药物的体外抑菌试验
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
第十九章药物的体外抗菌试验
抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与 该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈 越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长 所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青 霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿 假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一 般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配 好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻 度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失， 从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同 的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校 正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基 作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液 体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹 在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平 板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平 皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸 片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后 不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距 不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的 平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。
thweek药学实验四药物的体外抗菌试验
结果观察与记录
观察抑菌圈
通过观察抑菌圈的大小，初步判断药物的抗菌 效果。
数据记录
详细记录实验过程中的数据，如菌种名称、药 物名称、稀释比例、抑菌圈大小等。
结果分析
根据记录的数据，进行结果分析，计算药物的抑菌率或最小抑菌浓度等指标。
04
数据分析与结论
数据整理与处理
数据收集
收集实验过程中获得的药物抗菌数据，包括不同 药物浓度下的抑菌圈直径、细菌生长曲线等。
展望未来研究方向
根据实验结果和数据分析，展知
实验操作注意事项
实验前应仔细阅读相关文 献，了解实验原理、操作 步骤及注意事项。
在实验过程中，应保持实 验室整洁，避免交叉污染。
确保实验操作符合实验室 安全规定，遵循正确的操 作流程。
实验结束后，应按照实验 室规定正确处理废弃物。
纸片扩散法
将含有不同浓度抗菌药物的纸片贴在接种了细菌的琼脂平板上，观察 抑菌圈的大小，判断药物的抗菌效果。
时间-杀菌曲线法
记录抗菌药物在不同时间对细菌数量的影响，了解药物的杀菌速率和 杀菌效果。
了解抗菌药物的作用机制
大环内酯类
主要抑制细菌蛋白质的合成。
氨基糖苷类
与细菌核糖体结合，抑制蛋白 质合成。
thweek药学实验四药物的 体外抗菌试验
目录
• 实验目的 • 实验原理 • 实验步骤 • 数据分析与结论 • 实验注意事项与安全须知
01
实验目的
理解药物体外抗菌试验的原理
药物体外抗菌试验是指在体外条件下，通过实验室方法测试抗菌药物对病原微生 物的抑制或杀灭作用。其原理基于药物对微生物细胞膜、细胞壁、核酸或蛋白质 等生物大分子的影响，从而干扰或破坏微生物的正常生长和繁殖。
抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验
《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。
由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。
抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。
药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。
它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。
其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。
琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。
在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。
抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。
当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。
如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。
实验六、抗菌药物的体外药效试验
实验六、抗菌药物的体外药效试验(药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。
此外,通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。
药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验(Kirby —Baueer Dice Diffusion）;最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）和最低杀菌浓度试验(Minimum Bactericidal Concentration, MBC）.［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。
2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途.［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法.琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面,然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。
根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。
经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力.浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内,加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）.1、细菌:所用细菌应包括主要致病菌。
革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。
革兰氏阴性球菌如淋球菌等。
革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等.对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。
其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200—500株。
试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
药物体外抗菌试验
主 要 内 容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验
MIC及MBC的测定 药敏试验——纸片法（大肠/金葡） 药物的细菌和霉菌总数测定
体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为 连续稀释法（MIC） MIC。 ：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和 真菌总数 ？ 细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克 或每毫升待检药品内含有的活 菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药 品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲 液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌 氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀， 制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法
无菌吸管少量菌液滴加于平板 培养基（MHA）中央（2滴）； 涂布棒将菌液涂开； 做好标记；镊子夹取相应药物 纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h； 测量抑菌圈直径（3次取平均 值）,并对照NCCLS的解释标准 （105页）来判断试验菌的药 敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌 落数小于300之间的平板计算，菌落数乘 以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品 中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。
体外抗菌药物抑菌试验(亦称细菌对药物的敏感试验-简称药...
❖ 敏感(S)：表示细菌可被常规剂量的药物在体内达到 的浓度所抑制或杀灭。
❖ 中度敏感(MS)：表示细菌可被该药物大剂量的浓度 所抑制或在药物生理性浓集的部位被抑制。
只有少数药物可报告中度敏感，如氨苄青霉素测肠 球菌。
❖ 中介度(1)：是为防止因技术因素失控导致结果误差 而设置的“缓冲域”因其临床意义难以确定，故不 应向临床医师报告。而应重做稀释法根据MIC结果 做出判断。
优缺点
❖ 稀释法是直接定量地检测抗菌药物在体 外对病原菌的抑制或杀灭浓度，有利于 临床根据MIC、药物代谢等拟定合理的 治疗方案，是目前厌氧菌的最佳测定方 法，琼脂稀释法还易于发现污染或耐药 突变菌。稀释法是新药开发，体外药敏 试验常用的经典参照标准，但操作相对 比较烦琐。
❖ 标准菌株的抑菌圈应落在表中所示的预期范 围内。如果超出该范围，应视为失控，须及 时查找原因，予以纠正。
❖ 培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、 试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具 的精度、质控菌株的药敏特性等均能影响结 果的准确性。
（二）肉汤稀释法 及琼脂稀释法
❖ 原理 是用水解酪蛋白肉汤(MH)或水解酪 蛋白琼脂（MHA）培养基作为稀释剂。 按《美国委员会临床实验室标准》作分 步倍比稀释抗菌药物，定量加入被检菌 株。经培养后观察抗菌药物的最小抑菌 浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
❖ 根据本国国情，卫生部临床检验中心还制订了关于 临床微生物实验室室内质控要求。临床具体工作须 参照遵守。
❖ 原理 是将定量抗菌药物纸片贴在涂有细菌的 琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散， 其浓度逐渐递减，使纸片周围的敏感细菌受 到抑制生长，形成抑菌圈，测量抑菌圈的直 径来判定细菌对药物的敏感程度。此法简单 易行、价格便宜、药物选择灵活，适用对生 长快的细菌进行药敏试验。
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实验五药物的体外抗菌试验
药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力。
该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制。
因此，药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法，其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一）稀释法（结果示教）
稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二）琼脂扩散法
它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作
滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片。
一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法：选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。
然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还
要放在-20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片。
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。
世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断。
步骤：
活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果
打洞法（结果示教）
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔，4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定其抑菌圈直径。
所以说微量法适于药物血浓度的监测。
优点是微量（血清用量少）敏感，操作简便。
管碟法（结果示教）
与打洞法原理相同，只是把药液加入放到琼脂板上的牛津杯中。
加药量相对比较多，适合中药的体外抗菌试验。
挖沟法（结果示教）
方法是先制备普通琼脂平板，并在平板上挖直沟，在沟内滴加药液，在沟侧接种细菌。
经过培养以后观察家细菌生长的情况。
我们可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。
复习题：
1药物体外抑菌试验常用的方法有哪几种？具体的试验操作方法？
2如何测定药物的最小致死浓度？。