紫花苜蓿基因组测序及分析

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紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定

紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定紫花苜蓿冷胁迫转录组分析及MsMYB144基因的功能鉴定引言紫花苜蓿（Medicago sativa L.）一直以来都是重要的牧草植物，广泛应用于畜牧业。

然而，在低温环境下，紫花苜蓿容易受到冷胁迫的影响，导致其生长和产量受损。

因此，深入研究紫花苜蓿在冷胁迫条件下的应对机制对于提高紫花苜蓿的抗寒性和产量具有重要意义。

方法本研究采用转录组学方法，结合生物信息学技术，对紫花苜蓿在低温条件下的基因表达谱进行了分析。

首先，我们将冷胁迫处理组和对照组中的紫花苜蓿植株分别收集并提取总RNA。

随后，使用Illumina HiSeq 2000测序平台进行RNA测序，获得高质量的测序数据。

将测序数据进行质控和去除低质量序列后，利用SOAPaligner软件将测序reads比对到紫花苜蓿参考基因组上。

最后，根据比对结果，分析不同基因在冷胁迫处理组和对照组中的表达差异。

结果结果显示，冷胁迫处理会导致大量基因的表达发生改变。

与对照组相比，冷胁迫处理组中有许多基因的表达下调，表明冷胁迫对紫花苜蓿的基因表达起到抑制作用。

同时，我们还发现一组特定的基因在冷胁迫条件下表达水平显著上调。

通过功能富集分析发现，这些上调表达的基因主要参与了诸如脱水、离子平衡、ROS清除和抗氧化等生物学过程，这可能是紫花苜蓿抵御冷胁迫的策略之一。

为进一步研究冷胁迫应答机制，我们选取了其中一个上调表达的基因，命名为MsMYB144进行功能鉴定。

首先，我们利用基因家族分析和序列比对的方法对MsMYB144进行了特征分析。

结果显示，MsMYB144属于MYB转录因子家族，具有MYB 结构域，推测其可能参与调控紫花苜蓿的冷胁迫响应过程。

接着，我们利用冷胁迫处理和外源ABA处理来研究模拟冷胁迫条件下MsMYB144的表达变化。

实验结果显示，在冷胁迫和ABA 处理下，MsMYB144的表达水平均显著上调，这进一步证明了MsMYB144可能在紫花苜蓿的冷胁迫响应中发挥重要作用。

全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用

全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用近年来，随着DNA测序技术的飞速发展，全基因组重测序技术越来越广泛应用于各种生物种的基因组研究中。

作为一种重要的草坪植物，紫花苜蓿因其在牧草生产中的重要性而备受关注。

全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中也得到了广泛的应用，并成为推动紫花苜蓿基因组研究进程的重要手段。

一、全基因组重测序技术简介全基因组重测序技术是指对DNA样本进行高通量测序，得到完整的个体基因组序列。

与Sanger测序技术相比，全基因组重测序技术具有高通量、高准确性、高覆盖度和低成本等优点。

其中，高覆盖度是全基因组重测序技术的重要特征。

通过多次测序，可以得到高度重叠的DNA序列，从而消除测序误差，提高数据可靠性。

全基因组重测序技术在遗传疾病研究、生物进化研究、种群遗传学研究等方面发挥了重要作用。

二、全基因组重测序技术在紫花苜蓿基因组研究中的应用1.确定紫花苜蓿基因组组成全基因组重测序技术可以全面揭示紫花苜蓿基因组组成，包括基因数量、长度、可变剪接以及重复序列等特征。

通过这些特征，可以进一步了解紫花苜蓿基因组的基本特征，为进一步研究其基因功能和进化提供基础数据。

2.揭示紫花苜蓿种群遗传学特征全基因组重测序技术可以揭示紫花苜蓿种群遗传学特征，如种群分化、基因流、基因多样性等。

紫花苜蓿广泛分布于全球各地，因而在不同地区的紫花苜蓿种群之间存在不同的遗传结构和遗传差异。

通过全基因组重测序技术，可以比较各种群之间的遗传差异，为紫花苜蓿的种质分类和遗传改良提供依据。

3.挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能全基因组重测序技术可用于挖掘紫花苜蓿基因组特征和功能，并鉴定关键基因。

通过比对序列和功能注释，可以快速鉴定出紫花苜蓿基因组中的基因家族、调控因子、信号传导通路等关键功能元件，从而为紫花苜蓿基因功能研究提供基础数据。

4.开展基因组选择研究全基因组重测序技术可用于开展基因组选择研究，并筛选出重要基因。

通过比较不同种群之间的基因表达差异，可以筛选出与环境适应性和产量性状相关的基因。

紫花苜蓿CAMTA_基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析

第 33 卷第 5 期Vol.33，No.5143-1542024 年 5 月草业学报ACTA PRATACULTURAE SINICA孔海明，宋家兴，杨静，等. 紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析. 草业学报， 2024， 33（5）： 143−154.KONG Hai-ming， SONG Jia-xing， YANG Jing，et al. Identification and transcript profiling of the CAMTA gene family under abiotic stress in alfalfa. Acta Prataculturae Sinica， 2024， 33（5）： 143−154.紫花苜蓿CAMTA基因家族鉴定及其在非生物胁迫下的表达模式分析孔海明1，宋家兴1，杨静1，李倩2，杨培志1，曹玉曼1*（1.西北农林科技大学草业与草原学院，陕西杨凌 712100；2.新疆农业大学草业学院，新疆乌鲁木齐 830052）摘要：钙调蛋白结合转录激活因子（CAMTA）是一类重要的钙调素结合蛋白，在激素信号转导、发育调控和环境胁迫耐受中发挥着重要作用。

本研究采用生物信息学技术，基于紫花苜蓿“新疆大叶”参考基因组，对紫花苜蓿中CAMTA家族成员进行鉴定，并对这些基因的理化性质、系统发育树、保守结构域、染色体上位置、顺式作用元件、转录表达谱进行分析和验证。

结果表明，共鉴定出17个MsCAMTA基因，MsCAMTA家族成员可划分为3个亚家族，亚家族成员在基因结构、保守基序位置上较为相似。

染色体定位结果显示，MsCAMTA家族成员不均匀地分布在7条染色体上。

启动子区具有大量响应低温、盐胁迫及植物激素信号相关的顺式作用元件。

此外，采用RT-qPCR对盐（300 mmol·L-1 NaCl）、模拟干旱（400 mmol·L-1甘露醇）、低温（10 ℃）和脱落酸（100 μmol·L-1）处理下紫花苜蓿叶片中MsCAMTA1、MsCAMTA3、MsCAMTA11和MsCAMTA12的表达模式进行了初步研究。

紫花苜蓿CNGC基因家族成员鉴定及分析

第32卷第2期V o l .32 No .2草地学报A C T A A G R E S T I A S I N I C A2024年 2月F e b . 2024d o i :10.11733/j.i s s n .1007-0435.2024.02.028引用格式:李小红,王晓彤,麻旭霞,等.紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析[J ].草地学报,2024,32(2):588-598L IX i a o -H o n g ,WA N GX i a o -T o n g ,MAX u -X i a ,e t a l .I d e n t i f i c a t i o n a n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i n A lf a l f a [J ].A c t aA gr e s t i aS i n i c a ,2024,32(2):588-598紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析李小红1,王晓彤1,麻旭霞1,蔡文祺1,冯学丽1,马梦凡1,李淑霞1,2,3*(1.宁夏大学林业与草业学院,宁夏银川750021;2.宁夏草牧业工程技术研究中心,宁夏银川750021;3.农业农村部饲草高效生产模式创新重点实验室,宁夏银川750021)收稿日期:2023-09-26;修回日期:2023-11-16基金项目:国家自然科学基金项目(32101426);宁夏自然科学基金项目(2023A A C 05019)资助作者简介:李小红(1996-),男,回族,宁夏固原人,硕士研究生,主要从事牧草抗逆育种研究,E -m a i l :l x h 0895@163.c o m ;*通信作者C o r r e -s p o n d i n g au t h o r ,E -m a i l :l i s h u x i a 620@163.c o m 摘要:环核苷酸门控通道(C N G C )基因家族作为非选择性阳离子通道基因家族之一,在植物信号转导㊁生长发育和环境胁迫等生理过程中发挥着重要作用㊂本研究利用生物信息学手段和转录组数据对紫花苜蓿C N G C 家族成员的进化关系㊁基因结构㊁保守基序㊁顺式作用元件㊁染色体定位㊁共线性关系以及基因表达进行分析㊂结果表明,紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员有16个,在染色体上不均匀分布,存在片段重复,大多数蛋白定位于细胞质膜㊂系统发育树将M s C N G C s 为4个亚家族㊂基因结构和保守基序分析表明,都含有c NM P /C N B D 和I T P 功能域㊂顺式作用元件分析表明,M s C N G C s 基因含有许多与非生物或生物胁迫和激素响应元件㊂M s C N G C 4和M s C N G C 7.2蛋白之间存在互作㊂M s C N G C 基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C 基因对干旱㊁盐和激素等非生物胁迫均有显著的响应,为进一步研究M s C N G C 基因在调控非生物胁迫过程中的潜在功能提供了理论依据㊂关键词:紫花苜蓿;C N G C 基因家族;全基因组;系统进化;基因结构;非生物胁迫中图分类号:S 512.6 文献标识码:A 文章编号:1007-0435(2024)02-0588-11I d e n t i f i c a t i o na n dA n a l y s i s o f C N G C G e n eF a m i l y Me m b e r s i nA lf a l f a L IX i a o -h o ng 1,WA N G X i a o -t o n g 1,MA X u -x i a 1,C A IW e n -qi 1,F E N G X u e -l i 1,MA M e n g-f a n 1,L I S h u -x i a 1,2,3*(1.C o l l e g e o fF o r e s t r y a n dP r a t a c u l t u r e ,N i n g x i aU n i v e r s i t y ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;2.N i n g x i aG r a s s l a n d a n dA n i m a l H u s b a n d r y E n g i n e e r i n g T e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r ,Y i n c h u a n ,N i n g x i a 750021,C h i n a ;3.K e y L a b o r a t o r y fo rM o d e l I n n o v a t i o n i nF o r a g eP r o d u c t i o nE f f i c i e n c y ,M i n i s t r y o fA g r i c u l t u r e a n dR u r a lA f f a i r s ,Y i n c h u a n ,N i n gx i a 750021,C h i n a )A b s t r a c t :T h e c y c l i cn u c l e o t i d e -g a t e dc h a n n e l s (C N G C s )g e n e f a m i l y fu n c t i o n s a so n eo f t h en o n -s e l e c t i v e c a t i o n c h a n n e l g e n e f a m i l i e s a n d p l a y s i m p o r t a n t r o l e s i n p h y s i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h a s p l a n t s i gn a l t r a n s -d u c t i o n ,g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t ,a n d e n v i r o n m e n t a l s t r e s s .I n t h i s s t u d y ,w e a n a l y z e d t h e e v o l u t i o n a r y r e -l a t i o n s h i p ,g e n e s t r u c t u r e ,c o n s e r v e d m o t i f s ,c i s -a c t i n g e l e m e n t s ,c h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o n ,c o l l i n e a r i t y,a n d g e n e e x p r e s s i o n p a t t e r n so f t h e C N G C f a m i l y m e m b e r s i na l f a l f au s i n g b i o i n f o r m a t i c t o o l sa n dt r a n s c r i p-t o m i c d a t a .T h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r e16m e m b e r so f M s C N G C g e n e s f a m i l y ina l f a l f a ,w h i c h w e r eu n e v e n l y d i s t r i b u t e do n c h r o m o s o m e s ,w i t h s e g m e n t a l r e pe a t i o n ,a n dm o s t of p r o t e i n sw e r e l o c a t e d i n t h e p l a s m am e m b r a n e .T h e p h y l o ge n e t i c t r e e d i v i d e dM s C N G C s i n t of o u r s u b f a m i l i e s .G e n e s t r u c t u r e a n d c o n s e r v e dm o t i f a n a l y s i s s h o w e d t h a t c NM P /C N B Da n dI T Pf u n c t i o n a l d o m a i n sw e r e p r e s e n t .C i s -a c t i n ge l e m e n t a n a l y s i s s h o w e d t h a t M s C N G C g e n e s c o n t a i n e dm a n y e l e m e n t s t h a t r e s p o n d e d t o a b i o t i c o r b i o l o g i -c a l s t r e s s e s a n dh o r m o n e s .T h e r ew a s i n t e r a c t i o nb e t w e e n M s C N G C 4a n d M s C N G C 7.2p r o t e i n s .M s C -N G C g e n e s h a dt i s s u es p e c if i c i t y .M s C N G Cg e n e sh a dsi g n i f i c a n t r e s p o n s e t od r o u gh t ,s a l t a n dh o r m o n e s t r e s s ,w h i c h p r o v i d e d a t h e o r e t i c a l b a s i s f o r f u r t h e r r e s e a r c h o n t h e p o t e n t i a l f u n c t i o n o f M s C N G C g e n e s i nt h e r e gu l a t i o no f a b i o t i c s t r e s s .K e y wo r d s :A l f a l f a ;C N G C g e n e s f a m i l y ;G e n o m e -w i d e ;S y s t e m a t i c e v o l u t i o n ;G e n e s t r u c t u r e ;A b i o t i c s t r e s s第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析C a2+作为植物中重要的次级信使,在调控植物的多种信号转导㊁生长发育和非生物胁迫响应中发挥着关键性的作用,如植物的光合作用㊁激素合成㊁生物胁迫和非生物胁迫等[1-4]㊂环核苷酸门控离子通道(C N G C s)蛋白是钙离子传导途径之一,广泛存在于动植物中[5]㊂在植物中,大多数C N G C蛋白位于质膜,部分位于核膜和液泡膜[6-8]㊂C N G C是由六个跨膜(T M)结构域和第五㊁第六T M结构域之间的一个孔隙区域(P)组成,包含C a M B结构域和环核苷酸结合结构域(C N B D)[9-11]㊂C N B D是一个高度保守的区域,包含一个能与钙调蛋白(C a l m o d u-l i n,C a M)结合的磷酸盐结合盒(P B C)和1个铰链区[12-13]㊂环核苷酸单磷酸(3',5'-c AM P和3',5'-c GM P)和C a M可调节C N G C通道的关闭和打开[14]㊂这些结构对研究C N G C提供了重要的信息㊂研究表明,C N G C家族成员可参与植物的各种生理反应,包括种子萌发㊁生殖发育[15]和非生物胁迫(盐胁迫㊁热胁迫)响应等[16,17]㊂目前,已经在大多数植物种鉴定出了C N G C基因,如拟南芥(A r a-b i d o p s i s t h a l i a n a)中鉴定出20个A t C N G C s㊁蒺藜苜蓿(M e d i c a g o t r u n c a t u)中19个M t C N G C s基因㊁赤豆(V i g n a a n g u l a r i s)中18个V a C N G C s基因[35]㊂在拟南芥中,A t C N G C1作为植物发育和抗逆性的调节因子,参与C a2+的吸收[19]㊂A t C N G C18在花粉中表达,A t C N G C18功能的丧失导致花粉管生长缺陷,并导致雄性不育[18]㊂A t C N G C19和A t C N G C20在盐胁迫下表达量显著降低[19]㊂沉默I V b亚族S l C N G C基因显著增强番茄(S o l a n u m l y-c o p e r s i c u m)对真菌病原体P y t h i u ma p h a n i d e r m a-t u m和S o l a n u ml y c o p e r s i c u m的抗性[20]㊂在芒果(M a n g i f e r ai n d i c a)C N G C家族成员中,M i C-N G C13和M i C N G C6可通过调节M D A含量来维持细胞膜完整性,进而积极响应冷胁迫[21]㊂沉默棉花(G o s s y p i u m h i r s u t u m)G h C N G C32和G h C-N G C35基因后,转基因植株的耐盐性降低[22]㊂C N G C基因在植物的各种生物学过程中发挥重要作用㊂因此,鉴定紫花苜蓿(M e d i c a g os a t i v a) C N G C家族成员对紫花苜蓿的抗逆性研究具有重要意义㊂紫花苜蓿是一种优质的多年生豆科牧草,在世界范围内广泛种植,对环境的适应性相对较强,因其营养含量高和适口性好而享有牧草之王的美誉[23,24]㊂然而,一些不利的生物和非生物因素严重制约了苜蓿生产,对苜蓿产量和品质产生了严重的负面影响,进而影响畜牧业的高质量发展㊂本研究利用紫花苜蓿全基因组序列信息㊁拟南芥C N G C家族基因研究信息及生物信息学分析技术对紫花苜蓿中的C N G C基因家族成员进行鉴定和分析,并利用转录组数据分析M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫(冷㊁干旱㊁盐和A B A)下的表达模式,以期为进一步探究M s C N G C 基因的功能提供了理论依据㊂1材料与方法1.1紫花苜蓿C N G C基因家族鉴定从拟南芥数据库(T A I R,h t t p://w w w.a r a b i-d o p s i s.o r g/)中下载拟南芥C N G C家族蛋白的氨基酸序列㊂紫花苜蓿(中苜一号)基因组文件下载自h t t p s://f i g s h a r e.c o m/a r t i c l e s/d a t a s e t/M e d i c a g o_ s a t i v a_g e n o m e_a n d_a n n o t a t i o n_f i l e s/12623960㊂以拟南芥C N G C蛋白为参考序列,利用T B t o o l s中的B L A S T p比对出紫花苜蓿中C N G C s的蛋白,然后,利用c NM P/C N B D(p f a m:P F00027)和I T P(p f a m: P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索,利用C D-H I T(h t t p://w e i z h o n g-l a b.u c s d.e d u/c d-h i t/)软件去除冗余序列㊂再利用I n t e r P r o(h t t p s://w w w.e b i.a c.u k/i n t e r p r o)网站分析预测蛋白的结构域,同时包含一个环核苷酸结合结构域(c NM P/C N B D, P F00027)和一个离子转运蛋白结构域(I T P, P F00520)的蛋白属于紫花苜蓿C N G C基因家族成员,并根据基因在染色体上的位置信息重新命名M s C N G C基因㊂1.2紫花苜蓿C N G C蛋白质理化性质㊁亚细胞定位㊁二级和三级结构预测分析利用在线工具P r o tP a r a m(h t t p s://w e b.e x-p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)预测M s C N G C蛋白质的氨基酸数㊁分子量㊁等电点㊁稳定指数等理化性质㊂利用W o L F P S O R T I I网站(h t t p s://w w w.g e n-s c r i p t.c o m)和S O P MA(h t t p s://n p s a-p r a b i.i b c p.f r)预测M s C N G C蛋白成员的亚细胞定位及二级结构㊂使用在线网站S W I S S-MO D E L(h t t p s:// s w i s s m o d e l.e x p a s y.o r g/)分析M s C N G C蛋白的三级结构㊂1.3紫花苜蓿C N G C基因系统进化树分析利用软件M E G A11对紫花苜蓿16个M s C-985草地学报第32卷N G C,拟南芥20个A t C N G C,蒺藜苜蓿19个M t C-N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白共73个C N G C蛋白序列构建系统进化树㊂进化树构建采用最大似然法(M a x i m u m l i k e l i h o o d e s t i m a t e, M L),步长值(b o o t s t r a p v a l u e s)为1000次,其他参数设置默认㊂1.4紫花苜蓿C N G C基因结构、保守基序和顺式作用元件分析通过T B t o o l s工具对M s C N G C基因家族成员进行内含子-外显子结构分析㊂M E M E(h t t p s:// m e m e-s u i t e.o r g/m e m e/t o o l s/m e m e)用于预测蛋白的保守基序,保守基序数为10,其他参数默认㊂利用P l a n t C A R E(h t t p://b i o i n f o r m a t i c s.p s b.u g e n t.b e/w e b t o o l s/p l a n tc a r e/h t m l/)工具分析启动子序列(基因上游2.0k b)中的顺式作用元件,并利用T B t o o l s工具进行可视化㊂1.5紫花苜蓿C N G C基因染色体定位和共线性分析基于紫花苜蓿全基因文件信息,使用T B t o o l s 软件分析和定位M s C N G C基因的染色体分布㊂从E n s e m b l P l a n t s(h t t p://p l a n t s.e n s e m b l.o r g/i n-d e x.h t m l)网站分别下载拟南芥和蒺藜苜蓿全基因组序列和g f f文件,利用多重共线扫描工具(M C S-c a n X)分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿C N G C基因共线性,并通过T B t o o l s进行可视化㊂用S i m p l e K a/K sC a l c u l a t o r(N G)计算非同义替换率(K a),同义替换率(K s)以及K a/K s比率㊂1.6M s C N G C蛋白互作网络预测蛋白质互作网络预测对功能未知的蛋白有着非常重要的作用㊂我们以模式作物拟南芥已注明功能的蛋白质和16个M s C N G C蛋白为研究对象,通过S T R I N G(h t t p s://c n.s t r i n g-d b.o r g/)在线软件对M s C N G C蛋白进行了预测分析,置信度参数设为0.400,其他参数默认㊂1.7紫花苜蓿M s C N G C基因的组织表达模式和非生物胁迫表达分析从N C B I网站(h t t p s://w w w.n c b i.n l m.n i h.g o v/ s r a/?t e r m)下载紫花苜蓿在不同组织㊁干旱㊁低温㊁A B A以及盐胁迫下的转录组数据(S R P055547㊁S R R7091780~7091794,S R R7160313~7160357),获得M s C N G C基因在不同组织和非生物胁迫下的表达模式,对每个M s C N G C s的F P K M值进行对数归一化,并使用T B t o o l s工具绘制热图㊂2结果与分析2.1紫花苜蓿M s C N G C基因家族成员鉴定及基本理化性质分析为鉴定紫花苜蓿中所有的C N G C家族成员,从T A I R网站上下载了拟南芥C N G C基因家族20个成员的蛋白序列作为参考序列,对紫花苜蓿全基因组进行B L A S T检索,E小于1ˑ10-5㊂同时,将c N M P/C N B D 和I T P(p f a m:P F00027㊁P F00520)的隐马尔可夫模型(HMM)配置文件作为查询,对紫花苜蓿蛋白数据库进行搜索㊂去冗余后,共鉴定出16个包含C N G C功能域的基因,根据它们在染色体上的位置被命名为M s C-N G C1-M s C N G C8.5(表1)[36]㊂M s C N G C蛋白长度为460a a(M s C N G C4.2)~2638a a(M s C N G C3.2),对应的蛋白分子量为52.85~295.52k D a,理论等电点在5.87 ~9.5之间,疏水指数(G R A V Y)为-0.433~0.096㊂M s C N G C s蛋白二级结构分析表明,M s C N G C蛋白的α-螺旋㊁β-链折叠㊁延伸链和无规则卷曲分别为37.66% (M s C N G C8.2)~62.17%(M s C N G C4.2),2.60%(M s C-N G C8.3)~11.02%(M s C N G C8.2),延伸链9.17% (M s C N G C3.2)~22.70%(M s C N G C8.2),25.00% (M s C N G C4.2)~33.65%(M s C N G C8.5)㊂不稳定系数预测表明,M s C N G C2.1/7.1/7.2/8.2蛋白的稳定系数小于40,属于稳定蛋白,其他M s C N G C s的稳定系数大于40,属于不稳定蛋白㊂M s C N G C3.2和M s C N G C8.1蛋白的等电点小于7,属于酸性蛋白,其他14个M s C-N G C蛋白等电点大于7,属于碱性蛋白㊂亚细胞定位预测表明,M s C N G C4.2和M s C N G C8.1蛋白分别位于液泡和叶绿体上,其他14个M s C N G C蛋白定位于质膜上㊂2.2紫花苜蓿M s C N G C蛋白的系统发育分析对紫花苜蓿16个M s C N G C蛋白㊁拟南芥20个A t C N G C蛋白㊁蒺藜苜蓿19个M t C N G C蛋白和赤豆18个V a C N G C蛋白,共73个C N G C蛋白的系统进化分析表明:73个C N G C s蛋白被划分为5个亚家族(Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,ⅣA,ⅣB)(图1)㊂除Ⅲ亚家族不包含M s C N G C蛋白,其他4个亚家族均包含M s C N G C成员,其中Ⅲ㊁ⅣA㊁ⅣB亚家族均包含上述4个物种的C N G C成员,表明C N G C在不同物种间的进化关系是高度保守㊂第Ⅰ亚家族只包含095第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析M s C N G C 2.1,M s C N G C 3.2和M s C N G C 5㊂第Ⅱ亚家族包含有M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5;第ⅣA 亚家族包含M s C N G C 1,M s C N G C 2.2,M s C N G C 3.1,M s C N G C 4.2,M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2;第ⅣB 亚家族包含M s C N G C 4.1,M s C N G C 7.3,M s C -N G C 8.1,M s C N G C 8.2和M s C N G C 8.3㊂表1 紫花苜蓿M s C N G C 基因家族成员信息T a b l e 1 I n f o r m a t i o no f M s C N G C g e n e f a m i l y me m b e r s i na lf a l f a 基因名称G e n en a m e基因号G e n e I D蛋白质长度P r o t e i nL e n g t h /a a 蛋白质分子质量P r o t e i n MW /k D a稳定系数I n s t a b i l i t yi n d e x 等电点p IV a l u e 疏水指数G R A V Y α-螺旋α-H e l i x /%延伸链E x t e n d e d S t r a n d/%β-折叠B e t at u r n /%无规则卷曲R a n d o m c o i l /%亚细胞定位S u b c e l l u l a rL o c a l i z a t i o nM s M s C N G C 1M s G 0180003547.01.T 01977111.1648.618.21-0.20145.9614.025.1234.90p l a s M s M s C N G C 2.1M s G 028*******.01.T 011189136.2036.658.120.09642.1418.597.9931.29p l a s M s M s C N G C 2.2M s G 028*******.01.T 0171282.1946.389.2-0.14252.8811.672.9532.49p l a s M s M s C N G C 3.1M s G 0380016434.01.T 0167978.4945.729.21-0.17754.7911.193.0930.93p l a s M s M s C N G C 3.2M s G 0380017485.01.T 012638295.5248.235.87-0.23753.079.175.1232.64p l a s M s M s C N G C 4.1M s G 0480018204.01.T 0174486.1557.849.2-0.25752.5511.833.3632.26p l a s M s M s C N G C 4.2M s G 0480020782.01.T 0146052.8547.909.260.01062.1710.222.6125.00v a c u M s M s C N G C 5M s G 0580028912.01.T 0160070.0841.428.16-0.08052.1716.005.3326.50p l a s M s M s C N G C 7.1M s G 0780037654.01.T 0167978.5139.828.96-0.11952.2812.962.8031.66p l a s M s M s C N G C 7.2M s G 0780037699.01.T 0167978.5139.828.96-0.12054.9311.782.9530.34p l a s M s M s C N G C 7.3M s G 0780041753.01.T 0173284.2547.719.5-0.15852.1112.963.4131.51p l a s M s M s C N G C 8.1M s G 0880041836.01.T 0146553.7959.956.81-0.43356.5610.113.2330.11c h l o M s M s C N G C 8.2M s G 0880043019.01.T 0176286.8339.879.48-0.16337.6622.7011.0228.61p l a s M s M s C N G C 8.3M s G 0880043020.01.T 0165475.5941.238.92-0.07154.1312.542.6030.73p l a s M s M s C N G C 8.4M s G 0880044538.01.T 0154963.8750.139.13-0.27455.1910.753.2830.78p l a s M s M s C N G C 8.5M s G 0817*******.01.T 0162472.3750.679.07-0.21952.7210.742.8833.65pl a s 注:pl a s ,代表细胞质膜;v a c u ,代表液泡膜;c h l o ,代表叶绿体N o t e :p l a s s t a n d s f o r c e l l p l a s m am e m b r a n e ;v a c us t a n d s f o r v a c u o l a rm e m b r a n e ;c h l os t a n d s f o rC h l o r o pl a st 图1 紫花苜蓿㊁拟南芥㊁蒺藜苜蓿和赤豆C N G C 蛋白的系统进化分析F i g .1 P h y l o g e n e t i c t r e e o fC NG C p r o t e i n s f r o m M .s a t i v a ,A .t h a l i a n a ,M .t r u n c a t u l a a n d V .a n gu l a r i s 注:图中红色圆圈㊁绿色圆圈㊁黄色圆圈和蓝色色圆圈分别代紫花苜蓿㊁拟南芥㊁赤豆㊁蒺藜苜蓿N o t e :I n t h e f i g u r e ,t h e r e d c i r c l e ,t h e g r e e n c i r c l e ,t h e y e l l o wc i r c l e a n d t h e b l u e c i r c l e r e p r e s e n t a l f a l f a ,A r a b i d o p s i s ,V .a n gu l a r i s a n d M .t r u n -c a t u l a r e s p e c t i v e l y195草地学报第32卷2.3紫花苜蓿M s C N G C基因家族保守基序和基因结构分析为进一步探究M s C N G C基因的进化过程,我们首先对M s C N G C s蛋白构建系统进化树,M s C N G C s 蛋白被划分成3个亚家族(图2A)㊂对M s C N G C基因家族成员的保守基序和基因结构进行了分析,结果表明,M s C N G C蛋白中共预测到了10个基序(M o t i f1 ~M o t i f10)(图2B),其中大多数M s C N G C蛋白含有10个m o t i f㊂根据紫花苜蓿与拟南芥的进化关系,我们发现在第Ⅰ亚家族中M s C N G C3.1/7.1/7.2含有相同的m o t i f;第Ⅱ亚家族中的M s C N G C2.2具有与第Ⅰ亚家族基因相同的m o t i f结构;而第Ⅲ亚家族包含的M s C N G C1和M s C N G C4.2m o t i f数量和种类并不相同,其中M s C N G C1比M s C N G C4.2多3个m o t i f;第Ⅳ亚家族中的M s C N G C蛋白(M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2,M s C N G C4.1,M s C N G C5和M s C N G C8.1)包含4~7个m o t i f,其中M s C N G C2.1㊁M s C N G C3.2和M s C N G C5含有4个m o t i f,M s C N G C4.1和M s C-N G C8.1含有7个m o t i f;第Ⅴ亚家族中3个M s C N G C 蛋白(M s C N G C7.3,M s C N G C8.2和M s C N G C8.3)含有8~10个m o t i f,M s C N G C8.2不包含m o t i f7㊂此外,m o t i f2在所有成员中都存在,M s C N G C2.1,M s C-N G C3.2和M s C N G C5不包含m o t i f3和m o t i f5㊂基因结构分析表明,M s C N G C基因内含子/外显子的数量分别为4~45个㊁5~46个不等(图2C)㊂6个基因(M s C N G C2.2,M s C N G C3.1,M s C N G C4.2, M s C N G C7.1,M s C N G C7.2和M s C N G C8.1)含4~5个内含子;4个基因(M s C N G C7.3,M s C N G C8.3, M s C N G C8.4和M s C N G C8.5)包含6~7内含子;2个基因(M s C N G C1,M s C N G C8.2)含有9~10个内含子;3个基因(M s C N G C5,M s C N G C2.1和M s C N G C3.2)含11~45个内含子㊂特别地,M s C N G C3.2基因含有的内含子和外显子数是该家族中最多的,分别是45和46个㊂另外,M s C N G C家族成员U T R的分布也是不均匀的,其数量在0~4个,其中6个基因(M s C N G C3.1,M s C N G C3.2,M s C N G C4.2,M s C-N G C7.3,M s C N G C8.1和M s C N G C8.3)的序列没有预测到U T R区㊂图2紫花苜蓿M s C N G C基因保守结构域、基序及基因结构分析F i g.2 A n a l y s i s o f g e n e c o n s e r v e dd o m a i n,m o t i f a n d g e n e s t r u c t u r e o f a l f a l f a M s C NG C注:(A)M s C N G C基因家族系统发育树㊂(B)M s C N G C蛋白的基序㊂不同的图案用不同颜色的矩形标注,编号1-10㊂(C)M s C N G C基因的外显子-内含子结构㊂非编码区(U T R)是用绿色方框表示㊂黄框表示外显子,灰线表示内含子㊂(D)基序的蛋白N o t e:(A)M s C N G C g e n e f a m i l yp h y l o g e n e t i c t r e e.(B)M o t i f o fM s C N G C p r o t e i n.D i f f e r e n t p a t t e r n s a r em a r k e dw i t hr e c t a n g l e so f d i f f e r e n t c o l o r s,n u m b e r e d1-10.(C)E x o n-i n t r o n s t r u c t u r e o f M s C N G C g e n e.N o n-c o d i n g r e g i o n(U T R).I t i s r e p r e s e n t e db y a g r e e nb o x.T h e y e l l o w b o x s h o w s e x o n s,a n d t h e g r a y l i n e s h o w s i n t r o n s.(D)P r o t e i no f t h em o t i f2.4紫花苜蓿C N G C基因启动子顺式作用元件分析为了进一步了解M s C N G C家族成员顺式作用元件的分布,利用P l a n t C A R E在线工具分析顺式作用元件㊂结果表明,16个M s C N G C基因启动子区共检测到170个响应元件,但不同基因含有的响应元件数量和种类不尽相同㊂M s C N G C基因启动子中与植物激素相关的顺式作用元件有5类,包括与295第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析脱落酸(A B A)㊁生长激素(I A A)㊁茉莉酸(J A)㊁赤霉素(G A)和水杨酸(S A)相关的元件;参与环境刺激的顺式作用元件包括3类,分别为低温响应㊁干旱和防御/应激响应元件;此外,还有与昼夜节律和光响应相关的元件(图3)㊂M s C N G C家族基因均含有与激素响应元件,例如,M s C N G C2.2/7.2/8.3/ 8.4/8.5包含生长素响应(T G A-e l e m e n t)元件; M s C N G C2.1/3.1/4.1/5/7.2/7.3/8.1基因包含参与水杨酸响应(T C A-e l e m e n t)元件;M s C-N G C2.1/4.1/4.2/5/7.1/7.2/7.3/8.1/8.2基因包含参与脱落酸(A B R E)作用元件;M s C-N G C7.2/8.3/8.4/8.5基因包含参与赤霉素响应(P b o x㊁T A T C-b o x)的顺式作用元件;M s C N G C1/ 2.2/3.1/3.2/5/7.2/8.1/8.2/8.3/8.4/8.5包含参与茉莉酸响应(T G A C G-m o t i f)元件㊂胁迫响应元件也广泛存在于M s C N G C基因家族中,例如, M s C N G C2.2㊁M s C N G C4.1㊁M s C N G C4.2和M s C-N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件;M s C N G C1/ 2.2/3.2/8.5基因包含参与防御和应激反应(T C-r i c hr e p e a t s)元件;M s C N G C1/3.2/4.1/5/7.3/ 8.1/8.4包含光响应(G-b o x㊁I-b o x)元件,M s C-N G C2.1/7.2/8.3包含低温响应(L T R)元件㊂此外,M s C N G C1/3.1/4.2/7.2/8.1还包含参与昼夜节律调控相关(C i r c a d i a n)作用元件(图3)㊂图3M s C N G C基因启动子区顺式作用元件分析F i g.3 D i s t r i b u t i o no f c i s-a c t i n g e l e m e n t s i n t h e p r o m o t e r r e g i o no f M s C NG C g e n e s i na l f a l f a 注:顺式作用元件由不同颜色的矩形表示N o t e:T h e c i s-e l e m e n t s a r e r e p r e s e n t e db y r e c t a n g l e s o f d i f f e r e n t c o l o r s2.5紫花苜蓿M s C N G C基因染色体定位、基因重复及共线性分析对紫花苜蓿C N G C家族基因进行染色体定位分析发现,16个M s C N G C s基因不均匀的分布在c h r1㊁c h r2㊁c h r3㊁c h r4㊁c h r5㊁c h r7和c h r8上(图4A)㊂其中,c h r1和c h r5上各包含1个M s C N G C 基因,c h r2㊁c h r3和c h r4上各包含2个M s C N G C s 基因,c h r7上各包含3个M s C N G C s基因,c h r8上各包含5个M s C N G C s基因㊂共线性分析表明:紫花苜蓿C N G C家族内的M s C N G C1/M s C N G C4.2, M s C N G C7.3/M s C N G C8.2之间存在共线性关系(图4A),属于节段重复,K a/K s小于1,说明他们之间在进化过程中经历了纯化选择(表2)㊂进一步分析紫花苜蓿与拟南芥和蒺藜苜蓿之间C N G C基因的共线性发现,不同物种间也存在共线性关系,但紫花苜蓿与蒺藜苜蓿之间在相同染色体上的共线性较多,说明紫花苜蓿与蒺藜苜蓿都是豆科植物,所以其亲缘性更高(图5B)㊂395草地学报第32卷图4M s C N G C基因的染色体分布及共线性分析F i g.4 C h r o m o s o m e d i s t r i b u t i o na n d c o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f M s C NG C g e n e s注:(A)紫花苜蓿C N G C基因在染色体定位和染色体间关系㊂黑线线表示M s C N G C共线性基因㊂(B)苜蓿㊁苜蓿和拟南芥中C N G C基因的共线性分析㊂背景中的灰线代表紫花苜蓿和拟南芥/蒺藜苜蓿的共线块,蓝线代表共线C N G C基因对N o t e:(A)C h r o m o s o m e l o c a l i z a t i o na n d i n t e r c h r o m o s o m e r e l a t i o n s h i p o f C N G C g e n e i na l f a l f a.T h e b l a c k l i n e r e p r e s e n t s t h e M s C N G C c o l l i n e a r g e n e s.(B)C o l l i n e a r i t y a n a l y s i s o f C N G C g e n e s i n a l f a l f a,a l f a l f a a n dA r a b i d o p s i s.T h e g r a y l i n e s i n t h e b a c k g r o u n d r e p r e s e n t t h e c o l l i n e a r b l o c k s o f a l f a l f a a n d A r a b i d o p s i s/M.t r u n c a t u l a,a n d t h eb l u e l i n e s r e p r e s e n t c o l l i n e a r C N G C g e n e p a i r s表2M s C N G C基因复制事件T a b l e2M s C N G C g e n e r e p l i c a t i o ne v e n t s基因1/基因2G e n e1/G e n e2K a K s K a/K s D u l p l i c a t e d e d a t e(M y a)重复日期D u l p l i c a t e t y p e重复类型M s C N G C1/M s C N G C4.20.2642.0990.126172.083节段重复M s C N G C7.3/M s C N G C8.20.2120.7670.27662.915节段重复注:对于每个基因对,基于每个位点每年6.1ˑ10-9次替换的速率,将k值转换成以百万年为单位的分化时间㊂重复时间(T)计算为T= K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y aN o t e:F o r e a c h g e n e p a i r,t h eK s v a l u e i s t r a n s l a t e d i n t o d i v e r g e n c e t i m e i nm i l l i o n s o f y e a r s b a s e do n a r a t e o f6.1ˑ10-9s u b s t i t u t i o n s p e r s i t e p e r y e a r.T h e d i v e r g e n c e t i m e(T)i s c a l c u l a t e d a sT=K s/(2ˑ6.1ˑ10-9)ˑ10-6M y a2.6M s C N G C蛋白互作网络预测分析为了提供更多关于M s C N G C功能的线索,我们利用S T R I N G在线软件基于拟南芥C N G C蛋白的相互作用预测了该家族成员的蛋白质相互作用网络㊂构建蛋白质相互作用网络(图5)㊂M s C N G C 蛋白中有6个C N G C蛋白存在互作现象㊂其中M s C N G C7.2与M s C N G C4之间存在蛋白互作,其他M s C N G C蛋白之间不存在互作现象㊂M s C-N G C2.1和M s C N G C5共有的互作蛋白有钙调蛋白(C a l c i n e u r i nB-l i k e1,C B L1㊁C a l c i n e u r i nB-l i k e4,C B L4)㊁与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n-t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e24,C I P K24)㊁钠/氢交换蛋白(N a+/H+E x c h a n g e r7,N H X7)和参与真核生物前转录R N A剪接和R N A延伸的蛋白质(P r e-t R N A S p l i c i n g F a c t o ra n d R N A E l o n g a t i o n F a c-t o r,P O T5)㊂M s C N G C2.1还与C B L蛋白相互作用的植物激酶(C B L-I n t e r a c t i n g P r o t e i n K i n a s e6, C I P K6)和氢离子A T P酶(A r a b i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e1,A H A1)这2个蛋白之间存在互作㊂M s C N G C2.2与植物受体样激酶(P s e u d o m o n a s s y-495第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C 基因家族成员鉴定及分析r i n ga e p v .t o m a t o D C 3000s t r e s sk i n a s er e c e p t o r 1,P S K R 1)和氢离子A T P 酶(A r ab i d o p s i s t h a l i a n a H ʃA T P a s e 1,AH A 1)之间存在互作㊂M s C -N G C 8.3只和参与真核生物前转录R N A 剪接和R N A 延伸的蛋白质(P r e -t R N AS p l ic i n g Fa c t o r a n d R N A E l o n g a t i o nF a c t o r ,P O T 5)互作㊂M s C N G C 5还与C B L 蛋白相互作用的植物激酶(C B L -I n t e r a c -t i n g Pr o t e i nK i n a s e 10,C I P K 10)之间存在互作㊂此外,M s C N G C 7.2与钙依赖性蛋白激酶(C a l c i u m -d e -pe n d e n t p r o t e i nk i n a s e 32,C P K 32)存在互作㊂图5 紫花苜蓿M s C N G C 蛋白与拟南芥同源基因对的蛋白-蛋白互作网络预测模型F i g .5 P r e d i c t i o nm o d e l o f p r o t e i n -p r o t e i n i n t e r a c t i o n n e t w o r kb e t w e e n M s C N G C p r o t e i n s o f a l f a l f a a n dA r a b i d o ps i s h o m o l o g o u s g e n e p a i r s 2.7 紫花苜蓿M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式分析分析了M s C N G C 基因在紫花苜蓿不同组织中的表达模式,M s C N G C 基因具有组织表达特异性(图6)㊂M s C N G C 4.1和M s C N G C 8.1在各个组织中都具有相同的表达水平㊂M s C N G C 1在根瘤组织中不表达;M s C N G C 7.2在花组织中不表达;M s C -N G C 8.4在根组织中不表达;M s C N G C 4.2和M s C N G C 5的表达模式相似,只在花中表达;M s C -N G C 3.1仅在叶中表达;M s C N G C 8.5主要在伸长茎中表达;M s C N G C 8.2基因在伸长茎和短茎组织中均有较高的表达水平,尤其在伸长茎中表达量最高;M s C N G C 7.1在根瘤和根中高表达;M s C -N G C 2.1和M s C N G C 8.4在地上组织中的表达量要显著的高于地下组织,表明M s C N G C s 基因在调节紫花苜蓿生长发育过程中发挥不同的作用㊂图6 M s C N G C 基因在不同组织中的表达模式F i g u r e 6E x pr e s s i o no f M s C N G C g e n e s i nd i f f e r e n t t i s s u e s 注:热图中的数值代表基因的表达量,下同N o t e :T h e v a l u e s i nt h eh e a tm a p r e pr e s e n t t h ea m o u n to f g e n ee x -pr e s s i o n ,t h e s a m e a s b e l o w 2.8 紫花苜蓿M s C N G C 基因在非生物胁迫下的表达模式分析为进一步研究M s C N G C 基因家族对非生物胁迫的响应,利用紫花苜蓿转录组数据分析了M s C N G C s 基因在低温㊁盐㊁干旱和A B A 处理下的表达模式(图7)㊂在低温处理下,M s C N G C 2.2㊁M s C N G C 5㊁M s C -N G C 8.4㊁M s C N G C 8.5的表达量在2h 后与0h 相比明显上调(图7A );M s C N G C 7.1和M s C N G C 7.2的表达趋势一致㊂在盐处理下,M s C N G C s 基因的表达量随着盐处理时间的延长表现出不同程度的下调现象,如M s C N G C 2.2和M s C N G C 5的表达量显著降低(图7B )㊂在干旱处理下,随着处理时间的增加,M s C -N G C 3.2㊁M s C N G C 5和M s C N G C 8.5基因的表达量不断升高(图7C )㊂在A B A 处理下,M s C N G C 2.2的表达量随胁迫时间的延长而降低;M s C N G C 5在3h 表达量明显下调,随处理时间的延长又逐渐升高;M s C N G C 4.2㊁M s C N G C 8.4和M s C N G C 8.5在A B A处理下表达趋势相似,在处理1h 后表达量显著下调㊂M s C N G C 1和M s C N G C 3.1在A B A 处理下的表达量不变(图7D )㊂595草地学报第32卷图7M s C N G C基因在非生物胁迫下的表达模式分析F i g.7 E x p r e s s i o no f M s C NG C s g e n eu n d e r a b i o t i c s t r e s s注:图7C中M代表甘露醇㊂(A)低温处理;(B)盐处理;(C)干旱处理;(D)A B A处理N o t e:I n t h e f i g u r e7C,Ms t a n d s f o rm a n n i t o l.(A)C o l d t r e a t m e n t;(B)S a l t t r e a t m e n t;(C)M a n n i t o l t r e a t m e n t;(D)A B At r e a t m e n t3讨论紫花苜蓿作为最重要的豆科牧草之一,是畜牧业持续健康发展的重要物质基础,因此,研究紫花苜蓿对非生物胁迫的响应是至关重要的㊂C N G C作为一种非选择性的阳离子通道,对C a2+和K+具有渗透性,并已被证实参与植物的生长发育和对各种环境胁迫的响应[24]㊂本研究利用生物信息学方法从在紫花苜蓿全基因组中初步鉴定到了16个C N G C基因,而拟南芥和玉米中分别有20,12个C N G C基因,与M s C N G C基因的数量不同,说明在不同物种间C N G C基因的数量存在差异㊂亚细胞定位预测分析表明,大多数M s C N G C蛋白定位于细胞膜,与拟南芥C N G C基因的亚细胞定位相似[10],推测C N G C蛋白主要在细胞膜上发挥功能㊂物种间的系统发育关系是生物学研究的基础㊂紫花苜蓿和拟南芥中C N G C蛋白的系统发育关系发现,紫花苜蓿和拟南芥的C N G C蛋白被划分为4个亚家族(图1),并且在第Ⅱ和第Ⅳ亚家族中紫花苜蓿与蒺藜苜蓿的C N G C蛋白被划分到同一分支,表明紫花苜蓿和蒺藜苜蓿有较高的亲缘性㊂基因的功能域是调控顺式作用元件活性和基因表达的重要因素㊂拟南芥[10]㊁玉米[27]㊁小麦[29]的C N G C蛋白都含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,能促进阳离子运输[25]㊂而M s C N G C蛋白成员也含有典型的c N M P/C N B D和I T P功能域,表明M s C-N G C蛋白可能也具有运输阳离子功能㊂外显子和内含子的结构影响基因的表达和蛋白质的功能,意味着外显子和内含子使基因在生物体中发挥重要作用,从而维持生命[26]㊂内含子和外显子分析发现,M s C-N G C基因家族成员的内含子数目分别是4~45不等㊂虽然部分基因外显子/内含子结构相似,但序列长度不同(图2),这与其他植物的外显子/内含子结构相似,如玉米[27]㊁水稻[28]㊁小麦[29]等,说明C N G C家族695第2期李小红等:紫花苜蓿C N G C基因家族成员鉴定及分析基因的结构相对复杂㊂基因启动子区域内的顺式作用元件在基因表达调控中起着至关重要的作用,基因启动子中不同类型的顺式作用元件预示着该基因在应对不同胁迫时可能具有不同的功能[30]㊂对启动子顺式作用元件分析发现,M s C N G C s的启动子中包含大量的植物激素(A B A,I A A,J A,G A)响应元件㊁光响应元件和胁迫(光照,低温,干旱)响应元件(图3),表明M s C N G C基因可能参与调控胁迫响应及植物激素信号转导㊂例如,M s C N G C2.2,M s C N G C4.1,M s C-N G C4.2和M s C N G C7.3基因含有干旱响应(M B S)元件,表明它们可能在干旱胁迫下具有活性㊂M s C-N G C7.2和M s C N G C8.3基因具有多个激素应答元件,它们可能在植物的激素应答和各种生理代谢过程的调控中发挥作用㊂M s C N G C基因分布在紫花苜蓿的7条染色体上,第6号染色体上没有M s C N G C基因,因此, M s C N G C的分布是不均匀,与玉米㊁水稻C N G C基因在染色体上的分布相似[26,28]㊂基因复制是基因组进化和物种遗传最重要的驱动力之一[31]㊂植物中基因家族扩增的两个主要原因是节段重复和串联重复㊂基因复制不仅可以为基因家族增加新成员,还可以丰富基因家族的功能,极大地促进了各种生物的遗传进化[32]㊂在本研究中,M s C N G C基因家族中存在2对节段重复事件(M s C N G C1/M s C-N G C4.2,M s C N G C7.3/M s C N G C8.2)(图4A),表明他们可能在功能上具有相似性㊂M s C N G C s基因与蒺藜苜蓿之间存在共线性关系,可能由于其是同科植物和亲缘关系较近,也表明它们可能具有相似的功能,这需要进一步的研究㊂M s C N G C与拟南芥存在共线性,为预测M s C N G C基因的表达和蛋白的功能提供了依据㊂进一步蛋白质相互作用网络预测发现,M s C N G C4与M s C N G C7.2之间存在蛋白互作,同时M s C N G C蛋白还与C B L,C I P K,NH X7, P O T5和C P K32蛋白之间存在互作关系㊂这些结果为深入研究M s C N G C蛋白的潜在功能提拱了依据㊂组织表达分析表明,第ⅣB亚家族中M s C-N G C4.1和M s C N G C8.1的组织表达一致,可能与它们的亲缘性较高有关(图1)㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性,例如,M s C N G C4.2和M s C-N G C5基因只在花中表达,M s C N G C3.1基因只在叶中表达,说明M s C N G C s在各个组织中发挥着不同的作用㊂类似的,Z m C N G C5在玉米花粉中的特异性表达高于其他组织,Z m C N G C10㊁Z m C N G C11和Z m C N G C12在玉米胚中的表达量都相对较高[27],说明这些基因在玉米的花粉和胚的生长发育中起着至关重要的作用㊂C N G C家族基因参与了非生物胁迫响应过程[13,16,21]㊂转录组数据分析表明,大多数M s C N G C基因在冷㊁盐㊁干旱和A B A胁迫下表达量下降,有少数M s C N G C基因的表达量上升㊂如M s C N G C2.2㊁M s C-N G C5㊁M s C N G C8.4㊁M s C N G C8.5受冷胁迫诱导下在2h显著上调表达,该结果与R c C N G C14和部分油菜籽C N G C s在冷诱导下的表达模式相同[13];第Ⅲ亚家族中M s C N G C7.1和M s C N G C7.2在冷胁迫诱导下的表达水平一致,这与它们可能在进化关系上的亲缘性较高有关(图2A)㊂在盐处理下M s C N G C2.2与拟南芥中的A t C N G C19和A t C N G C20的表达水平类似[19],它们可能参与了植物对盐胁迫时的生理调控㊂M s C N G C5㊁M s C N G C8.5与P t r C N G C15.2㊁P t r C N G C15.3在干旱胁迫下的表达相似[12]㊂研究发现沉默S l C N G C15基因的表达可提高番茄耐旱性,为进一步研究M s C N G C基因在非生物胁迫下的功能提供依据[33-35]㊂4结论本研究对紫花苜蓿的C N G C家族成员进行了鉴定分析,从紫花苜蓿参考基因组中共鉴定出16个M s C N G C基因,并对其蛋白分子特征㊁进化关系㊁保守基序㊁基因结构㊁重复事件㊁共线性关系㊁顺式作用元件和表达模式进行了研究㊂M s C N G C基因被划分为4个亚家族,所有成员均含有c N M P/C N B D和I T P功能域㊂M s C N G C基因家族内存节段重复事件,紫花苜蓿与蒺藜苜蓿和拟南芥之间存在物种间共线性关系㊂M s C N G C基因的启动子区含有大量与非生物应激和激素响应相关的顺式作用元件㊂M s C N G C基因具有组织表达特异性㊂M s C N G C基因参与调控紫花苜蓿的冷㊁干旱㊁盐和A B A等非生物胁迫响应过程,其中,M s C N G C3.2,M s C N G C5和M s C N G C8.5能是调控紫花苜蓿耐干旱的关键差异基因㊂参考文献[1] WU M,L IY,C H E ND,L I U H,e t a l.G e n o m e-w i d e i d e n t i f i c a-t i o na n de x p r e s s i o na n a l y s i so f t h e I Q D g e n e f a m i l y i n m o s ob a m b o o(P h y l l o s t ac h y s ed u l i s)[J].S c ie n t if i cR e p o r t s,2016,(6):24520[2] S A A N D M A,X U YP,MU N Y AM P U N D UJ P,e t a l.P h y l o g-e n y a n de v o l u t i o nof p l a n t c y c l i cn u c l e o t i d e-g a t e d i o nch a n n e l(C N G C)g e n e f a m i l y a n d f u n c t i o 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紫花苜蓿几丁质酶ClassⅠ基因cDNA全长克隆及序列分析

关键词：紫花苜蓿；丁质酶基因；ＤＡ克隆；列分析几ｃＮ序
中图分类号：Ｑ８７５文献标志码：Ａ文章编号：０２—１０（０１００２０１０３２２１２— ０９— ５Ｊ
苜蓿根腐性病害是由土传病原菌侵染导致的根腐、茎基
江苏农业科学
２１年第３０１９卷第２期
一２９一
伊亚莉，关宁，文娟，．紫花苜蓿几丁质酶ＣａｓＩ基因ｃＮ张等ｌｓＤＡ全长克隆及序列分析［］Ｊ．江苏农业科学，０１３（）２３２１，９２：９— ４
腐病害，一种世界性病害，遍发生在各个苜蓿栽培地是普区。。根腐病对紫花苜蓿生长的各个时期均可造成严重危害，致根的中柱腐烂，茎和根中部变空，枝数减少，根导根分侧大量腐烂死亡，固氮能力降低，命和利用年限明显缩短，寿草产量和品质下降。基于上述原因，蓿根腐病的研究已得苜
用更为突出。几丁质酶是降解几丁质的糖苷酶，于在大部由分真菌的细胞壁中含有几丁质，植物中虽不含几丁质，却而但有几丁质酶，认为几丁质酶在植物抗病尤其是抗真菌性病故害中起着作用。它在单子叶和双子叶植物中均可分泌，分布在胚、子、叶、种子叶片、、、、伤组织中，常情况下茎根花愈正植物体内的几丁质酶含量较低。在受到外界因素诱导下，几丁质酶基因大量表达，丁质酶迅速积累。生物和非生物因几素均可诱导植物几丁质酶的产生，生物因素如真菌、细菌、病毒、病毒等；生物因素如机械损伤、伤、类非虫乙烯、杨酸、水紫外光、金属盐等重。几丁质酶的分子质量约为２～５３ｕ多数以单体形式存在，有较高或较低的等电点，５ｋ，具最适

紫花苜蓿多元杂交后代表型多样性分析与选择研究

紫花苜蓿多元杂交后代表型多样性分析与选择研究紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种重要的牧草和土壤改良植物，具有广泛的分布和应用价值。

为了获得更好的牧草品种，我们进行了紫花苜蓿的多元杂交和后代选育工作。

本文旨在通过对紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性进行分析和选择研究，为优良牧草品种的育种提供科学依据。

首先，我们利用不同优良紫花苜蓿品种杂交，获得了一个庞大的后代种群。

这些后代植株主要表现出了各种不同的形态特征，包括植株高度、叶片形状、开花期等。

通过对这些表型特征的详细观察和记录，我们发现了很多变异现象，为选择进一步研究的优良个体提供了依据。

接下来，我们对这些表型变异的后代进行了统计分析，并建立了一个表型指标体系。

我们测量了每个个体的表型特征值，并计算了各个特征之间的相关性。

结果显示，不同表型特征之间存在一定的相关性，并且某些特征可能是多基因控制的。

基于这些结果，我们可以进一步选择具有优良表型特征的个体进行进一步研究和选育。

在选择方面，我们采用了综合评价指数法。

根据上述建立的表型指标体系，我们分别计算了每个个体的综合评价指数，并根据指数高低进行排序。

通过对不同指数的比较，我们可以选择出具有优良表型特征的个体，并将其作为下一代育种工作的目标。

最后，我们对选出的个体进行了进一步的观察和实验证明。

我们通过对这些个体进行形态分析、遗传分析和耐逆性测试等方面的研究，验证了它们的优良性。

同时，我们也发现了一些新的表型特征，并对其进行了遗传基础和应用前景的初步讨论。

综上所述，通过对紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性进行分析和选择研究，我们获得了一批具有优良表型特征的个体，并为进一步的育种工作提供了科学依据。

这些研究成果对于改良紫花苜蓿的品质和产量，促进畜牧业的发展具有重要的意义。

在未来的研究中，我们将深入探究紫花苜蓿的遗传基础和形态调控机制，并结合育种实践，进一步提高紫花苜蓿的综合性状和适应性，以满足不同地区和用途的需求综合以上研究结果，我们成功地分析了紫花苜蓿多元杂交后代的表型多样性，并选出了一批具有优良表型特征的个体。

紫花苜蓿生长相关基因的筛选及验证

紫花苜蓿生长相关基因的筛选及验证紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是一种广泛应用于畜牧业和土壤改良的多年生草本植物，其具有高产量、优质和耐逆性等特点。

为了深入理解紫花苜蓿的生长发育机理，进行相关基因的筛选和验证对提高种植效益具有重要意义。

本研究旨在通过转录组学和生物信息学方法，对紫花苜蓿生长相关基因进行筛选，并进一步通过实验验证其功能。

该研究采集来自不同生长阶段和组织的紫花苜蓿样品，提取RNA并进行转录组测序。

通过构建文库、测序和数据分析等步骤，获得了大量的转录组测序数据。

在数据分析阶段，我们使用不同的生物信息学工具对转录组数据进行处理和分析。

首先，我们对转录组数据进行质控，并筛选出高质量的序列数据。

接着，我们将序列比对到参考基因组上，使用了多个最先进的比对软件，以确保结果的准确性。

然后，通过计算每个基因的表达水平，并使用差异表达分析方法，鉴定出在不同生长阶段和组织中具有显著差异表达的基因。

最后，通过GO功能注释和KEGG通路分析等手段，确定这些基因的功能和参与的代谢途径。

在基因筛选的基础上，我们选择了一些具有较高差异表达的基因进行进一步的验证。

首先，我们设计了引物，使用qRT-PCR技术对这些基因的表达水平进行实时监测。

实验结果显示，qRT-PCR结果与转录组测序数据的趋势一致，验证了我们筛选基因的准确性和可靠性。

为了进一步验证这些基因的功能，我们利用遗传转化技术对紫花苜蓿进行了遗传改良。

通过转基因紫花苜蓿的生长情况对比分析，我们发现转基因植株在耐盐、耐旱和抗病等方面表现出更好的性状。

综上所述，本研究通过转录组学和生物信息学方法，筛选出了紫花苜蓿生长相关基因，并通过实验验证了这些基因的表达水平和功能。

这些结果为进一步研究紫花苜蓿的生长发育机理，提高紫花苜蓿的品种改良和种植效益提供了理论基础和实践指导。

希望本研究能够对紫花苜蓿的种植和利用提供有益的参考和借鉴综合以上研究结果，本研究通过转录组学和生物信息学方法，成功鉴定出紫花苜蓿生长相关基因，并验证了这些基因的表达水平和功能。

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紫花苜蓿基因组测序及分析
近年来,随着基因组测序技术的不断发展越来越多的植物基因组序列得到完善。

通过基因组测序,可以系统地解析植物基因功能。

紫花苜蓿具有优良的农艺性状,是全世界种植范围最广的牧草作物,具有“牧草之王”的美称。

在我国,紫花苜蓿生长主要集中在北方地区,这些地区气候寒冷,容易发生低温冻害,造成苜蓿减产,大大降低苜蓿的生产效益。

肇东苜蓿作为紫花苜蓿的地方品种之一,具有良好的抗寒特性。

因此,本研究以肇东苜蓿为主要研究材料,进行基因组测序、组装及注释,获得基因组草图;对其它四种紫花苜蓿品种:阿尔冈金、WL168、WL525和WL440进行基因组重测序,
挖掘抗寒相关的SNP。

同时,对紫花苜蓿AP2/ERF转录因子进行挖掘分析,构建紫花苜蓿AP2/ERF
基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿AP2/ERF转录因子在抗寒胁迫中的调控机制。

主要研究成果如下:1.紫花苜蓿全基因组组装及注释分析通过高通量测序,评估
紫花苜蓿基因组大小为1107M左右,杂合率为1.77%,通过组装获得紫花苜蓿基因组草图。

进一步注释分析,挖掘119194个蛋白质编码基因,它们主要的功能集中在信号转导机制、蛋白质翻译后修饰、防御机制以及转录调控等生物过程。

2.紫花苜蓿抗寒性状相关遗传变异的挖掘通过四个紫花苜蓿品种进行基因组重测序,发掘紫花苜蓿品种间的遗传变异(SNP),获得8909604个遗传变异;结合5个紫花苜蓿品种的抗寒性数据,挖掘82838个SNP与紫花苜蓿抗寒性状形成相关。

这些SNP分布在14372个基因上,它们主要涉及转录调控、还原代谢和信号转导等过程。

进一步富集分析发现,AP2/ERF、bHLH、MADS、NAC、MYB以及WRKY
等基因家族可能在紫花苜蓿抗寒过程中起关键调控作用。

3.紫花苜蓿AP2/ERF转录因子分子调控机制研究对紫花苜蓿全基因组进行分析,发掘了139个AP2/ERF转录因子,其成员分布在3个亚家族中;挖掘紫花苜蓿与模式植物拟南芥的基因互作关系,构建紫花苜蓿的基因调控网络,系统的解析紫花苜蓿的分子调控网络,将来为紫花苜蓿基因资源的利用奠定了理论基础。