产青霉素酶枯草芽孢杆菌的分离、纯化及相关酶活性的检测
枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究
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水产科学
第 27卷
图 3 发酵过程中酶活力随时间变化趋势
3 结论
在微生物态制剂的研究过程中, 分离得到 1株 产芽孢菌, 经鉴定为枯草芽孢杆菌, 并命名为枯草 芽孢杆菌 YB1。通过摇瓶试验, 对 YB1 菌的生长及 产酶情况作了初步的考察。枯草芽孢杆菌 Y B1 在 种子培养基及发酵培养基中均能迅速进入对数生 长期, 表明此菌代谢旺盛、生命力强, 有利于高密度 发酵以降低微生态制剂生产的成 本。 YB1 菌能够 分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶, 可用于鱼 虾等的饲料添加剂, 促进鱼虾生长及提高饲料利用 率; 同时, 可利用枯草芽孢杆菌分解养殖水体中过 剩饵料中的有机物, 净化水体及脱氮 [ 5 6] 。因此, 枯 草芽孢杆菌 Y B1 适合于研发微生态制剂并进一步 研究其功能和机理。
微生态制剂可以促进幼龄 动物肠道生长发育 及提高消化道酶活性已经被证实, 但对其机理研究 不多, 目前认为, 益生菌 (如芽孢杆菌 ) 能分泌多种 酶类并参与动物消化道的 酶池 , 进而提高了动物 消化酶 活 性, 并 促 进 动 物对 营 养 物 质 的 消 化 吸 收 [ 7] 。同样, 芽孢杆菌在水体净化中的作用与芽孢 杆菌能够分泌多种酶类紧密相关, 但这一相关性尚 未见报道。因此, 要进一步研究芽孢杆菌作为微生 态制剂的作用机制, 有必要对其分泌的酶系进行考 察。笔者在益生菌的研究过程中, 分离出 1株枯草 芽孢杆菌 ( B. subtilis), 并对其酶系分布进行了初步 研究, 以期为进一步深入研究提供参考。
收稿日期: 2007 - 01- 15; 修回日期: 2007 - 04- 18.
作者简介: 胡德朋 ( 1982- ) 男, 硕士研究生, 研究方向: 微生物工程, E m ai:l hudep@ 126. com. 通讯作者: 杨博 ( 1973 - ) 男, 副教授, 研究方向: 植物油酶法脱胶技术; E m ai:l yangbo@ scu t. edu. cn.
产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离
实验一产蛋白酶菌株枯草芽孢杆菌的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
活性芽孢杆菌的分离、鉴定
• 3.原始菌株及突变株产酶能力的测定及其产酶稳定性检测
• • （1）.标准曲线的制作(见下表) ①取7支20 ml具塞刻度试管,预先洁净灭菌干燥,编号,按表加入试剂。②摇匀,至沸水浴 中煮沸5 min。取出后流水冷却,加蒸馏水定容至20 ml,以1号管作为空白调零点,在 540 nm的波长下比色测定吸光度值。并建立通过吸光度值求麦芽糖含量的回归方程。
后培养：应让变异处理后细胞在液体培养基中培养几小时，使细 胞的遗传物质复制，繁殖几代，以得到纯的变异细胞。
三、高产菌株发酵条件优化
1.原理：以淀粉酶的活力做为检测的指标。 采用单因素试验筛选高产菌生长及产淀粉酶的最佳碳源和最佳氮 源，通过正交试验对高产菌的发酵条件进行优化，建立高产菌株 的最佳摇瓶发酵条件。经相关文件检索，本实验选则碳源浓度、 氮源浓度、无机盐浓度、接种量四个对于发酵较重要的因素进行 优化。 2. 材料与仪器： 高产菌株斜面 控温摇床、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、PH试纸、紫外分光光度 计 种子液培养、初始发酵培养基 蔗糖、麦芽糖、乳糖、糊精、玉米粉1. 6%、酵母膏1. 6%、尿素0. 2%、黄豆饼粉1. 6%、0．05% CaCO3、Zn SO4、CuSO4、Mn SO4·H2O、Mg SO4·7H2O
紫外线作为物理诱变因子用于工业微生物菌种的诱变处理具有悠久的历史尽管几十年来各种新的诱变剂不断出现和被应用于诱变育种但到目前为止对于经诱变处理后得到的高单位抗生素产生菌种中有80左右是通过紫外线诱变后经筛选而获得的
活性芽孢杆菌的分离、 鉴定与育种
闫恒 黄瑞辉 段花蕊
引言
• 芽孢杆菌能产生多种消化酶，帮助动物对营养物质的消化吸收。芽孢 杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，同时还具有降解饲料 中复杂碳水化合物的酶，如果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等 • 而淀粉酶是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶 制剂产品之一。淀粉酶种类繁多,特点各异,在造纸、印染、酿造、果 汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料 及微生态制剂等多种领域具有广阔的用途。现在淀粉酶主要来源于植 物和微生物并通过发酵完成生产，因此筛选出高产、稳定的淀粉酶产 生菌是淀粉酶生产的头等大事。 • 本实验从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌，通过诱变育种及发酵条 件优化来得到高产、稳定的淀粉酶产生菌株
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定
产纤维素酶真菌的分离、筛选及酶活测定摘要产酶纤维素微生物在纤维素资源的再生转化，提高牲畜饲料利用率，堆肥的使用以及环境污染等方面具有很高的应用价值。
而分离高效纤维素降解菌是这一内容的前提与基础。
本研究利用选择培养基CMC培养基，从学校周围的土壤中分离得到6株降解纤维素的真菌。
它们都具有较强的纤维素降解能力，尤其以编号为纸绿和江白活性最高。
随后对这6种菌株进行酶活测定，从中得到一株高酶活的菌株,其在CMC培养条件下酶活达到40 U。
关键词：纤维素降解菌；筛选；纤维素酶活；鉴定Separation, screening and enzymatic activity of cellulase producedby fungiAbstractMicrobial fermentation of cellulose micro-organisms, especially fungi in the conversion of cellulose into renewable resources and improve utilization of livestock feed, compost use and environmental pollution has a high application value. And efficient cellulose degradation bacteria can provide useful help in this regard. In this study, selective medium CMC medium, Shaoyang University straw isolated six soil fungi degrade cellulose. They have a strong ability of cellulose degradation, particularly in the number of paper green and White River the highest activity. And the 6 strains with a high activity were morphological, physiological and biochemical identification. Key Words: Cellulose degrading bacteria; Filter; Cellulase activity; Identification.目录摘要 (I)ABSTRACT (II)1前言 (1)1.1纤维素概述 (2)1.2纤维素酶 (2)1.3 纤维素分解菌类 (4)1.4本文研究的目的与意义 (6)2 实验部分 (7)2.1材料 (7)2.2主要试剂与仪器 (7)2.3培养基 (8)2.4菌种的分离与筛选 (9)2.5纤维素酶活性测定 (10)2.6形态特征观察 (12)2.7生理生化特性鉴定 (13)2.8菌种保藏 (14)3 结果与讨论 (14)3.1初筛选得到的各菌株的菌落形态特征描述 (14)3.2复筛获得的菌株图片 (14)3.3葡萄糖标准曲线的绘制 (16)3.4各菌的酶活力测定结果 (17)4 结论 (18)参考文献 (19)致谢 (20)1前言纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源。
巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化
第15卷第1期1999年2月中国生物化学与分子生物学报Ch inese Jou rnal of B i ochem istry and M o lecu lar B i o logyV o l.15,N o.1Feb.19993 联系人 T el:(021)643744302289,Fax:(021)64338357E2m ail:zhongyi@黄艳红:女,32岁,博士收稿日期:1997212212,修回日期:1998204201・研究简报・巨大芽孢杆菌青霉素酰化酶在枯草杆菌中的表达及其分离纯化黄艳红 袁中一3 王应睐(中国科学院上海生物化学研究所,上海200031)Expression and Pur if ica tion of the PGA gene ofB acillus m ega ter ium i n B acillus subtilisHU AN G Yanhong,YU AN Zhongyi,W AN G Y inglai(S hang hai Institu te of B ioche m istry,Ch inese A cad e my of S ciences,S hang hai 200031) Abstract Pen icillin G acylase(PGA)gene of B acillus m eg a terium w as in serted in to the p las m id of pM A5E.coli2B.subtilis shu ttle vecto r,then the recom b inan t p las m id pM A GA w as tran sfo rm ed in to B.subtilis BCL1050.T h is is a secrete system,in w h ich PGA can be exp ressed and secreted in2 to cu ltu re m edium directly,p roviding a conven ien t m ean s of ob tain ing relatively p u re enzym e in large quan tity.A fter cu ltu ring fo r24hou rs in rich m edium,the enzym e activity reached abou t1.4 U m l.PGA exp ressed in B.subtilis BCL1050w as p u rified app rox i m ately6002fo ld by p henylala2 n ine hydrop hob ic ch rom atograp hy,amm on ia su lfate p reci p itati on,size exclu si on ch rom atograp hy and D EA E2Sep hadex A250ch rom atograp hy.T he p u rified enzym e,w ith an app rox i m ate m o lecu lar w eigh t of82kD,app eared to be hom ogeneou s judged by SD S2PA GE analysis.T he m ass ofΑandΒsubun its determ ined by SD S2PA GE w as54.95kD and21.88kD resp ectively.Key words B acillus m eg a terium,Pen icillin acylase,Exp ressi on,B acillus subtilis,Pu rificati on 青霉素酰化酶(PGA)在医药工业起着重要的作用,它能够水解青霉素G产生62氨基青霉烷酸(62A PA)和苯乙酸,62A PA是半合成青霉素的关键中间体.该酶广泛存在于各种微生物中如真菌和细菌中.国际上对E.coli、A rth robacter v iscosus、K luy vera citrop h ila来源的PGA研究较多,对巨大芽孢杆菌(B acillus m eg a terium)来源的青霉素酰化酶研究较少,并且对它的表达研究大部分是在大肠杆菌表达系统中进行的.枯草杆菌(B acillus subtilis)作为表达系统有以下优点:(1)它能够把有功能的蛋白直接分泌到胞外;(2)非致病性;(3)没有明显的偏爱密码子.它的非致病性决定了它在食品卫生方面有广阔的应用前景.我们尝试用枯草杆菌表达系统对巨大芽孢杆菌来源的PGA进行表达研究.巨大芽孢杆菌的PGA基因克隆到大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒pM A5中,再转化到枯草杆菌BCL1050中,在H p a 启动子作用下进行表达.表达产物通过苯丙氨酸2Sep haro se24B柱、Sep hacryl 2100和2250柱纯化得到了纯度达90%以上的青霉素酰化酶.1 材料与方法111 枯草杆菌质粒的抽提、感受态细胞的制备和质粒的转化 参照文献[1].112 外源基因的表达把重组表达质粒pM A GA转化到枯草杆菌BCL1050,接种单菌落于3m l LB(含Km50Λg m l),37℃培养过夜,取上述过夜菌以0105%的接种量于新鲜的LB(Km)培养液中,37℃振荡培养24 h,即可得含酶的发酵液.113 酶活力测定酶活力测定采用N IPAB方法[2]和PDAB方法[3].酶活力单位定义为每分钟产生1Λm o l62A PA 所需酶量.114 青霉素酰化酶的分离纯化苯丙氨酸2Sep haro se4B柱层析(按文献[4]和[5]方法制备苯丙氨酸2Sep haro se4B),Sep hacryl S2 100分子筛柱层析,D EA E2Sep hadex A250柱层析参照有关文献进行.2 结果与讨论211 表达载体的构建和转化通过PCR技术,从巨大芽孢杆菌CA2098菌种中获得青霉素酰化酶基因,克隆到pB luescri p t+SK 中,得到重组质粒p SKGA(513kb).p SKGA用E co R 、B am H 切下p ga,连接到N d e 、B am H 酶切的pM A5中,产生重组质粒pM A GA(919kb). pM A5是一个大肠杆菌2枯草杆菌穿梭质粒,核苷酸长度为715kb.用B am H 、E co R 把重组质粒pM A GA切开,经连接转化,筛选到只带有卡那霉素抗性的质粒pM A GA2(6115kb)(F ig.1),将pM A2 GA,pM A GA2分别转化到枯草杆菌受体菌BCL1050中,得到BCL1050(pM A GA)与BCL1050 (pM A GA2).BCL1050是一个在染色体上去除大部分蛋白酶基因的工程菌[6],外源基因能在BCL1050中得到很好的表达,并且稳定性好,BCL1050 (pM A GA)培养24h的发酵液4℃放置1周酶活力不下降.枯草杆菌质粒的转化与大肠杆菌质粒转化不同,枯草杆菌感受态转化质粒发生在生长的特殊阶段,转化效率最高的感受态是对数期后生长3h 的菌,与起始培养菌的生长率无大关系[7].212 青霉素酰化酶的表达以0105%接种量将过夜菌BCL1050 (pM A GA)接种于80m l LB培养基(含50Λg m l Km).测菌体生长曲线和产酶活力曲线.发现在24 h产酶量已趋于稳定,活力单位为018U m l.把含有pM A GA2的BCL1050过夜菌接种于新鲜的LB 中培养,与BCL1050(pM A GA)比较,发现BCL1050 (pM A GA)的菌生长较慢,但活力高.BCL1050 (pM A GA2)的菌体虽然生长快,但活力低.同时,采用不同的培养基如丰富培养基来进行发酵,发现酶活力比在LB培养基中活力高.培养24 h后LB培养基中的酶活力为018U m l,丰富培养基中的酶活力则已达114U m l.继续延长培养在LB培养基中的酶活力基本稳定而丰富培养基中的酶活力还在增加.84h后酶活力达到4U m l.提高F ig.1 Constructi on of B.subtilis exp ressi on vecto r接种量到2%和5%,发现相同时间酶活力并未因接种量增大而提高.还测定了在丰富培养基中接种量为0105%发酵液中菌体内的酶活力,1m l发酵液中菌体内的酶活力单位24h为011U m l,48h为0115U m l,68h为0114U m l,84h为011U m l,菌体内的酶活力稍有变化.发酵液中酶活力一直增长的原因可能有二:一是随着培养时间的延长,新生菌不断产生酶,有累积效应;二是大量老的菌体死亡,分解释放出菌体内残留的酶,所以酶活力一直在增加.在巨大芽孢杆菌中,PGA的产生受葡萄糖的抑制,把丰富培养基中的葡萄糖去掉,发现BCL1050(pM A GA)发酵液酶活力不仅不增高,反而下降.重组质粒pM A GA只含有PGA的结构基因,不含有它的调控基因,所以重组表达菌种BCL1050(pM A GA)中葡萄糖并未抑制PGA的产生,反而是菌体生长所需的营养成分.213 青霉素酰化酶的分离纯化在含有22%硫酸铵的磷酸缓冲液中,青霉素酰化酶与苯丙氨酸224通过疏水相互作用071中国生物化学与分子生物学报15卷而吸附,其它疏水性弱的杂蛋白则不被吸附.当硫酸铵浓度降低时,使它们之间的疏水作用减弱而解吸,PGA 被洗脱下来[5].这一纯化步骤可除去培养基中的大部分杂质,而吸附大部分酶分子.产率为81%,达到浓缩酶的作用.收集的活力峰直接加入硫酸铵使其浓度达75%饱和度,经过沉淀离心可以得到80%的酶.再通过分子筛,除去小分子和大分子的杂蛋白.最后经过D EA E 2Sep hadexA 250柱层析,在pH 715时,酶分子带负电荷,能与C l -进行交换.经过这几步的纯化,SD S 2PA GE 显示出只有两个亚基的条带(F ig .2),酶的纯化倍数提高了600倍(T ab le 1).F ig .2 SD S 2PA GE pattern of purified penicillin acylase 1:P ro tein m arkers2:Purified PGA samp le (10Λg )Table 1 Pu rificati on of pen icillin acylase from the recom b 2inan t B acillus subtilis pM A GA (BCL 1050)To tal vo lum e m l To tal p ro tein m g To talactivity U Specific activity U ・m g -1Yeild (%)Ferm entati on bro th 10001602736817501023100Phe 2Sepharo se ch rom atography 9183173001733159381155Ammonium sulfate p reci p itati on 819431129615461888014Sephacryl S 2100163251223210991213116D EA E 2Sephadex A 250343155118141814214 青霉素酰化酶分子量的确定12%SD S 2PA GE 电泳测定蛋白质的分子量.测量和计算标准蛋白质和PGA 两亚基的相对迁移率m R (样品迁移距离染料迁移距离),以标准蛋白质分子量的对数对相对迁移率m R 作图,得到标准曲线,根据Α、Β亚基的相对迁移率,从标准曲线上查出它们的分子量分别为54195kD 和21188kD ,这与从PGA 基因推导出的分子量59107kD 和22188kD 基本相符.致谢:对美国D arto is 博士所提供的枯草杆菌受体菌BCL 1050和穿梭质粒pM A 5深表谢忱.References1 贾盘兴,蔡金科编著.微生物遗传学实验技术.北京:科学出版社(J ia Panxin ,Cai J inke .L aboratory M anual of M icrobiology Ge 2netics.Beijing :Science P ress ),1992:130～1372 上海第三制药厂,一种快速简便的测量青霉素酰化酶的方法.医药工业(Shanghai T h ird Pharm acial Facto ry .M ethod to deter 2m ine penicillin acylase fast and conviniently .M ed Ind ),1978,7:22～243 Balasingham K ,W arburton D ,D unnill P ,L illy M D .T he iso la 2ti on and k inetics of penicillin am idase from E scherich ia coli .B ioch i m B iop hy s A cta ,1972,276:250～2564 徐俊,祁俊,袁中一.共价法固定化胰蛋白酶的研究.生物工程学报(Xu Jun ,Q i Jun ,Yuan Zhongyi .I mmobilizati on of T ryp sin onSepharo se derivatives using vari ous covalent bonding m ethods .Ch in J B iotechnol ),1993,9(1):69～735 费俭,顾秋.疏水层析法纯化青霉素酰化酶.生物化学与生物物理学报(Fei J ian ,Gu Q iu .Study on hydrophobic ch rom atogra 2phy of B .M eg 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枯草芽孢杆菌分离及筛选实验方案
微生物设计性实验枯草芽孢杆菌的分离及筛选第二小组组长：杨泽升组员：***叶宁霍克枯草芽孢杆菌的分离和筛选1 实验目的掌握枯草芽孢杆菌的分离筛选的基本原理，熟练掌握无菌接种技术、微生物分离筛选技术和微生物形态观察技术。
了解枯草芽孢杆菌的分布、营养、生长等特点，以及它所具有的产淀粉酶的功能。
根据这些特点进行分离和筛选，从而得到纯菌株。
2 实验原理枯草芽孢杆菌属革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
选择含淀粉丰富的土壤为最佳，80度的水浴处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞。
利用稀释涂步法，在淀粉的培养基培养，培养1-3天后，观察。
然后，进行初筛与纯化，鉴定参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用显微镜进行革兰氏染色，确认是否为枯草芽孢杆菌。
再复筛，测定其淀粉酶活，最后确定菌株。
3实验材料3.1选择培养基本次实验进行产淀粉酶的枯草芽孢杆菌的筛选，所以应选淀粉培养基，配方：牛肉膏 5.0g蛋白胨 10.0g氯化钠 5.0g可溶性淀粉10.0g琼脂 20g蒸馏水 1000ml调整pH至7.2配置时应先把淀粉用少量蒸馏水调成糊状，再加入到融化好的培养基中。
3.2溶液或试剂牛肉膏 1.25g蛋白胨 2.5g氯化钠 1.25g可溶性淀粉 2.5g琼脂 5g碘11克，碘原液2毫升，碘化钾42克，可溶性淀粉2克，磷酸氢二钠45.23克，柠檬酸8.068克，氯化钴25克，重铬酸钾3.34克， 100毫升0.01NHCL。
3.4仪器或其他用品平板培养皿 10个、试管15支、三角瓶2个、烧杯3个、称量纸、高压蒸汽灭菌锅、干燥箱、恒温培养箱、超净工作台、无菌涂布器、电热恒温水浴、500ml 量筒、显微镜、无菌吸管、无菌培养皿、无菌刻度吸管、酒精灯、记号笔、火柴、试管架、接种钩、滴管等。
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法
枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种广泛存在于自然环境中的细菌，具有重要的应用价值，被广泛应用于农业生产中的抗病、增产、改善土壤等方面。
因此，对枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法进行研究具有重要意义。
以下将介绍枯草芽孢杆菌的分离与鉴定方法。
一、枯草芽孢杆菌分离方法：1. 样品采集：根据研究需要，选择合适的样品，如土壤、植物组织、水等。
采集样品时要注意避免外源性污染，尽量避免使用过多的抗生素。
2. 样品处理：将采集到的样品进行处理，如土壤样品需要经过悬浮液稀释法进行样品制备，植物组织需要进行消毒处理等。
3. 分离培养基选择：根据枯草芽孢杆菌的生长特性，选择合适的分离培养基。
通常可以选用液体培养基（如TSA、LB培养基）或固体培养基（如TSA、PDA培养基）。
固体培养基还可以添加适当的抑菌剂来抑制其他细菌的生长。
4. 分离培养：将样品制备好后，均匀涂布在选择的培养基上，然后进行培养。
液体培养基需要在适当的温度和速度下进行摇床培养，固体培养基需要静置培养。
培养时间一般为24-48小时。
5. 子培养：在培养基上出现孤立的菌落后，用离心管吸取菌落，再划线接种到新的培养基上，进行连续传代培养。
一般选择形态特征明显、菌落形状规则的菌落进行子培养。
6. 纯化：通过连续传代培养，最终获得纯种的枯草芽孢杆菌。
纯化的细菌可以通过形态观察、生理生化特性检测等方法进行初步鉴定。
二、枯草芽孢杆菌鉴定方法：1. 形态观察：观察菌落形态、色素、菌体形态等。
枯草芽孢杆菌的菌落通常呈乳白色或灰白色，形状为圆形或不规则形。
2. 胞内酶活性检测：通过检测枯草芽孢杆菌的胞内酶活性来鉴定，如淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶等。
常用方法为利用不同培养基的酶基质进行相关酶活性检测。
3. 生理生化特性检测：包括对枯草芽孢杆菌的耐温、耐酸碱性、氧化还原反应等生理生化特性的检测。
4. 分子生物学鉴定方法：利用分子生物学方法，如PCR、16S rRNA基因测序等来鉴定枯草芽孢杆菌。
产纤维素酶菌株的筛选和枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶催化活性的改造的开题报告
产纤维素酶菌株的筛选和枯草芽胞杆菌内切葡聚糖酶催化活性的改造的开题报告一、研究背景和意义：纤维素是一种能够在自然环境中分解的生物质，其中含有较高的木质素、半纤维素和纤维素等难于利用的成分。
这些成分对于生物质的转化有一定的限制，造成了生物质转化领域的困扰。
为了解决这些限制，科研人员不断研究发现，纤维素酶菌株可以通过产生纤维素酶降解纤维素，从而解决生物质转化的难题。
此外，枯草芽胞杆菌的内切葡聚糖酶催化活性的改造也可以帮助人们更好地利用生物质资源。
二、研究目的和内容：本研究旨在筛选出一种高效产纤维素酶的菌株，用于生物质转化领域中的生产。
同时，改造枯草芽胞杆菌的内切葡聚糖酶催化活性，以提高生物质利用效率。
具体研究内容包括：1、对不同来源的环境样品进行筛选，选出对纤维素酶产生能力强、生长速度快等特点的菌株；2、对选定的产纤维素酶菌株进行鉴定、优化培养条件，提高其纤维素酶产生能力；3、构建含有特定基因的质粒，利用基因技术改造枯草芽胞杆菌的内切葡聚糖酶催化活性；4、利用分子生物学技术检测菌株的产酶基因表达情况，分析酶的特异性、纯度、酶解产物等性质。
三、研究方法：本研究将采用以下一些研究方法：1、通过分离纤维素废弃物等分子生物学技术对环境样品进行筛选，筛选出产纤维素酶的菌株；2、应用蛋白质质谱等技术对所得的菌株进行鉴定，采用单因素试验和响应面试验等方法，优化培养条件；3、利用PCR等技术构建含有特定基因的质粒，通过电转化等方法将构建好的质粒导入枯草芽胞杆菌，并进行筛选；4、通过酶活性测定等方法检测改造后的葡聚糖酶催化活性，利用酶学方法分析酶的特异性、纯度、酶解产物等性质。
四、预期结果与意义：预计本研究将通过分子生物学、生物制造等技术，筛选出高效产纤维素酶的菌株，并利用基因技术改造其内切葡聚糖酶催化活性，提高生物质利用效率。
该研究结果将有助于提高生物质资源的利用效率和可持续性，为生物质转化领域的研究和应用提供科学的理论和技术支持。
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产青霉素酶杆菌的分离、优化及酶活力的检测一、实验目的1、了解采集土样的要求和方法。
2、掌握由土壤中分离产青霉素酶的基本原理和操作技术。
3、学习并掌握土壤稀释法和微生物的纯培养技术。
4、学习并掌握细菌培养基的制备。
5、学习并掌握细菌发酵液产酶活性的检测方法。
二、实验原理青霉素酶(EC3. 5. 2. 6) 是催化水解青霉素β-酰胺环, 使青霉素变成无抗菌活性的青霉素酮酸的一类β-酰胺酶。
早在1940 年青霉素还未广泛应用于临床时,Abraham 等就从耐青霉素的 E.coliK12 中发现了青霉素酶, 该酶也是关于Β-酰胺酶的首次报道。
随后在地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌中相继发现了这种特性的青霉素酶。
并对地衣芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌产青霉素酶的发酵条件、酶学性质和基因序列进行了研究。
虽然细菌产生青霉素酶是导致出现耐药性的原因之一, 但利用青霉素酶具有水解β-酰胺类抗生素的特点, 可将其用于抗生素药品质量检验和新抗菌药物筛选。
该酶最具广阔应用前景的用途是用于对牛奶中的青霉素残留量的快速定量测定和对青霉素超标牛乳进行处理。
国外在20 世纪80 年代中期就开展了青霉素酶固定化及处理青霉素超标牛乳的研究, 近年对青霉素酶生物传感器的研究非常活跃。
另外, 由于青霉素酶具有价格低廉和灵敏度高等优点, 其可在酶联免疫吸附试验(ELISA ) 中替代传统的辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
我国在青霉素酶的研究方面起步较晚。
1999 年,中国药品生物制品检定所在我国最先分离出一株能产生青霉素酶的蜡状芽孢杆菌CM CC (B ) 63301, 并对该酶的发酵方法、水解酶谱和保存稳定性等方面进行了研究。
该菌株作为青霉素酶产生菌已被收入中国药典。
但目前国在青霉素酶的研究和应用方面的报道较少。
枯草芽孢杆菌芽孢杆菌属的一种。
单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。
无荚膜，周生鞭毛，能运动。
革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。
菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。
需氧菌。
可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
有的菌株是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生产菌；有的菌株具有强烈降解核苷酸的酶系，故常作选育核苷生产菌的亲株或制取5'-核苷酸酶的菌种。
在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。
广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。
枯草芽孢杆菌的作用机理：1、枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些活性物质对致病菌或源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用；2、枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道PH 值，间接抑制其它致病菌生长；3、刺激动物免疫器官的生长发育，激活T、B淋巴细胞，提高免疫球蛋白和抗体水平，增强细胞免疫和体液免疫功能，提高群体免疫力；4、枯草芽孢杆菌菌体自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体的消化酶类一同发挥作用；5、能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体干扰素和巨噬细胞。
三、实验材料1.溶液和试剂牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、硫酸铁、1mol/L氢氧化钠、1mol/L盐酸、琼脂、枸橼酸钠、K2HPO42．仪器和其他用品试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、天平、牛角匙、高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸（pH5.5—9.0）、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、移液枪（20μL、200μL、1000μL）、枪头四、实验步骤及结果注意：所有试验操作均要在无菌条件下进行，防杂菌污染。
（1）操作在无菌室，吴俊祥，超净工作台上进行，双手用70-75%酒精棉球擦拭。
（2）培养容器（试管，培养皿等）要事先灭菌，培养时加盖。
（3）接种用具要灭菌。
试验流程：发酵培养保存菌种紫外诱变正交优化时间安排：5月16日：采集土样（缙云山土，沙土，泥土）。
5月19日：土样稀释、倒平板、接种。
5月21日：初选菌落，培养24小时。
5月22日：配制含有10000单位/mL青霉素的平板5个，将4000单位青霉素的平板上的菌落转接到10000单位/mL青霉素的平板上，30 ℃培养24小时。
5月23日：配制含有20000单位/mL青霉素的平板4个，转接，30 ℃培养24小时。
5月24日：选出生长较好的12株菌，接种到含有20000单位/mL青霉素的液体培养基试管，摇床培养24小时。
5月25日：观察发现只有一支试管（沙3）中液体出现浑浊，保存菌种于一支斜面。
5月28日：又发现了3支试管中液体出现浑浊，并将他们保种于斜面。
将沙3的菌种取出1mL接到含1万单位青霉素的摇瓶,1mL接到含2万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时。
同时将3支浑浊试管中的菌液各取出1mL接到含1万单位青霉素的摇瓶中，摇床培养24小时.5月29日：正交试验，紫外诱变5月30日：酶活力的测定5月31日：酶活力的测定实验步骤：（一）菌种的分离与纯化牛肉膏蛋白胨培养基【配方】牛肉膏3g蛋白胨10g氯化钠5g琼脂15-20g水1000mlPH 7.0-7.2材料及仪器土壤样品，无菌水，无菌玻璃棒，接种环，酒精灯，采土铲，细目筛，药勺，称量纸，试管架，小天平，记号笔，镊子，圆滤纸片，15×150mm试管，无菌漏斗，牛皮纸袋，培养皿，1ml、5ml吸管，250ml三角瓶(带玻璃珠)，玻璃刮铲，实验具体步骤：称量和溶化按要求称取药品，并加热搅拌使之溶解。
调节pH 先确定溶液此时的PH，再根据情况调节pH至7.0-7.2分装将配制好的培养基分装入四个200ml的三角瓶，每瓶约150ml，注意不要使培养基粘在瓶口上，以免引起污染。
加纱布与包扎三角瓶加塞后，外包牛皮纸，用线绳以活结形式扎好，在皮纸上标明名称、组别、日期。
灭菌0.1Mpa 15~30min高压蒸汽灭菌。
（将培养皿、玻璃棒、分装器一起灭菌。
）冷却待冷却至60℃，取出两瓶150ml的培养基，向其中一瓶加入18.75mg的青霉素，使其青霉素浓度为200u/ml，倾倒斜面平板，待冷却后，将另外的150ml培养基分装于平板上，是平板成平面，并在平板底部做好标记，浓度的梯度趋势。
（1）采样：选取离地面5～10 cm处的土，用小铲子取样，将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。
准确取样10克，加入装有90ml无菌水并带有玻璃珠的三角瓶中，震荡约20min，使土样与水充分混匀，静置，取上清液。
（2）稀释用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液;以此类推，制成10-1，10-2，，，，，10-6等一系列稀释菌液，编号。
（3）将梯度培养基编号。
（4）将无菌平板编上10-3,10-4，每浓度涂布两个平板，共有三个土样，每个每个土样接种两个浓度。
用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-3 10-4 稀释液各0.1ml放入编号的平板中，再用无菌玻璃棒将菌液在平板上涂抹均匀。
（三种土样，每个稀释度各涂布两个培养基，共需要12个培养基）（5）培养在30℃条件下倒置培养24h。
菌落的判断菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭,需氧菌. 在肉汁培养基上的菌落为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙皱褶，24h 后菌落直径为3mm。
配制青霉素浓度分别为1000u/ml 2000u/ml 4000u/ml浓度的培养基各两个。
即共制作6个培养基，待接种使用。
（6）观察不同培养基上菌落的形态，首先根据芽孢杆菌的菌落特诊初步判断菌落种类，然后用结晶紫染色的方法确定是否为所需杆菌，挑选出生长良好的20株杆菌菌落，分别接种于三个不同浓度的培养基中，每个培养基点接10个菌落，30℃恒温箱中培养24h。
配制青霉素浓度分别为10000u/ml,20000u/ml浓度的培养基各两个，即共配制4个培养基，待接种使用。
（7）观察不同培养基上菌落的生长状况，挑取生长良好的12株菌落，分别接种于培养基上，每个培养基接种6株，在30℃条件下倒置培养24h。
配制青霉素浓度为20000u/ml的LB液体培养基，分装于12支试管中。
（8）观察培养基上菌落的生长状况将青霉素浓度为20000u/ml的培养基上的所有菌落都接种于LB液体培养基中，挑取青霉素浓度为10000u/ml培养基上长势良好的菌落也接种于液体培养基中，共挑选了12株，32℃恒温摇床培养24h。
（9）通过培养，有一支试管培养基变浑浊，将试管中的菌种斜面保存。
另外，量取试管中菌液各1ml，分别接种在青霉素浓度为10000u/ml,20000u/ml的两个含100ml LB液体培养基中，32℃恒温摇床培养24h。
(10)两个摇瓶培养基中都十分浑浊，分别取菌液保种。
【附注】结晶紫染色法结晶紫染色液(Crystal Violet Staining Solution)是一种组织或细胞染色时常用的可以把细胞核染成深紫色染色后的的染色液。
用于革兰氏染色.，结晶紫是一种碱性染料，可以和细胞核中的DNA 结合，从而产生细胞核染色。
简单染色法是一种最基本的染色方法，是只用一种染料使细菌着色以显示其形态的方法。
因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，而碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。
所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红、孔雀绿或蕃红）等进行染色，当这类染料解离后，染料离子带正电荷，使菌体着色实验步骤：1、涂片：用消毒棉球擦拭双手，用镊子取干净载玻片一块，在载玻片的左、右两端各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，涂培养基中生长良好的菌落，做成浓菌悬液。
亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。
2、晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方用文火烘干。
3、固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2～3次固定，以不烫手为宜。
4、染色：用将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加结晶紫染液1-2min。
5、水洗：水洗去涂片上的染色液。
6、干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸水纸吸干，勿将菌体擦掉。
7、镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。
（二）菌种的紫外诱变（1）取青霉素浓度为20000u/ml的液体培养基中1ml，按十倍稀释法稀释到10-4 ，然后将稀释1000倍的菌液涂布于5个LB培养基上，分别将5个培养基在紫外线照射45s、75s、105s、135s、165s，同样，将稀释10000倍的菌液涂布5个LB培养基上，紫外线诱变同样时间。