蛋白酶产生菌的紫外诱变育种
产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种
产碱性蛋白酶菌株的筛选与诱变育种郑津辉【摘要】为获得性状稳定、高产的碱性蛋白酶菌株,采用平板诱变法对产碱性蛋白酶菌株进行诱变处理.结果表明,采用牛奶平板法及Folin测酶活法从鸡粪土样获得产碱性蛋白酶出发菌株.该菌株经亚硝基胍(NTG)诱变并利用利福平抗性株筛选获得蛋白酶活力为出发菌株34,65倍的2个变异株.因此,利用亚硝基胍作为诱变剂可产生高产酶菌株.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2015(030)005【总页数】3页(P122-124)【关键词】碱性蛋白酶;筛选;诱变育种【作者】郑津辉【作者单位】天津师范大学生命科学学院,天津300387【正文语种】中文【中图分类】Q939.97蛋白酶是一种重要的工业化应用的酶制剂，占酶制剂市场的65%以上，广泛用于洗涤剂、制革、银回收、医药、食品加工、饲料、化学工业、废物处理等行业。
碱性蛋白酶的最适反应pH 值一般大于9.0，是目前市场上最为广泛使用的蛋白酶。
微生物具有生长速度快，生长条件简单、代谢过程特殊和分布广等特点，使之成为生物酶的重要来源［1－2］。
又由于微生物蛋白酶均为胞外酶，与动物、植物源蛋白酶相比具有下游技术处理相对简单，价格低廉、来源广、菌易培养、同时易于实现工业化大批量生产的特点。
而且碱性蛋白酶比中性蛋白酶具有更强的水解能力和耐碱能力，有较大耐热性，有一定的酯酶活力。
因此，碱性蛋白酶研究已成为蛋白酶研究的热点。
在全世界生产所有种类的酶中，碱性蛋白酶占总产量的37%左右，其中以微生物源的蛋白酶研究最为广泛，尤其是芽孢杆菌属菌株［3］。
当前国外碱性蛋白酶高产菌株的选育主要用基因工程技术和蛋白质工程手段进行工业微生物菌种的定向选育，目的性强，而且酶结构研究也比较深入。
目前，我国碱性蛋白酶研究总体趋势发展较好，主要集中在高耐温碱性蛋白酶和常温碱性蛋白酶，但酶活力不高仍是当前工业化生产的一个最主要的限制因素。
利用物理、化学因子单独或复合诱变选育高活力菌株是菌种选育的一种好方法。
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选
紫外线对枯草芽孢杆菌生产菌株的诱变与筛选马加强;吴明;马礼鹏;刘博【摘要】枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种革兰氏阳性菌，具有种类多、分泌蛋白能力强、安全性好等优点，是一种重要工业酶和工业制剂的菌种，被广泛应用于医药、食品、农业、饲料、造纸和纺织等多种领域。
为了进一步提高枯草芽孢杆菌的发酵能力，采用紫外线照射的方法诱导筛选高产菌株。
对通过紫外线诱导提高枯草芽孢杆菌产淀粉酶、蛋白酶、α－乙酰乳酸脱羧酶（α－acetolactate decarboxy－lase，简称α－ALDC）、3－羟基丁酮（Acetoin）和葡萄糖－1－磷酸（Glucose－1－phosphate，简称G－1－P）能力的条件进行了比较。
%Bacillus subtilis is a kind of gram positive bacteria, which has many advantages, such as abundant varieties, strong ability of secreting protein, good safety and so on.It is a kind of important industrial enzyme and industrial formulation, and has been widely used in many fields, such as medicine, food, agriculture, feed, paper and textile.In order to further improve the fermentation ability of Bacillus subtilis, the high yield strain was induced by UV irradiation.The conditions for improving the production of amylase, protease,α-ALDC, acetoin, glucose-1-phos-phate were compared by ultraviolet radiation.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2016(044)017【总页数】4页(P18-20,72)【关键词】枯草芽孢杆菌;紫外线诱导;酶制剂;3-羟基丁酮;葡萄糖-1-磷酸【作者】马加强;吴明;马礼鹏;刘博【作者单位】中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081;中央民族大学生命与环境科学学院，北京100081【正文语种】中文【中图分类】S182枯草芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌，呈直杆状，内生芽孢，好氧，其菌落不透明，呈白色或微黄色，表面粗糙，可将体内生产的蛋白分泌到胞外。
产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育
产中性蛋白酶芽孢杆菌的选育摘要：紫外诱变方便易操作，所以本实验选用紫外诱变的方式对分离纯化到的菌株进行诱变，以获得具有较高酶活性或产酶较多的产中性蛋白酶菌株。
本实验对纯化得到的菌株进行LB培养基活化，得到代谢旺盛，酶系活跃的活化菌株，功率15W紫外灯30cm处照射照射分别照射1min、3min，将得到的诱变菌液进行10倍梯度稀释，取10-3~10-6梯度菌液涂布于固体牛奶培养基上，37。
C培养24h，另设一组未经紫外诱变的对照，同样条件下培养。
结果发现，未经诱变的培养基中，-3培养基中出现较多菌株，而-4、-6均无菌株，-5中仅出现一株菌株。
经紫外诱变照射1min的关键词：紫外诱变活化培养蛋白酶引言：从自然环境中分离，经简单筛选而获得的产酶菌株，虽然具备了一定的产酶能力，但是要达到某种特定代谢产物的大量积累，实现高产、优质和低耗的高效转化则需要对菌株进行改良，解除或突破微生物的代谢调控【1】。
随着基因工程技术和代谢控制理论的发展，定向育种发挥着越来越大的作用，但传统的诱变技术仍然是大多数工业微生物育种的重要技术【2】。
传统诱变技术包括应用各种物理化学方法，例如紫外诱变，X射线，NTG诱变，由于其低廉的成本及简单的使用方法，仍然是目前大多数菌体选育首选且使用最多的方法，现有用来进行诱变育种的出发菌株应对诱变剂敏感，变异幅度大，经诱变处理过的高产菌株，并一定是继续提高产量潜力大的菌株。
这是因为，诱变获得的高产菌株再诱变时易出现负突变，继续提高产量较为困难【3】。
本实验利用紫外线进行诱变，得到D1/D2=6：1的诱变菌株，相较于未诱变前D1/D2=8：3酶活力显著提高为原来的2.25倍，可用于进一步的发酵复筛。
1、材料与方法1.1材料1.1.1原料初筛并保藏的菌种1.1.2 培养基1）LB发酵液体培养基：蛋白胨：10.0g；酵母膏：5.0 g；氯化钠：10.0g；蒸馏水：1000mlpH到7.0。
2）初步筛选固体培养基：脱脂奶粉：5.0g；酵母膏：2.0 g；琼脂：20.0g；蒸馏水：1000mlpH: 7.0。
【2019年整理】紫外线诱变育种
紫外线诱变选育α-淀粉高产菌株一、实验目的1.学习菌种的物理因素诱变育种基本技术。
2.通过诱变技术筛选出高产ɑ-淀粉酶的菌株。
二、实验原理紫外线是一种最常用有效的物理诱变因素，其诱变效应主要是由于它引起DNA结构的改变而形成突变型。
紫外线诱变，一般采用15W或30W紫外线灯，照射距离为20-30cm，照射时间依菌种而异，一般为1-3min，死亡率控制在50％-80％为宜。
被照射处理的细胞，必须呈均匀分散的单细胞悬浮液状态，以利于均匀接触诱变剂，并可减少不纯种的出现。
同时，对于细菌细胞的生理状态则要求培养至对数期为最好。
本实验以紫外线处理产淀粉酶的枯草杆菌，通过透明圈法初筛，选择淀粉酶活力高的生产菌株。
三、实验材料1.菌种产淀粉酶枯草芽孢杆菌2.器材装有15W或30W紫外灯的超净工作台、电磁力搅拌器（含转子）、低速离心机、培养皿、涂布器、10m L离心管、（1、5、10m L）吸管、250m L三角瓶、恒温摇床、培养箱、直尺、棉签、橡皮手套、洗耳球3.培养基和试剂①无菌水、75%酒精②0.5％碘液碘片1g、碘化钾2g、蒸馏水200m L，先将碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中，待碘片全部溶解后，加足水即可。
③选择培养基可溶性淀粉2g，牛肉膏1g，N a C l0.5g，琼脂2g，蒸馏水100m L，p H6.8～7.0，121℃灭菌20m i n。
④肉汤培养基牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，N a C l0.5g，蒸馏水100m L，p H7.2～7.4，121℃灭菌20m i n。
四、实验步骤1.菌体培养取枯草芽孢杆菌一环接种于盛有20m L肉汤培养基的250m L三角瓶中，于37℃振荡培养12h，即为对数期的菌种。
2.菌悬液的制备取5m L发酵液于10m L离心管中，以3000r/m i n离心10m i n，弃去上清液。
加入无菌水9m L，振荡洗涤，离心10m i n，弃去上清液。
脂肪酶产生菌的紫外诱变选育
ＵＶ ｕｔ ｇ ｎ ｓＳ ｏ ｇ ｙ ｅ ｄ ｌ ｓ ｔ ａ ｎｓ ｍ ａ ｅ ｅ ｉ ｆＨｉ ｈ— ｉ ｌ ｉ ｅ ｓｒ ｉ ｐａ
Ｚ ａ ｇ ｎ Ｌ ｌ ，ｉ ｇ ｉ ａ ， ｎ ｉＹ ａ ｉ ｇ ｈ ｎ ， Ｉ ｉｅＪａ Ｊ ｎ Ｗａ ｇ Ｍｉ Ｊｉ ｎＬｕ Ｗｅ， ｕｎＱ ａ ｎ
常性 能 和耐受性 差 、 遗传不 稳定 ， 往往 不能 满足 工业生 产 的要 求 ， 因此采 用 不 同的手 段对 筛选 出来 的野 生 菌株 进行选 育是必 不可 少 的． 常用 的育种 手段 有紫外 诱变 、 ＭＳ诱 变 、钴 ６ 变 以及定 向进化 等方 Ｅ ０诱 法， 目前也 实现 了脂肪 酶基 因在毕 赤酵母 中的高量 表达 ． 而紫外诱 变是 应用 广泛 、 然 效果 明显 的物理诱
【Ｊ ３
．
因此 寻找具有 高效产脂 肪酶能 力 的菌 株成 为研 究工作 的 中心．
目前 已报 道 的 一 些 具 有 转 酯 活 力 的脂 肪 酶 微 生 物 种 类 有 Ｐｅ ｄ ｍ ｎｓｆ ｏｅｃｎ ，ｈ ｏ ｃｒ ｓ ｕ ｏ ｏ ｏ ｕ ｒ ｅｓ Ｒ ｉ ｍｕｏ ｌ ｓ ｚ
黑曲霉的紫外诱变及酸性蛋白酶缺陷株的选育
１３ 培养条件 ．
将孢子菌悬液按体积分数 ０ １ ．０的接种量 ， 接种到发酵培养基中，Ｏ℃转速为 １０ｒｍｎ ３ ５ ｉ 的条件下 ／ 培养 ７ｄ 离心收集上清液 ， ， 既为粗酶液 。
基金项 目： 秦皇岛市科学技术研究与发展计划项目（ 项目编号： １０Ａ ７ ） ２ １１ １６ 。 ０
中图分类号 ： ９ ３ Ｑ ３ 文献标志码 ： Ａ 文章编号 ：６２７ ８ （ ０ ２ ０ －０２０ １７ － ３ ２ １ ） １ ７ － ９ ０ ５
黑曲霉产酶发酵的历史十分悠久 ， 可用于生产淀粉酶 、 眭蛋 白酶、 酸 纤维素酶、 果胶酶 、 柠檬酸、 没食 子酸等多种酶制剂和食用酸， 是公认的可用于食品生产的高安全 性真菌 【 。此外 ， 曲霉在生物工程 ｌ 】 黑
，
要作用 。目前 ， Ｊ 已采用基 因重组技术从 大肠杆菌 中提取该 酶 ， 由于大肠杆菌表达水平低、 但 提取 困 难， 使其实际应用受到限制 。而黑 曲霉 的 ｐ葡萄糖苷酶基 因表达水平较高 ， 一 利用黑 曲霉作为其生产
菌株有突出优势。研究表 明， 黑曲霉产生的胞外蛋白酶能降解外源基因所表 达的蛋 白， 使表达产物不能 积 累。为使黑曲霉表达异源 ｐ葡萄糖苷酶的效果更好 ， － 必须在不改变蛋 白质外泌能力 的前提下 ， 使其 胞外蛋 白酶活性缺失 【 。本实验 旨在通过紫外诱变方法筛选酸性蛋白酶缺失 ， Ｂ葡萄糖苷酶活性基 ８ Ｊ 而 －
收稿 日期 ： ０ ２Ｏ －９ ２ １－２０
１ 期
刘 畅等
黑 曲霉 的紫外诱 变及酸性蛋 白酶缺陷株 的选育
１ ４ 紫外 诱变 条 件 的筛 选 ．
黑 曲霉经固体斜面培养后 ， 用无菌水洗下新鲜孢子 ， 制成孢子悬浮液 ， 用灭菌吸管吸取 １ Ｌ 孢子 ０ｍ （ 数量为 １ １ｍ Ｌ 于培养皿中， １ 紫外灯下照射 ， Ｏ ～ Ｏ 个／ ） 于 ５ｗ 停止照射后涂布平板 ， 用锡箔纸包裹平板 ， 完全避光 ２ ， ４ｈ 后拆开锡箔纸再培养 ４ ， ８ｈ 计算致死率 。通过改变紫外照射时间、 Ｊ 照射距离和孢子悬 液的浓度 ， 选择最适 的诱变条件 。 １ ５ 酸 性 蛋 白酶缺 陷菌 株 的筛选 ． １５ １ 平板初筛 将诱变后 的黑 曲霉孢子涂布于酪蛋 白平板和 ｐ葡萄糖苷酶筛选平板 ， ．． － ３ Ｏ℃培养 ４ ８
毛霉紫外线诱变育种
文章编号:1000-9973(2006)02-0020-04毛霉紫外线诱变育种刘云秀,吕开斌(四川理工学院生物工程系,四川自贡643000)摘要:从腐乳和千张(豆类发酵食品)宜宾名特产)中分离得到的毛霉菌株,经紫外线诱变处理及控温培养、筛选各得到一株生产能力较出发株高的突变株mr6(1,2)。
该菌株在温度28e条件时生长旺盛,产酶能力高,具有较好的遗传稳定性。
关键词:毛霉;腐乳;千张;紫外线诱变;蛋白酶中图分类号:TS261115文献标识码:BBre eding of M ucor racemosus by ultraviolet radiationLIU Yun2xiu,LV Kai2bin(Dept.of Bioengineering,Sichuan University of Science and Engineering,Zigong643000,China) Abstract:A Mucor r acemosus picked out from preserved beancur d and Qianzhang is mutated by U ltraviolet Radiation and fostered by temperatur e and filtr ated,then a mutant named mr6(1,2), whose production is higher than its parent strain,was gained.T he mutant with a high production of enzyme has a higher inheritable stability and yields well at28e.Ke y words:Mucor ra cemosus;preserved beancurd;Qianzhang;mutation;proteinase毛霉(Mucor racemosus)在豆腐乳的酿造过程中对腐乳的独特风味的形成起极其重要的作用,在腐乳的酿造过程中毛霉所产生的蛋白酶、淀粉酶、酯酶等多种酶系,分解原料中的多种成分,从而形成腐乳独特的色、香、味、体。
腐乳毛霉蛋白酶菌株紫外线诱变育种
根系分泌物的种类繁多,依植物不同而存在一定的差异。
而根系分泌物对其根际微生物在根际空间的分布表现出明显的影响[9]。
因此作者推测牛蒡根系分泌物最有可能诱导了镰刀菌的富集,鉴于镰刀菌对牛蒡具有普遍而明显的致害作用,因此很可能造成牛蒡的连作障碍,这对近几年兴起的牛蒡栽培业具有一定的实践指导意义。
镰刀菌是最重要的植物病原菌之一,其中以F .oxyspo 2rum 、F .oxysporum v .redolens 和F .solani 致病频率最高[10],然而由于其成员庞大、复杂,且培养中容易发生形态上的变异,因而镰刀菌又是真菌中最难鉴定和最具经济价值的属之一。
长期以来形态学一直是镰刀菌的最有效的鉴定手段,但形态学鉴定往往经验主导,导致其分类学一直以来都颇有争议。
因此包括β-tubulin 基因、mtSS U (mitochondrial small subunit )、28S rDNA 、ITS 等序列比对的分子生物鉴定方法不断提出并应用[11,12]。
估计包括分子生物学鉴定在内的系统真菌学鉴定将成为以后镰刀菌系统分类的发展方向,本文结合形态学和分子生物鉴定手段,鉴定牛蒡根际致害菌F130和F131为Fusar 2ium solani 。
Fusarium solani 就是我们常说的茄病镰刀菌,它有很多生理专化型,如合欢、葫芦、蚕豆、豌豆、胡椒以及桑属植物等均有报道Fusarium solani 专化型,它们明显表现出对寄主植物的特殊的寄生能力和侵染力。
至今还未见牛蒡有它专化型镰刀菌的报道,鉴于F131和F130在牛蒡根际的特殊地位,而对莴苣种子和幼苗并没有表现出明显的毒性(仅进行了几株菌,不系统,所以数据没有在正文中提及),很有可能是茄病镰刀菌牛蒡专化型,但还需要我们进一步研究确认。
参考文献:[1]徐传芬,孙隆儒.牛蒡的研究现状[J ].天然产物研究与开发,2005,17(6):818-821.[2]魏东.牛蒡抗氧化、降血脂保健功能研究[J ].食品科学,2008,29(2):380-382.[3]Han Y,M am iya A ,Nkya E ,et al.Purification and Characterization of Chlorogenic Acid Oxidase from Edible Burdock (Arctium lappa L.)[J ].Nip 2pon Shokuhin H ozo K agaku K aishi ,2006,32(6):275-281.[4]孙长花,张素华.牛蒡的营养和药用价值及其加工利用[J ].扬州大学烹饪学报,2008,25(2):61-64.[5]胡江春,薛德林,马成新,等.植物根际促生菌(Pgpr )的研究与应用前景[J ].应用生态学报,2004,15(10):1963-1966.[6]郑艳.中药材的地道性与根际土壤微生物[J ].现代中药研究与实践,2007,21(6):60-63.[7]王书锦.陆地-海洋微生物研究理论应用新方法[M].沈阳:辽宁省科学技术出版社,2004.[8]Boot h C.著.陈其火英译.镰刀菌属[M].北京:农业出版社,1988.[9]Liljeroth E ,Baath E ,M athiass on I.,et al.R oot exudation and rhiz oplane bacterial abundance of barley (Hordeum vulgare L.)in relation to nitrogen fer 2tilization and root growth[J ].P lant and Soil ,1990,127(1):81-89.[10]Z emankova M.Occurrence of species of Fusarium genus in crop rotation [J ].Ochrana R ostlin ,1996,32(3):201-207.[11]Odonnell K,Cigelnik E.T w o divergent intragenom ic rDNA ITS2types within a m onophyletic lineage of the fungus Fusarium are nonortholog ous[J ].Molecular Phylogenetics and Evolution ,1997,7(1):103-116.[12]M ishra PK,F ox RT V ,Culham A.Application of nr -DNA ITS sequence for identification of Fusarium culmorum is olates[J ].Bulletin OEPP ,2000,30(3-4):493-498.腐乳毛霉蛋白酶菌株紫外线诱变育种刘芳,曹新志,方春玉,梁秋菊(四川理工学院生物工程学院,四川自贡643000)摘要:目的:选育酶活力高、耐热性好的毛霉蛋白酶菌株,用于腐乳发酵实验或生产。
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蛋白酶产生菌的紫外诱变育种
xxxx大学生命科学学院生物工程第一组
前言: 因为自发突变率小，以微生物的自然变易作为基础的筛选菌种的机率并不很高。
为了加大突变频率，可采用物理或化学的因素进行诱发突变。
物理因素中目前使用得最方便且十分有效是紫外，紫外诱变一般采用15w的紫外灭菌灯，其光谱比较集中在253.7nm处，这与DNA的吸收波长一致，可引起DNA分子结构发生变化，特别是嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，从而引起菌种的遗传特性发生变易。
本次实验通过比较对照组和紫外诱变1min、5min、10min的实验组菌落的生长情况和水解圈的情况，可以很好的了解紫外诱变的效果。
初步的说明诱变育种为筛选高效，稳定的菌种提供了有效可能的方法。
1 实验材料与方法
1.1 材料
1.1.1样品：老师提供的生长较好的菌液
1.1.2培养基及其配制
1）液体培养基：牛肉膏0.3g，蛋白胨1.0g，NaCl 1.0g，pH7.0～7.5，H2O 定容至100ml。
配好50ml/三角瓶，分装两瓶每瓶50ml.包扎112℃，灭菌30min。
2）固体培养基（300ml）:牛肉膏0.9g，蛋白胨3g，NaCl 3g，H2O 定容300ml，pH值7.0。
配好后，按100ml/瓶分装三瓶, 分别称取1.5g琼脂条塞入三角瓶，包扎，112℃，灭菌30min。
取牛奶粉25g用250ml水溶解，包扎，116℃，灭菌15min。
按10%分别加入上述3个三角瓶中，每个三角瓶10ml。
混匀后，倒平板。
1.1.3生理盐水：取Nacl 1.8g 溶解在200ml的水中，即配制0.9%的生理盐水。
1）每支试管中加入4.5ml蒸馏水，塞上试管塞，22支试管分4组分别包扎；
2）剩下的生理盐水装入三角瓶包扎；
112℃灭菌30min。
1.1.4器材
血球计数板，显微镜，紫外诱变箱，红灯泡，
移液管，涂布棒，含有7颗玻璃珠的空三角瓶等，112℃灭菌30min。
1.2 方法
1.2.1 菌株的培养
从老师给的菌悬液各取50ul接入2个液体培养基，37°C，220rpm，震荡培养过夜。
1.2.2出发菌株菌悬液的制备
1）取出发酵培养基，从生长良好的一瓶取20ml倒入50ml离心管中5000转离心5分钟，弃上清，倒扣离心管于滤纸上吸干残留培养基；
2）加30ml无菌生理盐水，重新震荡悬浮菌体，再离心，弃去上清；重复一次；
3）重复上述步骤加入5ml生理盐水恢复成菌悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，逐步添加生理盐水调整细胞浓度为108/mL；
4) 将上述菌悬液倒入装有小玻璃珠的无菌三角瓶内，振荡10~20min，以打散细胞；
5）取0.5ml 菌悬液进行10-1——10-7稀释分离，取10-5、10-6、10-7三个稀释度，每一梯度取100ul
菌液涂布平板，37℃倒置培养24h。
1.2.3 蛋白酶产生菌株的紫外诱变
1）将紫外灯打开，预热30min；
2）取三个无菌空培养皿，加入菌悬液5ml；
3）将待处理的培养皿置于诱变箱内，轻轻晃匀后打开皿盖，分别处理1min、5min、10min，照射完毕后先盖上皿盖，再关闭紫外灯；
4）分别取0.5ml处理后的菌液进行10-1——10-5稀释分离，取10-3、10-4、10-5三个稀释度。
每个样品的每一梯度取100ul菌液涂布平板，待菌液干后用黑色包装袋包好37℃倒置培养24h.（避光培养），做好标记。
诱变过程在暗室红灯下进行。
1.2.4 实验结果观察
观察和比较对照组和3个实验组的单个菌落情况，稀释梯度生长情况，以及水解圈大小。
2 实验结果与分析
在对照组与紫外5min诱变中都出现了较好的单个菌落，并且菌落数随着稀释度的增加而减少；以及各个培养基中都出现了较明显的水解圈。
如下图：
3 实验讨论
因为基因突变具有不定向性。
因此在此紫外诱变的过程中，是否产生高产，稳定的蛋白酶产生菌，须做进一步的实验。
将紫外诱变后的突变菌株与野生型菌株经行酶活比较。
才能判断和筛选出正向突变的菌株。