项目7药物体外抗菌试验技术

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抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验

《生物工程综合实验平台》——《抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验》专业班级：学号：姓名：小组成员：实验日期：5月27日-5月30日微生物综合实验抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验班级16级生物技术1、2班姓名学号座位号实验日程安排抗菌药物的体外抑菌及体内抗菌实验一、实验原理抗菌药物一般是指具有抑菌或杀菌活性的药物，包括各种抗生素、磺胺类、咪唑类、硝基咪唑类、喹诺酮类等化学合成药物。

由细菌、放线菌、真菌等微生物经培养而得到的某些产物，或用化学半合成法制造的相同或类似的物质，也可化学全合成。

抗菌药物在一定浓度下对病原体有抑制和杀灭作用。

药物的体外抑菌实验，是指在体外测定药物抑制或杀灭细菌能力的实验。

它是常用抗菌实验的方法，其中最常用的方法有系列稀释法和琼脂扩散法。

稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种，这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度，通常用ug/ml或U/ml表示。

其结果判断方法为凡无肉眼可见细菌生长的药物最低浓度即为该菌的最小抑菌浓度（MIC）。

琼脂扩散法是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低。

在药物一定的扩散距离内，由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长，此无菌生长的范围称为抑菌圈。

抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。

琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。

一般药敏实验常采用纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。

世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈的大小来判断，如：药物的体内抗菌实验又称为动物实验治疗试验或保护力试验。

当抗菌药物进入机体后，其效力的发挥要受体内各种因素的影响。

如血液及组织内的蛋白质或磷脂、浓汁内的核酸均与药物结合，降低药物的活性；坏死组织内的酸性环境也能影响药物的活性。

第十九章药物的体外抗菌试验

抑菌圈的大小反映待测菌对该药物的敏感程度并与该待测菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，最低抑菌浓度就越小。
最低抑菌浓度（MIC）：指抗菌药物能够抑制细菌生长所需要的最低浓度，单位是ug/ml或u/ml。
如庆大霉素对铜绿假单胞菌的MIC为1.56ug/ml，青霉素G的MIC>128ug/ml，由此可判定庆大霉素对铜绿假单胞菌的抑菌效力大于青霉素。
5、影响结果的因素
（1）培养基：除在M－H培养基上无法生长的细菌外，一般都固定使用M－H培养基。
（2）抗菌药物：原则上采用标准粉剂，不用口服药物，配好的原液应在有效期内使用。
（3）结果观察：应在12－18小时之间。培养时间过长，轻度抑制的细菌可重新生长；或抗菌活性降低，甚至消失，从而使MIC值增高。
（3）接种菌液的准备：从纯培养的平板上挑取形态相同的4－5个菌落，接种于 3－5mlM－H液体培养基内， 35℃培养4－6小时，营养要求高的则培养过夜，然后校正菌液浓度至0. 5麦氏比浊标准，再用M－H液体培养基作1：200稀释，并在15分钟内接种。
3、试验步骤
（1）排列10－15支试管，除第1支外，各管加入M－H液体培养基1ml。
（三）实验步骤
（1）菌液接种：用灭菌过的棉拭蘸取已制备的菌液涂抹在M－H平板培养基的表面，均匀涂抹3次，每涂一次，平板应转动60度，最后将棉拭绕平板内缘涂沫一圈，盖上平皿盖，放置室温干燥数分钟。
（2）药物纸片的贴放：以无菌镊子取各种抗菌药物纸片，贴放于已接种过试验菌的平板培养基表面，纸片贴后不能再移动，因为有些药物可立即扩散。各纸片中心间距不小于24mm，距平板边缘不小于15mm。直径为90mm的平板可贴放6张纸片。贴后15分钟内倒置35℃培养箱16－ 18小时后阅读结果。

药物的体外抗菌试验-第十九章

药物的体外抗菌试验-第十九章第十九章药物的体外抗菌试验教学要求.（一）掌握常用的体外抑菌试验（连续稀释法、琼脂扩散法）。

.（二）熟悉杀菌试验（最低杀菌浓度、最低致死浓度的含义及测定的方法，活菌计数法，石碳酸系数测定法）；联合抗菌试验（纸条试验、梯度平板纸条试验、棋盘格法），协同、拮抗、无关、累加的概念。

.（三）了解体外抗菌试验的影响因素。

第一节常用的体外抑菌试验一、药物的体外抗菌试验.又称药敏试验，主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性。

.最低抑菌浓度（MIC）：指药物完全抑制某种微生物生长的最低浓度。

.优点：方法简便、需时短、用药量少，不需要动物。

.缺点：不能根据体外试验结果肯定或否定一个药物的抗菌作用。

试验菌.细菌、霉菌和酵母菌常用.标准菌株：来自专门机构，我国是卫生部生物制品检定所菌种保藏中心提供。

.临床分离株：经形态、生化及血清学等方面鉴定。

不得有杂菌污染，不宜用传代多次的菌种，最好是重新活化的。

控制培养时间。

.接种菌量的多少的计算培养基.根据试验菌的营养要求进行选择.培养基质量控制供试药物.药物的浓度和总量要精确配制.供试药物用适宜溶剂溶解并稀释至所需浓度，难溶药物加助溶剂。

.中草药或某些生药原粉的样品，应先提取，再浓缩至所需浓度对照试验.试验菌对照：在无药情况下，应能在培养基内正常生长.已知药物对照：已知抗菌药对标准的敏感菌株应出现预期的抗菌效应，对已知的抗药菌应不出现抗菌效应。

.溶剂及稀释剂对照：抗菌药物配制时所用的溶剂及稀释剂应无抗菌作用（一）连续稀释法.方法：液体法和固体法。

.用于测定药物的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）。

.抑菌：药物可抑制微生物生长繁殖，但不杀死它，在药物除去后，微生物又可恢复生长.杀菌：药物能杀死微生物，当药物去除后，微生物不再继续生长。

1、液体培养基稀释法.方法：两倍稀释法.步骤：液体培养基稀释药物成系列递减的浓度每管加入一定量试验菌24-48小时后肉眼观察试管浑浊情况，记录能抑制细菌生长的最低浓度（MIC）将未见细菌生长的各试管内的培养液（各吸取0.1ml）移种到新鲜的琼脂培养基上重新长出细菌的只具有抑菌作用，无菌生长（菌落数﹤5个）具有杀菌作用，记录最低杀菌浓度（MBC）。

药物的体外抗菌试验药物制剂的微生物学检查

三、耐药性的控制
1 、避免耐药菌传播（医院） 2 、合理用药（1）抗生素可不用尽量不用，使用时应足量。（2）合理联合用药 3、抗耐药菌新抗生素的寻找，如酶抑制剂抗生素等。 4 、耐药机制的研究—耐药规律寻找，有助于合理用药。
四、耐药性和青霉素酶的测定
1 、耐药性—药敏试验 2 、青霉素酶耐药菌接平板培养 →加含青霉素的淀粉 → 加I2出现透明圈（eg.金葡菌产酶株）。
医疗用抗生素的特点

差异毒力大生物活性强、有不同抗菌谱不易使病原菌产生耐药性毒副作用小，不易引起超敏反应半衰期长，生物利用度高

抗生素的分类抗生素产生菌的分离和筛选抗生素的制备抗生素的生物合成抗生素的主要作用机制抗药性抗生素的单位及效价测定
（1）按化学结构分类
ß-内酰胺类—青霉素、头孢菌素等四环类—四环素、土霉素、金霉素氨基糖苷类—链霉素、卡那霉素、庆大霉素大环内酯类—红霉素、螺旋霉素、麦迪霉素多肽类—多黏菌素、杆菌肽等多烯类—制霉菌素、两性霉素B、万古霉素苯羟基胺类—氯霉素蒽环类—柔红霉素、阿霉素环桥类—利福霉素其他

平板倍比稀释法
目前抗生素的临床前研究一般采用此法。平板倍比稀释法是根据药物在琼脂培养基中扩散的原理，将细菌接种在含有不同浓度抗生素的平板上恒温培养16~18小时，可抑制细菌生长的最低药物浓度为最低抑菌浓度（MIC），可杀灭细菌的最低药物浓度为最低杀菌浓度（MBC）。MIC或MBC值愈小，则药物的抑菌或杀菌作用愈强。
磺胺类耐药菌株合成了对磺胺不敏感的二氢叶酸合成酶，而引起耐药。（靶位的改变）

喹诺酮类耐药菌的gyrA(gyrase)基因突变，DNA螺旋酶A亚单位的变化，对该类药物不敏感。其中， gyrase（DNA旋转酶）为一种类型的拓扑异构酶，引入负超螺旋至闭环双链DNA中。（靶位的改变）

实验六、抗菌药物的体外药效试验

实验六、抗菌药物的体外药效试验（药敏试验）各种病原菌对抗菌药物的敏感性不同，同种细菌的不同菌株对同一药物的敏感性有差异，检测细菌对抗菌药物的敏感性，可筛选最有疗效的药物，用于临床对控制细菌性传染病的流行至关重要。

此外，通过药物敏感试验可为新抗菌药物的筛选提供依据。

药敏试验的方法很多，普遍使用的有滤纸片扩散试验（Kirby-Baueer Dice Diffusion）；最低抑菌浓度试验（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度试验（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）。

［目的要求］1、熟悉体外抗菌试验操作技术。

2、掌握药物抗菌能力体外测定的常用方法及其用途。

［实验原理］常用的体外测定药物抑菌能力的方法有两大类：琼脂渗透法与浓度系列稀释法。

琼脂渗透法时利用药物能够渗透至琼脂培养基的性能，将实验菌混入琼脂培养基后倾注成平板；或将试验菌均匀涂于琼脂平板的表面，然后用不同的方法将药物置于已含试验菌的琼脂平板上。

根据加药的操作方法不同而有滤纸片法、打洞法、管碟法及挖沟法等。

经适宜温度培养后观察药物的抑菌能力。

浓度系列稀释法时把药物稀释成不同的系列浓度，混入培养基内，加入一定量的试验菌，经适宜温度培养后观察结果，求得药物的最低抑菌浓度（MIC）。

1、细菌：所用细菌应包括主要致病菌。

革兰氏阳性球菌包括金黄色葡萄球菌(产酶与不产酶菌株)、表皮葡萄球菌，链球菌、肠球菌等。

革兰氏阴性球菌如淋球菌等。

革兰氏阴性杆菌包括流感杆菌、肠杆菌科细菌8～10种，绿脓杆菌与其它假单孢菌属及不动杆菌属等，厌氧菌包括脆弱类杆菌、消化球菌和消化链球菌等。

对临床应用有代表性的菌株数量，创新药应不小于1000株。

其它类新药根据新药抗菌谱宽窄可作200-500株。

试验时应包括有国际公认质控菌株(如金葡菌ATCC25925，大肠杆菌ATCC25922和绿脓杆菌ATCC27853等)。

《药学微生物》3-5-1 药物抗菌性的测定技术

步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果文
挖沟法
可以根据沟和细菌间的抑菌距离的长短，来判断该药物对这些细菌的抗菌能力。
图挖沟法
打孔法：
在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔， 4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品，放在37℃，12-18小时，测定其抑菌圈直径。所以说微量法适于药物血浓度的监测。
机体本身对细菌有较强的抵抗力，一般细菌感染动物后不易使动物致病，所以体内抗菌实验模型建立比较困难，动物实验感染模型一般分为全身感染和局部感染模型。
管碟法：
与打孔法原理相同，只是把药液加入放到琼脂板上的牛津杯中。加药量相对比较多，适合中药的体外抗菌试验。
3．抗菌药物的联合应用（1）棋盘稀释法（2）琼脂扩散纸片法
纸条试验：
1．只有横条纸片含抗菌药 2．两条纸片含不同抗菌药
图联合抗菌试验纸条法
1．梯度平板制备 2．加强作用图纸条梯度平板试验
3、中草药的抗菌作用
4、其他抗菌剂（消毒剂、防腐剂）的作用机制
试验菌
二、药物抗菌作用试验方法（一）药物体外抗菌试验 1、影响抗菌试验的因素控制
培养基
供试药物
对照试验
2．药物的体外抗菌试验技术常用的有稀释法和琼脂扩散法。
稀释法是药物系列稀释后加入菌液，观察细菌生长与否来判断结果。常用于测定药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)。
图液体培养基连续稀释法
琼脂扩散法
纸片扩散法挖沟法平板打孔法管碟法等
纸片扩散法:
一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药。选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时。然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液，每100张纸片加入 0.5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中， 37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。

药物体外抗菌试验

实验六

主要内容
教师讲解 1组/2人
4人/组
药物体外抗菌试验

MIC及MBC的测定药敏试验——纸片法（大肠/金葡）药物的细菌和霉菌总数测定

体外抗菌试验
：能抑制测试菌生长的最低药物浓度即为连续稀释法（MIC） MIC。：能杀死测试菌的最低药物浓度即为MBC。
琼脂扩散法（K-B纸片法）
药物的细菌和霉菌总数测定
为什么要检定药品中的细菌和真菌总数？细菌菌落总数（ Colony Form Unit，简写CFU ），指每克或每毫升待检药品内含有的活菌总数。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(1)
无菌操作取供试药品1 g或1mL，取10 mL无菌生理盐水，在无菌研钵中加入药品和少量pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲液，将药品研碎，再将剩余的pH7.0无菌氯化钠–蛋白胨缓冲液全部倒入并研匀，制成的均匀1：10（ 10-1 ）供试液。
MIC及MBC的测定
MBC
不含药的平板
纸片法的原理
K-B纸片法

无菌吸管少量菌液滴加于平板培养基（MHA）中央（2滴）；涂布棒将菌液涂开；做好标记；镊子夹取相应药物纸片贴于含菌平板表面； 37℃培养箱内倒置培养24h；测量抑菌圈直径（3次取平均值）,并对照NCCLS的解释标准（105页）来判断试验菌的药敏性。
如何做口服药物中细菌总数的测定？
(4)计算每个平板上生长的菌落数，选菌落数小于300之间的平板计算，菌落数乘以稀释倍数，求得每克或每毫升供试品中所含的菌落总数。
注意
1 无菌操作。 2 不同稀释剂不可使用同一吸管。 3倾倒培养基时温度不宜过高。 4培养时培养基要倒置。 5 做阴性对照。

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（三）抗菌药物及含防腐剂药物的无菌检验
抗菌药物指药物本身为抗菌剂(如抗生素、磺胺药等)以及在药物制剂中含有部分抗菌剂(如防腐剂)的药物。抗菌药物及含防腐剂的药物进行无菌检验时，与一般药物不同之处在于进行无菌检验前，必须用某些方法使抗菌药物或防腐剂消除、失效，才能不影响对被检药物是否无菌作出确认。
三、抗菌试验的影响因素
在抗菌试验中应有效控制其影响因素，才能确保试验的科学性和准确性，主要的影响因素有： ①试验菌 ②培养基 ③供试药物 ④对照试验
.
第二节灭菌制剂的无菌检查
❖ 无菌检查的基本原则
1. 严格进行无菌操作 2. 正确进行样品采集
3. 无菌检查用培养基
4. 需氧菌、厌氧菌培养基：硫乙醇酸盐培养基
3．酚系数测定
是用来测定消毒剂效力的一种指标，是以石炭酸为标准，在相同的实验条件下，将消毒剂和石炭酸的杀菌力作比较，所得的杀菌效力的比值，石炭酸系数≥2为合格。
（三）联合抗菌试验法
同时应用两种抗菌药物时，两种药物之间既可能产生相互影响，也可能彼此不影响；产生影响时，既可能是相互加强(协同作用)，或两药作用出现累加现象(即两药作用之和)也可能是相互减弱(拮抗作用)，要确定两种药物之间的作用关系时，通常需用联合抗菌试验法。最简便、最常用的方法：纸条或纸片试验法。
• 厌氧菌阳性对照菌：生孢梭状芽胞杆菌 CMCC(B)64941
• 真菌阳性对照菌：白色念珠菌CMCC(F)98001或曲霉菌ATCC16404
需要进行无菌检查的药品、敷料、灭菌器具的范围：
(药品、敷料按《中国药典》收载的无菌检查法的规定进行，生物制品应按照《生物制品制造及检定规程》中有关规定进行)
二、控制菌的检查
1. 口服制剂中不能检出大肠杆菌 2. 脏器口服制剂不得检出沙门氏菌和大肠杆菌 3. 一般外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌 4. 用创伤、溃疡、止血、深部组织的药材药粉制剂不得检出破伤风杆菌。
活螨的检验
用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品均不得检出活螨
◇直接观察法：用肉眼直接观察被检药物上有无白点移动，再
2．活菌计数法
在—定浓度的定量药物内，加入—定量的试验菌，作用—定时间后取样稀释，再取— 定量的此稀释液混入未凝固的琼脂培养基中，立即倾注成平板，培养后计算菌落数。由于每个菌落是由—个菌细胞繁殖而来，则菌落数或菌落形成单位CFU)乘以稀释倍数，再除以稀释液用量，即得该药物与试验菌的混合液中每毫升内存活的细菌数或CFU，从而可算出该药物对细菌的致死率。
体外抑菌试验是最常用的抗菌试验，常用的方法主要有琼脂扩散法和系列稀释法。１.连续稀释法 1)液体培养基连续稀释法 2)固体培养基连续稀释法: 平板法、斜面法２.琼脂扩散法 1）滤纸片法 2）挖沟法 3）管碟法 4）打孔法
(二)体外杀菌试验
用途：评价药物对微生物的致死活性
1．最小杀菌浓度的测定
是取MIC终点以上未长菌的各管培养液，分别取出并移种于无菌平板上，培养后凡平板上无菌生长的药物最低浓度，即为该药物的MBC。对微生物广义而言，也可称之为最小致死浓度 (MLC)。某药物能杀死微生物的最低浓度。
用放大镜或解剖镜观察。
◇漂浮法：将被检药物放入容器内，加饱和盐水至容器的２／
３处，搅匀，取液镜检，或继续加饱和食盐水至容器口，用载玻片蘸取液面漂浮物镜检。
◇分离法：将药物放在特制分离器或附有筛网的漏斗内，离药
物６cm上放置６０～１００Ｗ的灯泡，照射１～２h.螨有避光怕热的习性，便沿漏斗细颈向下爬，在漏斗下口处置一装有甘油水的烧杯，收集爬出的螨，然后在显微镜下观察，根据其形态特征、足肢游动情况判断是否为活螨。
（二）油剂的无菌检验
油剂药物与液体培养基不能混溶，故常漂浮于液体培养基表面而影响试验结果。因此，此类药物做无菌检验时，应在培养基内加入表面活性剂(吐温—80)，使药物均匀分布于培养基中，以利于细菌的生长和检出。有的药物如青霉素油剂等，由于粘稠度过大，可先用灭菌植物油或灭菌液体石蜡进行一定倍数的稀释，然后取样接种到含吐温—80的培养基中，充分摇匀使药物均匀分散在培养基中。
可吸收的止血剂：如凝血酶等用于止血并可被组织吸收的各种药物制剂。
无菌检查法
（一）非抗菌剂、无防腐剂、及非油剂药物的无菌检验
一般药品的无菌检验，通常应用直接接种法。若被检品是液体，可直接接种于培养基内。若被检品是固体粉末或冻干制剂，则需用无菌生理盐水溶解，或制成均匀悬液再作检验。若被检品是无菌敷料，则以无菌操作打开包装，于各部位剪取1cmX3cm大小的样品，再接种到培养基中。
1、灭活法２、薄膜过滤法３、离子交换树脂法 4、稀释法
第三节微生物的限度检查
微生物限度检查项目内容：
❖ 微生物限度检查的基本原则 ❖ 染菌量的检查 ✓ 细菌数 ✓ 霉菌数 ❖ 控制菌的检查 ✓ 大肠埃希氏杆菌(大肠杆菌) ✓ 金黄色葡萄球菌 ✓ 沙门氏菌 ✓ 铜绿假单胞菌(绿脓杆菌) ✓ 破伤风杆菌 ❖ 活螨的检验
.
二、药物的体内抗菌试验
体外抗菌试验有效的药物，还需要经过体内抗菌试验证明有效后，才能推荐应用于临床。
体内抗菌试验即动物的实验治疗或保护力试验。动物实验治疗的方法，大致是先用致病菌使动物体表或体内感染，造成感染动物模型，然后按不同剂量、不同给药方法(如腹腔注射、皮下注射、肌肉注射或口服等)以及间隔不同时间进行实验治疗。实验时还要设立一组动物用生理盐水代替药物进行对照治疗。然后根据实验组与对照组的动物死亡数或内脏的含菌数，评价药物的作用和效力。
项目7 药物体外抗菌试验技术
▪ 模块1 必备知识——药物的体外抗菌试验
主要用于筛选抗菌药物或测定细菌对药物的敏感性，又称药敏试验。体外抗菌试验包括抑菌和杀菌两个方面。
（一）体外抑菌试验
最小抑菌浓度(MIC) ：MIC是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度。通常用表示。其值越小，说明抑菌作用愈强。
一、染菌量的检查
1. 目的
▪ 细菌数测定我们是为了考察每克或每毫升供试品所污染的活细菌数，来判明供试品被细菌污染的程度。
▪ 霉菌的测定是考察每克或每毫升供试品所污染的活的霉菌数，以此来判明供试品被真菌污染的程度。
2. 测定的方法
➢ 细菌总数的测定营养琼脂平板培养基 +0.001%三苯四唑氯化物（TTC） ➢ 霉菌总数的测定玫瑰红钠（马丁）培养基
各种注射剂：用于肌肉、皮下和静脉的各种针剂，包括注射用的无菌水、输液、注射剂原液等。
眼用及外伤用制剂：用于眼科手术、角膜创伤及一般创伤、溃疡和烧伤等外科用药制剂。
外科用的敷料、器材：如外科手术用的脱脂棉、纱布、缝合线及一次性注射器与一次性无菌手术刀片、输血袋等。
植入剂：用于包埋于人体内的药物制剂，如不溶于水的激素、免疫药物及抗肿瘤药物等无菌的制剂。
5. 真菌培养基 6. 选择性培养基
7. 阴性对照及阳性对照
8. 阴性对照
阴性对照应不长细菌，说明培养基本身是无菌可靠的；阳性对照试验必须长菌，说明应用的细菌是可以在该试验条件下正常生长的。
9. 阳性对照
10. 抑菌试验 11. 无菌检查法 12. 无菌检验结果判断
• 需氧菌阳性对照菌：金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003或藤黄八叠球菌CMCC(B)28001