抗菌肽体外抑菌实验方法
抗菌肽抑菌活性测定方法的研究
抗菌肽或肽类抗生素为生物体内稳定存在或 在 创 伤 感 染 后 诱 导 产 生 的 一 类 活 性 分 子 ［1 ，2 ］ 。 其 分 子 量 较 抗 生 素 大 ，分 子 结 构 复 杂 。 抗 菌 肽 具 有 水 溶 性好，无免疫原 性 ，抗 菌 性 广 谱 等 特 点 ，并 对 肿 瘤 细胞、病毒、真 菌 和 原 虫 等 有 杀 伤 作 用 ，是 一 类 令 致病菌很难产生耐药性的新概念药物
脂 ， 溶解后于 0.1 Mpa 、121℃ 下灭菌 20 min ， 冷却至
再 以 MH 培 养 基 对 其 进 行 稀 释 , 稀 释 度 以 5 μg/mL 为 中 心 进 行 系 列 2 倍 稀 释 ， 终 浓 度 为 160 μg/mL ，
80 μg/mL,40 μg/mL ，20 μg/mL ，10 μg/mL ，5 μg/mL ， 2.5 μg/mL,1.25 μg/mL ，0.625 μg/mL ，0.3125 μg/mL ，
图3
7）注 入 空 气 ： 向 每 组 2 片 叶 中 的 另 一 片 的 塑 料 袋
内 注 入 空 气 ， 向 “ 装 置 ” 注 入 10 mL 水 替 代 NaOH 溶 液 ）； 重 复 实 验 步 骤 6 （ 或 用 注 射 器 吸 取 空 气 直 接 注 入 ）。
图4 光合作用需要二氧化碳的实验
抑菌圈大小及现象
菌株 大肠杆菌 绿脓杆菌 金黄色葡萄球菌
160 80 40 20 10
+ +
5 2.5 1.25 0.63 0.31 0
40 μL （40 μg/ 纸片 ）。 1.2 1.2.1
方法
18 h 后 观 察 结 果 。 1.2.4
在配制好的
TTC 微 量 稀 释 法
体外抑菌实验方案
体外抑菌实验方案一、实验目的1.探究不同抑菌剂对特定细菌的抑制效果。
2.优化抑菌剂的配方，提高抑菌效率。
3.为临床应用提供理论依据。
二、实验材料1.实验菌株：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等。
2.抑菌剂：酒精、碘伏、过氧化氢等。
3.实验器材：培养皿、移液器、酒精灯、生物安全柜等。
三、实验方法1.菌株活化：将实验菌株从冻存管中取出，接种至斜面培养基，37℃培养24小时。
2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.抑菌剂配制：按照实验设计，配制不同浓度和配比的抑菌剂。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，置于37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
四、实验步骤1.活化菌株：从冰箱取出金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌等菌株，接种至斜面培养基，放入37℃培养箱培养24小时。
2.制备菌液：将活化后的菌株用无菌生理盐水洗涤，调整菌液浓度为10^6CFU/mL。
3.配制抑菌剂：按照实验设计，配制酒精、碘伏、过氧化氢等抑菌剂的不同浓度和配比。
4.抑菌实验：在生物安全柜中，将菌液均匀涂布于培养皿，加入不同抑菌剂，放入37℃培养箱培养24小时。
5.观察结果：观察各培养皿中细菌生长情况，记录抑菌效果。
6.数据处理：统计分析各抑菌剂的抑菌效果，计算抑菌率。
五、实验结果1.不同抑菌剂对金黄色葡萄球菌的抑制效果：酒精浓度为75%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；碘伏浓度为5%时，抑菌率为99.95%。
2.不同抑菌剂对大肠杆菌的抑制效果：过氧化氢浓度为3%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；酒精浓度为75%时，抑菌率为99.90%。
3.不同抑菌剂对白色念珠菌的抑制效果：碘伏浓度为5%时，抑菌效果最佳，抑菌率为99.99%；过氧化氢浓度为3%时，抑菌率为99.95%。
抗菌肽体外抑菌实验方法
微量肉汤稀释法（borth microdilution method）实验方法：1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储备液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液，4 ˚C下保存备用。
2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管中的MH肉汤，37 ˚C，180 r/min过夜培养。
将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 µL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 µLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。
37 ˚C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。
（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以上细菌生长的最小肽浓度。
用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。
4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残余菌落生长的肽的最低浓度。
从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 µL涂布到MH琼脂平板上，37 ˚C培养18 h，以此来确定肽的MBC。
参考文献：【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273.抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同样做6个浓度的稀释1 / 22.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL3.制板：取1 mL指示菌注入培养皿中，倒入灭菌的固体LB培养基摇匀，放冷后制成平板。
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
抗菌肽标准
抗菌肽标准一、前言抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子多肽，它们存在于生物体内，是天然免疫系统的重要组成部分。
抗菌肽以其独特的抗菌机制、高效的抗菌活性和较低的毒性，在医药、农业和食品工业等领域具有广阔的应用前景。
为了规范抗菌肽的研究、开发和应用，特制定本标准。
二、范围本标准规定了抗菌肽的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输和贮存等内容。
本标准适用于抗菌肽原料及其制剂的研发、生产、检验和销售。
三、术语和定义抗菌肽：由生物体产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，具有破坏细菌细胞膜、抑制细菌生长和繁殖等作用。
抗菌活性：抗菌肽对细菌、真菌等微生物的抑制或杀灭作用。
最小抑菌浓度（MIC）：在体外试验中，能够完全抑制细菌生长的最低抗菌肽浓度。
最小杀菌浓度（MBC）：在体外试验中，能够杀灭99.9%以上细菌的最低抗菌肽浓度。
四、技术要求原料要求（1）抗菌肽原料应来源于符合规定的生产菌株或合成途径，无明显毒性、致病性和过敏性。
（2）抗菌肽原料的纯度应不低于95.0%（质量分数），且应无有害杂质。
制剂要求（1）抗菌肽制剂应符合国家相关药品、兽药或农药制剂的规定。
（2）抗菌肽制剂的有效成分含量应符合产品标签或说明书的要求。
（3）抗菌肽制剂的稳定性应满足相应产品的贮存要求。
抗菌活性要求（1）抗菌肽原料及其制剂应具有广谱抗菌活性，对常见细菌、真菌等微生物具有抑制或杀灭作用。
（2）抗菌肽原料及其制剂的MIC和MBC值应符合相关研究或产品要求。
五、试验方法抗菌肽原料纯度的测定采用高效液相色谱法（HPLC）或其他适宜的方法测定抗菌肽原料的纯度。
抗菌肽制剂有效成分含量的测定根据抗菌肽制剂的性质，采用适宜的化学或生物学方法测定有效成分含量。
抗菌活性的测定（1）采用琼脂扩散法、微量肉汤稀释法或其他适宜的方法测定抗菌肽对目标微生物的MIC和MBC值。
（2）根据需要，可采用时间-杀菌曲线法评估抗菌肽的杀菌动力学特性。
一种抗菌肽的体外抑菌试验、安全性评价及其对肠道菌群的影响
１ ／ ８ 、 １ ／ １ ６ 、 １ ／ ３ ２ ， 共 ６个不 同的梯度 ， 其 中金霉 素加 盐酸溶解。 鸡大肠杆菌 ０ ｌ 、 牛大肠杆菌（ Ｍ） 、 猪大肠
杆菌（ Ｅ ） 用液体 Ｌ Ｂ培养基培养 ２ ４ ｈ 后的菌液稀释
至 ≥１ ０ ６ Ｃ Ｆ Ｕ ／ ｍ Ｌ ，取 ｌ ｍ Ｌ注 人 ９ ． Ｏ ｃ ｍ 的培 养 皿 中 ，
【 作者 简介】 李 晓颖 ， 女， （ １ ９ ８ ４ 一 ） ， 硕 士研 究生 ， 主要从事微 生
态制剂的研发 工作． ★为通讯作者
广东饲料 第 ２ ３ 卷第 ２ 期
２ ０ １ ４ 年２ 月
一
种 抗 茵肽 的体外 抑 茵试 验 ＼ 安全 牲 评价及 其 对肠 道菌群 的影 嫡
李晓颖 李凤娟 谷巍 王静 ★
（ 山东宝来利来生物工程股份有 限公 司 ， 山东 泰安 ２ ７ １ ０ ０ ０ ）
【 中图￣ ］ Ｒ ３ ８ ６ 【 文献标识码】 Ａ 【 ５ Ｚ ￣ ］ １ ０ ０ ５ — ８ ６ １ ３ （ ２ ０ １ ４ ） ０ ２ — ０ ０ ２ ５ — ０ ４
抗菌性广谱 、抑菌方式独特不易产生耐药性等特 点， 并对肿 瘤细胞 、 病毒 、 真菌和原虫等有杀 伤作
用， 且不破坏人体的正常细胞 ， 是 目前研究与开发 的热点 。由于抗菌肽作用机制缺乏特异性 ， 且与抗 生素类不易产生交叉耐药性 ， 所以在正常使用量下 不必考虑残 留问题 ， 这一优点扩大了它的使用范围， 使之成为一种替代抗生素的理想饲料添加剂（ Ｓ ｈ ａ ｉ Ｙ， ２ ０ ０ １ ） 。诸多试验表明 ， 抗菌肽通过 电荷改变 、 膜 攻击等方式 ， 破坏病原微生物膜结构 ， 导致病 原微
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称
抑菌试验方法总结用于测定抗菌药物体外抑制细菌生长效力的试验称为抑菌试验。
通过抑菌实验，可以测定一个药物的最低抑菌浓度，用以评价该药物的抑菌性能，这是抗菌药物的最基本的药效学数据。
主要方法有进行定性测定的扩散法（如抑菌斑试验）和进行定量测定的稀释法（如最低抑菌浓度实验）。
1、定性测定（1）纸片扩散法(disk diffusion test)，K-B法：WHO推荐的全球统一的标准方法。
原理：含有定量抗菌货物的纸睡帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内的细菌的生长被抑制，形成透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
质控：标准菌株的抑菌圈直径应落在预期范围内，如果超出该范围，应视为失控而予以纠正。
影响因素：培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响试验结果的准确性。
操作方法：按每1000 ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38 g配备M—H琼脂，按每个平皿(直径9 mm)25 ml进行分装。
将孵育16—24 h的菌种分别接种生理盐水试管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108 CFU／m1)。
用无菌棉签拭蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在M—H琼脂表面，均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。
平板在室温下干燥3—5 min后用无菌镊子将药物纸片紧贴于琼脂表面．置35℃孵育16 18 h。
记录抑菌圈的直径，实验。
重复10次。
主要用于比较不同抗菌物质，或者通过不同方法提取的同一种物质的效果。
（2）打孔法药敏实验：待M—H平板干后，用无菌棉签蘸取菌液(相当于1.0×108CFU／m1)，在培养基平板上密集划线接种。
药物的体外抑菌试验
实验五药物的体外抗菌试验药物的抗菌试验是为了检查药物的抗菌能力.该项试验方法已广泛应用于新药研究和指导临床用药。
如抗菌药物的筛选，提取过程的生物追踪、抗菌谱的测定、耐药谱的测定、药敏试验、药物血浓度测定等各个方面。
药物的体外抗菌试验在实验室进行，优点是方法简便、需时短、用药量少，不需要活的动物、实验条件容易控制.因此,药物的体外抗菌试验已广泛应用各种测定了。
药物的体外抑菌试验是常用抗菌试验方法,其中最常用的方法用系列稀释法和琼脂扩散法。
（一)稀释法(结果示教)稀释法有液体培养基连续稀释法和固体稀释法（斜面法）两种。
这两种方法都可以用来测定药物的最小抑菌浓度（MIC）：是指该药物能抑制细菌生长的最低浓度,通常用μg∕ml或U/ml表示。
（二)琼脂扩散法它是将抗菌药物加至接种试验菌的平板表面，抗菌药物在琼脂胶内向四周自由扩散，其浓度随扩散距离增大而降低，在药物一定的扩散距离内,由于药物的抗菌效应，试验菌不能生长,此无菌生长的范围称为抑菌圈，抑菌圈的大小与药物的抑菌效应成正比。
琼脂扩散法常有纸片法、管碟法、打洞法和挖沟法。
滤纸片法（K-B纸片法）－学生操作滤纸片法是最常用的方法，适用于新药的初筛试验（初步药物是否有抗菌作用）及临床的药敏试验（细菌药物第三性试验、以便选择用药）。
滤纸片分湿、干两种，可以在试验时用无菌纸片沾取药物溶液放在含菌的平板表面，也以预先做成一定浓度的干燥纸片.一般来说预先做成的干燥纸片实用一些而且准确一些。
至于干燥纸片的制备方法:选用吸水力强而且质地均匀的滤纸，用打洞机制成6mm直径的圆纸片，120℃干燥灭菌2小时.然后把配制好的各种适宜浓度的抗生素溶液,每100张纸片加入0。
5ml药液，使它均匀浸润，放在无菌平皿中，37℃，使它干燥，分装小瓶中，封口，4℃保存。
如果是β－内酰胺类抗生素还要放在—20℃保存。
这就制成了干燥的含药液的纸片.一般药敏试验常采用滤纸片法，我们可以根据抑菌圈的大小，来判断菌种对药物的敏感性，是敏感，中度敏感还是耐药.世界卫生组织规定了抗菌药物的敏感性评定标准，在标准实验条件下根据抑菌圈大小来判断.步骤：活化试验菌→涂布试验菌于平板→贴加含药纸片→37度培养24h→观察结果打洞法（结果示教）在含菌琼脂平板上打洞（一般打6个孔,4个小孔加不同浓度标准溶液，另外2个小孔加血清样品,放在37℃，12—18小时，测定其抑菌圈直径。
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微量肉汤稀释法（borth microdilution method）
实验方法：
1.用无菌蒸馏水在聚丙烯离心管中将抗菌肽和抗生素溶解制成1280 g/L的储备
液，然后用等量无菌的0.02%乙酸（含0.4% BSA）稀释，在用0.01%乙酸（含
0.2% BSA）溶液对等量稀释后的溶液在进行一系列的双倍稀释，得到质量浓
度为640，320，160……1.25 mg/L的共10个梯度的系列稀释液，4 ˚C下保存备用。
2.将待测细菌在灭菌MH肉汤琼脂平板上过夜培养，挑取菌落接种于灭菌试管
中的MH肉汤，37 ˚C，180 r/min过夜培养。
将培养后的菌液稀释至2*10^5-7*10^5 CFU/mL，向无菌的96孔平板中的1-11孔各加入100 µL的菌液，12孔不加入菌液而加入100 µLMH肉汤，然后从1～10孔逐一加入相应的待测抗菌肽，11孔作为扫描对照组不加肽。
37 ˚C，90 r/min培养18-24 h，这样待测抗菌肽的终质量浓度分别为64，32，16，……0.125 mg/L。
（不知道待测抗菌肽添加量是多少，最终抗菌肽的终浓度怎么缩小了10倍）
3.最小抑菌浓度MIC（mininmal inhibitory concentration）就是能阻止50%以上
细菌生长的最小肽浓度。
用酶标仪在490 nm下对平板进行扫描，肽的MIC 的确定按照比对照孔（11孔）的浑浊程度低50%以上的最小质量浓度计算。
4.最小杀菌浓度MBC（minimal bactericidal concentration）就是能抑制任何残
余菌落生长的肽的最低浓度。
从没有细菌生长的平板孔中的内容物中取10 µL 涂布到MH琼脂平板上，37 ˚C培养18 h，以此来确定肽的MBC。
参考文献：
【1】汪以真，抗菌肽与抗生素的体外抗菌效果比较[J].中国兽医学报，2004，24（3）：270-273.
抗菌肽的体外抑菌实验（平板法）
1.稀释：将一定效价的抗菌肽做6个浓度的稀释，将抗生素按正常使用剂量同
样做6个浓度的稀释
2.指示菌：指示菌用液体LB培养基培养24 h后稀释至10^6 CFU/mL
3.制板：取1 mL指示菌注入培养皿中，倒入灭菌的固体LB培养基摇匀，放冷
后制成平板。
4.用打孔器打孔法来确定抑菌效果。
参考文献：
李晓营，等.一种抗菌肽的体外抑菌实验、安全性评价及其对肠道菌群的影响[J].广东饲料，2014，23（2）：25-28。