏度在一定程度上与试验菌的 接种量成反比关系，故应选用适宜的接种量。