从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
产淀粉酶菌株的分离与纯化
产淀粉酶菌株的分离与纯化一、实验目的和内容目的：掌握用平板稀释法分离得到微生物纯种的方法内容：分离产淀粉酶的芽孢杆菌二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，因此可以从土壤中分离、纯化有价值的菌株。
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
平板分离法是常用的方法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理包括两个方面：（1）选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等条件，或加入某种底物、抑制剂造成只利于该微生物生长而一直其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体。
因此可通过挑取单菌落儿获得一种纯培养，获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板技术来完成。
（3）纯化方法：平板划线法，即将一个平板分成四个不同面积的小区进行划线，第一区（A区）面积最小，作为待分离菌的菌源区，第二和第三区（B、C 区）是逐级稀释的过渡区，第四区（D区），则是关键区，使该区出现大量的单菌落以供挑选纯种用。
为了得到较多的典型单菌落，平板上四区面积的分配应是D﹥C﹥B﹥A。
三、实验材料1.土样2. 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏1.5g、蛋白胨15g、NaCl 2.5g、琼脂10g、2%可溶性淀粉10g、无菌水1000ml、PH7.4-7.63.试剂与材料用具：无菌水烧杯、玻璃管、涂布棒、无菌吸管、移液枪、玻璃棒、接种环、无菌培养皿、三角烧瓶、量筒、培养基分装器、天平、药匙、PH试纸、高压蒸汽灭菌锅、酒精灯、棉花、牛皮纸、记号笔，橡皮筋等。
四、实验步骤（一）稀释涂布平板法1.制备培养基2.倒平板将牛肉膏蛋白胨培养基加热融化，待冷至55~60℃时，倒平板。
3.制备土壤菌悬液称取土样10g放入盛有90ml无菌水的烧杯中，搅拌均匀。
用一支无菌吸管从中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀，然后用无菌吸管从中吸取1ml加入另一支盛有9ml无菌水的试管中，充分混匀，以此类推制成10ˉ1,10ˉ2,10ˉ3,10ˉ4,10ˉ5,10ˉ6不同稀释度的土壤溶液。
简答题 设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,并加以必要
简答题设计一个诱变筛选淀粉酶高产菌株的科研方案,
并加以必要
请设计一个实验方案自土壤中筛选能产淀粉酶的枯草芽孢杆菌并进行诱变育种选育高产突变株。
1、取样
选择含淀粉丰富的土壤为最佳
2、无菌水溶解
充分震荡
3、高温处理
60度的高温处理样品1小时，目的是杀死微生物营养体，残留芽胞
4、稀释涂平板
培养基用含淀粉的培养基配制
5、培养
培养1-3天后，观察。
6、初筛与纯化
挑取有降解圈的细菌单菌落，并在平板上纯化3次，然后4摄氏度斜面保存。
7、鉴定
参照《伯杰氏细菌手册》鉴定或者利用分子生物学手段鉴定，进一步确认是否为枯草芽孢杆菌。
8、复筛
测定其淀粉酶活，最后确定诱变出发菌株
9、诱变
选择合适诱变源，建议采用物理诱变和化学诱变相结合的复合诱变方式。
10、筛选
采用上述初筛和复筛方案进行诱变鉴定
11、遗传稳定性鉴定
筛选出的菌株，要经过多次传代之后，再进一步鉴定其产生淀粉酶的能力是否发生了变化。
如果产生了回复突变，则需要重复诱变筛选过程，直至到筛选出遗传稳定的高产菌株为止。
土壤微生物综合实验报告
广州大学综合设计性实验报告课程：微生物实验实验课题：土壤中产淀粉酶芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定学院：生命科学学院姓名：徐嘉宽学号：1414300030班级：生技142小组成员：一实验摘要本次实验通过采用5点采样方法在校园中采取2处土壤样品，运用梯度稀释的方法分离培养出不同生长形态的细菌，镜检后挑选几个菌落进行纯培养，用淀粉培养基鉴定其是否产淀粉酶，通过单染色、芽孢染色、革兰氏染色确定菌株的形态及革兰氏阴阳性，再通过各种生化试验鉴定菌株的特性，确定了我们所分离的2株菌株其中一株为蜡状芽孢杆菌。
二实验目的1.掌握从土壤等复杂的微生物环境中分离纯化技术2.掌握培养基的配置方法及常用的微生物培养方法3.掌握常用的微生物形态学鉴定方法、生理生化鉴定方法4.了解微生物的16SrRNA序列鉴定方法、免疫学鉴定方法5.掌握淀粉酶活力测定的原理及方法6.掌握菌种保藏技术7.培养数据统计、分析能力8.培养团队协作精神，增强沟通合作能力9.与其他小组交流合作、数据共享，进行更深入的探讨10.学会查找、收集、整理资料三实验原理芽孢杆菌(BaciUus)是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。
这类细菌多数为腐生菌,主要分布于土壤、植物体表面及水体中,由于它们能够产生对热、紫外线、电磁辖射和某些化学药品有很强抗性的芽孢,因此能忍受多种不良环境。
土壤中蕴含着丰富的微生物资源,芽孢杆菌是其中具有重要应用价值的微生物类群。
有些菌种可以分泌多种酶,可应用于工业生产;有些菌种能产生对昆虫毒性较强的蛋白,可生产微生物农药;有些菌种可作为多种分泌蛋白基因表达受体,在基因工程领域中有较高的应用价值。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件，是微生物生活最适宜的环境。
其中的微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。
从土壤中分离产淀粉酶芽孢杆菌实验方案
土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述：淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用【1】。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有：地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌【2】、凝结芽孢【3】。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤和植物体表面及水体中【4】。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1．了解生物分离提纯的原理和方法技术2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm～30 cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少【5】。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案
从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案实验方案：从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验目的：分离产淀粉酶的芽孢杆菌，用于后续淀粉酶相关研究。
实验步骤：1.样品采集：选择含有潜在产淀粉酶的土壤样品，如农田土壤或果园土壤。
2.稀释培养：将采集的土壤样品用无菌PBS缓冲溶液稀释，并进行均匀悬浮。
3.接种装置：将土壤悬浮液均匀涂布在含有淀粉的固体培养基上，使用毛细管或平面接种棒操作，确保样品均匀地接种在培养基上。
4.培养条件：将接种好的培养基培养皿在适宜的培养条件下培养。
适宜的培养条件包括温度、湿度和氧气供应等。
一般来说，菌株生长的适宜温度为30-37摄氏度，湿度为60-70%。
5.纯化分离：通过制备出来的细菌菌落将产酶菌株分离出来。
可以使用毛细管、骨牌、环针等工具，分别挑取单个菌落并将其转移到含有淀粉的培养基上。
6.传代培养：将分离出来的产酶菌株进行传代培养，以确保其菌落的特性稳定。
7.筛选鉴定：通过淀粉酶活性分析等方法，对分离出来的菌株进行筛选鉴定。
一般来说，可采用滴定法或I2-KI法测定淀粉酶活性。
根据颜色变化或者酶活性指标的变化，筛选出淀粉酶产量较高的菌株。
8.鉴定菌株：对产淀粉酶的菌株进行鉴定，确定其属于芽孢杆菌的种属。
可以采用传统的形态学和生理生化特性鉴定方法，如菌落形态观察、革兰染色、氧需气性、形状和运动情况等。
9.鉴定纯化：最后，对鉴定出来的菌株进行纯化培养，以获得纯种淀粉酶产生菌。
实验注意事项：1.采集样品时要避免采集过于含油的土壤，以免对实验造成干扰。
2.在操作过程中要做好防护，戴手套，避免污染样品。
3.在培养过程中注意严格无菌操作，以避免外源菌的污染。
4.在菌株的鉴定过程中，要仔细观察菌株的形态特征，并结合多种鉴定方法综合分析。
5.实验过程中要注意做好记录，包括实验步骤、结果、观察和记录等。
总结：通过上述实验方案，我们可以从土壤中分离出产淀粉酶的芽孢杆菌。
这有助于开展后续淀粉酶相关的研究，包括酶的生物化学性质、作用机制等。
浙江师范大学微生物实验报告 产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定
产淀粉酶芽孢杆菌的分离与初步鉴定吴月婷摘要：从土壤中分离得到一株产淀粉酶的芽孢杆菌X-1，对其进行形态学鉴定和生理生化特性分析，包括菌落形态、菌体形态、糖利用情况、生长pH范围、耐盐范围、明胶液化和酪素的水解等，初步鉴定为芽孢杆菌属枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或地衣芽孢杆菌（Bacillus lentus）。
关键词：产淀粉酶；芽孢杆菌；分离；初步鉴定淀粉酶(Amylase)是指能分解淀粉糖苷键的一类酶，主要包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶等，在生物体的糖类代谢中起重要的作用。
其中α-淀粉酶（1,4-α-D-glucan glucanohydrolase）能水解淀粉大分子的α-1,4-糖苷键，生成糊精、麦芽寡糖、麦芽糖、葡萄糖等水解产物[1]。
α-淀粉酶在植物、动物和微生物中都广泛存在，常见的产淀粉酶微生物有芽孢杆菌、放线菌、黑曲霉、米曲霉、红曲霉和根霉等[2-7]。
芽孢杆菌属(Bacillus)是一类能产生芽孢的革兰氏阳性细菌，具有较强的抵抗不良环境的能力，如耐酸碱、耐高温的能力较强。
芽孢杆菌中较多菌种具有高淀粉酶、蛋白酶活性，近年来被广泛地用于动物饲料业，特别是作为水产饲料的添加剂。
例如在银鲫饲料中添加了0.1%的芽孢杆菌后，银鲫肠道和肝胰脏的淀粉酶活性提高了3.7%和129.5%[8]，能够有效帮助动物对饲料的消化吸收，同时作为一种良好的免疫激活剂，能增强动物的免疫力和抗病力[9]。
此外，利用芽孢杆菌产生α-淀粉酶，在食品生产中也有广泛应用。
笔者从土壤中分离得到产淀粉酶的芽孢杆菌，进行种属的初步鉴定，以期为芽孢杆菌在动物饲料业和食品生产中的发开应用提供理论依据。
1 材料与方法1.1 材料土壤材料采集于浙江师范大学取杏园食堂草坪土壤表层5~10厘米下的肥土。
1.2 培养基淀粉培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨l%、葡萄糖0.5%、Nacl 0.5%、牛肉膏0.5%、琼脂粉0.8%。
土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定教案
土壤中产淀粉酶的芽孢杆菌的筛选及淀粉酶活力的测定13级生技426摘要本实验从土壤中分离出能产淀粉酶的芽孢杆菌并对其进行鉴定、保存，实验中涉及菌株的分离纯化、菌株的形态学鉴定和生理生化鉴定，根据伯杰氏细菌学手册鉴定其种属。
实验中通过80℃水浴20min预处理，杀死无芽孢菌体，筛选出芽孢杆菌；再用稀释涂布平板法对芽孢杆菌进行初步筛选；又通过分区划线法对初筛菌株进一步分离纯化；最后用选择性淀粉培养基进行筛选，得到纯培养的产淀粉的芽孢杆菌。
最后并通过耐盐试验、明胶试验、糖发酵试验、VP试验、吲哚试验等多项生理生化实验对筛选出来的菌种进行鉴定。
关键词：淀粉酶芽孢杆菌生化鉴定一、引言芽孢杆菌属(Bacillus)是一类好氧或兼性厌氧，产生抗逆性内生孢子的杆状细菌。
多为腐生菌，主要分布于土壤、动植物体表及水体中。
由于芽孢杆菌属的细菌可以产生多种有用代谢产物，芽孢又是菌体度过不良环境的休眠体。
因此，在工、农业生产上有较高的应用价值。
菌体杆状，直或接近直，0.3 – 2.2X1.2 – 7.0微米。
多数运动，鞭毛典型侧生，形成抗热内生孢子。
在一个孢子囊细胞中，孢子不多于1个。
暴露与空气中时，不妨碍孢子的形成。
革兰氏反应为阳性，仅在生长早期为阳性、阴性。
有机体化能营养，利用多种底物进行严格呼吸代谢，严格发酵代谢或呼吸和发酵二者兼有的代谢。
在呼吸代谢中，最终的电子受体是分子氧，在一些种中可以用硝酸盐代替氧，大多数种产接触酶，严格好养或兼性厌氧。
淀粉酶是一种用途极为广泛的生物催化剂，可应用于面包制造业淀、粉的糖化和液化、纺织品脱浆、造纸、清洁剂工业、化学、临床医学的分析和制药业等。
淀粉酶家族包括α-淀粉酶，β-淀粉酶和葡萄糖淀粉酶。
二、实验目的1．了解微生物分离纯化的原理及微生物分离纯化常用方法和技术；2．掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理及方法；3．掌握微生物的摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理及方法；4．培养学生自行设计实验流程、综合分析解决问题及判断实验结果的能力；5．对所学习过的微生物实验方法进行综合技能训练；6．从不同环境土壤样品中筛选出能产淀粉酶的芽孢杆菌，并分析比较各产淀粉酶菌株的产淀粉酶活力及总结各芽孢杆菌在土壤中的分布情况。
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定
产淀粉酶芽孢杆菌分离和测定生物11.1魏凡棣 37实验目的：对可产生淀粉酶的芽孢杆菌进行分离的测定实验原理：1.传代培养：从土壤中提取微生物，经过一段时间的培养就会大量滋生形成菌落，不同形态、生理类型的细菌，在其菌落形态构造上也有许多明显的反应，而为了保存某种已经获得的菌株，一般采用低温（4摄氏度）抑制微生物的生长，使其保留活性。
2.细胞染色：微生物细胞在碱性，中性及弱酸性溶液中通常带负电，而燃料电离之后染色部分带正电荷，很容易与细胞结合使其着色。
而革兰氏染色则首先用草酸铵结晶紫进行初染，使所有细菌都着结晶紫的蓝紫色；后用卢戈氏碘液媒染增强染料在菌体中滞留能力；后用95%乙醇脱色，由于细胞构造不同革兰氏阴性细菌中碘—结晶紫易洗脱，而经过复染后又被番红染成红色。
3.在显微镜下测定芽孢杆菌的大小：目镜测微尺是一块可放入接目镜内圆形小玻片。
有精准刻度，使用时放入接目镜中隔板上，用以测量经放大后的细胞物像。
由于不同显微镜或不同目镜和物镜组合放大倍数不同，其代表实际长度也不同。
因此，使用前必须校正，以求出在该倍数下每小格所代表的相对长度，后根据微生物细胞相当于目镜测微尺的格数，计算出细胞实际大小4.芽孢杆菌对淀粉的水解：微生物对大分子物质如淀粉不能直接利用，必须依靠产生胞外酶将大分子物质水解才能被吸收利用。
如淀粉酶水解淀粉为小分子的糊精双糖和单糖。
5.温度对芽孢杆菌生长影响的测定：微生物的生长繁殖受外界环境因素的影响，环境条件适宜时微生物生长良好，环境条件不适宜时微生物生长受到抑制，甚至导致微生物死亡。
而不同类型的微生物对温度的适应能力也有所差别。
实验器材：高压蒸汽灭菌锅牛肉膏蛋白胨 NaCl 蒸馏水土样试管培养皿移液管涂布器酒精灯显微镜革兰氏染液载玻片显微镜测微尺二甲苯擦镜纸淀粉‘实验步骤：一、芽孢杆菌的分离纯化：1.取合适量的牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂，蒸馏水按一定比例配成牛肉膏蛋白胨培养基。
调整PH至7.4到7.6。
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从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌实验方案土壤中产淀粉酶芽胞杆菌的筛选及其淀粉酶活力的测定设计性实验方案一、综述:淀粉酶是淀粉降解酶。
它们广泛存在于微生物、植物和动物体中。
它们将淀粉及相关的聚合物分解为带有具体淀粉分解酶特征的产品。
淀粉酶广泛存在于动植物和微生物中,是最早用于工业生产并且迄今仍是用途最广、产量最大的酶制剂产品之一。
淀粉酶种类繁多,特点各异,可应用于造纸、印染、酿造、果汁和食品加工、医药、洗涤剂、工业副产品及废料的处理、青贮饲料及微生态制剂]等多种领域。
在酿造发酵工业如酒精生产、啤酒制造、发酵原料液化及糖化工艺过程中均有重要价值,如添加淀粉酶分布非常广泛，是人们经常研【】1究的一种酶。
从纺织工业到废水处理，这些酶都有不同规模的应用。
常见产淀粉酶的主要为芽孢杆菌属。
其中的常见产淀粉酶的芽孢杆菌菌种有:地衣芽【】【】23孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌、凝结芽孢。
由于芽孢杆菌属是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生抱子的杆状细菌，许多为腐生菌，主要分布于土壤【】4和植物体表面及水体中。
所以此次实验从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌。
二、实验目的要求1(了解生物分离提纯的原理和方法技术2(掌握从土壤中筛选产淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物摇瓶培养方法及淀粉酶活力测定的原理和方法4.培养学生的综合应用微生物实验方法的能力5.培养学生自行设计实验流程、综合分析问题解决问题和判断实验结果的能力。
三、实验原理自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。
土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。
土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。
一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10 cm,30 cm的【】5土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。
平板分离法普遍用于微生物的分离与纯化。
其基本原理是选择适合与待分离微生物的生长条件，如营养成分、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂造成只利于该微生物生长，而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。
值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。
因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。
芽孢杆菌属的共同特征是:革兰氏阳性;接触酶阳性;水解淀粉;VP试验阳性;不产生吲哚;苯甲氨酸不脱氨;分解酪素;不分解酪氨酸;不产生二羟丙酮;营养体的最高生长温度大约从25?到75?以上;最低生长温度大约5?到45?;生长最低pH值，从7.5—8到2左右;耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl;营养明胶(22?)7天内液化1厘米或1厘米以上。
枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代1替葡萄糖可产酸;作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和【】。
6一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源四、实验材料和用具4.1 土样采集:采集广大植物园内的有机土壤，和文科楼旁边的桑园内的土壤，以及郭培国老师的种植园内的土壤、演艺中心旁的土壤。
4.2 营养琼脂(%):蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠0.5 琼脂1.5 ,2.0 蒸馏水将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2,7.4。
加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。
4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培养基(%):可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化钠0.5 琼脂1.5,2.0 校正pH至7.2,7.44.4 发酵培养基(%):玉米粉 2 黄豆饼粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl0.25 K2HPO4 0.2 柠檬酸钠 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.04.5 葡萄糖蛋白胨培养基(V.P试验用)(%):葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2校正pH 7.2,7.44.6 蛋白胨水培养基(吲哚试验用)(%):蛋白胨1% 氯化钠0.5% 校正pH7.2,7.44.7 西蒙氏柠檬酸盐培养基(%):氯化钠0.5 硫酸镁(MgSO4?7H2O)0.02 磷酸二氢铵0.1 磷酸氢二钾0.1 柠檬酸0.5 琼脂2 溴麝香草酚蓝溶液4 酚红试剂校正pH6.8先将盐类溶解于水中，校正pH，再加入琼脂，加热融化，然后加入指示剂，混匀后分装试管，121?高温灭菌15min。
4.8 配制营养明胶培养基(%):蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明胶1.2，调pH6.8~7.04.9耐盐培养基(%):?蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠2 琼脂1.5 ,2.0 蒸馏水?蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠10 琼脂1.5 ,2.0 蒸馏水?蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠20 琼脂1.5 ,2.0 蒸馏水?蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化钠25 琼脂1.5 ,2.0 蒸馏水加入15%氢氧化钠溶液约2mL，校正pH至7.2,7.4。
加入琼脂,加热煮沸，使琼脂溶化。
4.10 溶液或试剂染料革兰氏染色:草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色:5%孔雀绿溶液, 石炭酸复红液; 香柏油、二甲苯吲哚试验:乙醚、吲哚试剂V.P.试验:40,NaOH溶液、α-奈酚，淀粉酶活力测定:1%3, 5- 二硝基水杨酸试剂4.11 仪器或其它用具无菌玻璃涂棒无菌吸管接种环无菌培养皿土样三角瓶烧杯洗瓶玻棒试管酒精灯擦镜纸接种环酒精灯载玻片吸水纸等。
恒温摇床恒温培养箱高压蒸汽灭菌箱超净工作台水浴箱紫外灯照射箱磁力搅拌器玻璃珠移液管涂布器显微镜五、实验方法及步骤21、初筛方法?制菌悬液:五个土样分别取5g，放入各自装有45mL无菌水的三角瓶，振荡10min,即为-1稀释10的土壤悬浮液。
每个环境的土样装1个锥形瓶，共5个，同时将其分为10组，编号ABCDE。
?加热筛选有芽孢的菌:将5个锥形瓶加塞、包扎、摇匀(无菌室里)，利用恒温水浴装置-1100?左右水浴，水浴锅温度恒定后维持15min(制悬液时就应先开始加热)，制成10 g/ml的土壤悬液-2-3-4?梯度稀释菌悬液:再分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上10、10、10、-5-110。
取已稀释成10土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加-2-2入10的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10土壤-2-3稀释液。
同法从10的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10的无菌水试管中，混匀后即-3-4-5为10土壤稀释液，依次连续稀释为10、10土壤稀释液。
在土壤稀释过程中，用相同的移液枪头由浓到稀来稀释。
?涂布平板用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。
每个浓度做3个平板(重复)。
37?下恒温培养24h。
【】12、复筛方法划线接种(分区划线法):在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60?角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线(如右图)。
划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29?C温室中培养约20h.。
再继续分区划线2-3次，以获得较纯的菌种。
将纯化得到的单菌落分为两部分，其中一部分接种到培养基内，用以保存菌种，另一部分用来做染色实验。
3、获得产淀粉酶芽孢杆菌纯种:上述划线接种后的菌落中各挑取形态特征不一致的点接于倒好的淀粉牛肉膏培养基中，一个土样取8个平板两两标记同一位置同序号标记，一平板分5个区域，点接重复两次，在37?培养箱中培养24h。
上述点接后的平板中取出一组四个分好区域的淀粉牛肉膏培养基平板于实验室，其他置于无菌室。
实验室里，四个平板均加入碘液，立即观察记录阳性和阴性菌落所在位置，并可同时记录透明圈的大小。
根据所记录的阳性菌的编号，利用另一组中的营养琼脂平板上其对应的菌落继续划线接种，培养后将出现的形态特征不一致的菌落进行编号，然后挑取部分出来进行革兰氏染色镜检，若发现视野内出现形态、大小、颜色一致且为杆菌的菌体，则将其对应的菌种划线接种到新的营养琼脂平板上，标记，37?下培养24h。
否则继续进行划线分离，培养后再经革兰氏染色镜检直至得到纯种杆菌后进行芽孢染色。
筛选出芽孢纯种后进行斜面接种。
革兰氏染色步骤:涂片、干燥及固定初染:在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。
媒染:先用新配的路哥氏碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。
3脱色:除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15,20秒，后立即用流水冲洗。
复染:滴加番红染色液，染3,5分钟，水洗后用吸水纸吸干。
镜检:油镜观察染色结果。
芽孢染色染色镜检:?取37?培养18,24h的枯草芽孢杆菌涂片，干燥，固定。
?于涂片上滴人3,5滴5%孔雀绿水溶液。
?用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4,5min。
加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。
?倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。
?用石炭酸复红液复染l min，水洗。
?制片干燥后用油镜观察。
芽孢呈绿色，菌体红色。
(注:观察芽孢的形状和位置，查伯杰细菌手册)4.斜面保存菌种?贴标签取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2,3cm处。
(每种菌接3管，标上相同编号也要与平板上菌落编号相对应)。
进行斜面接种操作，加塞、包扎好到37?培养箱里培养24h。
5、菌种的鉴定5.1所得的斜面菌种接种到新的平板上培养以观察筛选出的产淀粉酶芽孢杆菌菌落的大小、颜色、干湿情况、形态、高度、透明程度、边缘、是否易被挑起、气味等。
然后进行一系列的镜检——革兰氏染色、芽孢染色(具体步骤同上)观察是否符合附表中芽孢杆菌的指标 5.2生理生化试验温度对菌种培养的影响;淀粉水解试验;温度对菌种的影响;明胶液化试验;糖发酵试验;乙酰甲基甲醇试验(V.P试验);吲哚试验;耐盐性试验;柠檬酸盐利用试验。
?温度对微生物生长的影响将牛肉膏蛋白胨培养基熔化倒平板。
(培养基厚度为一般培养基的1.5 到2倍) 取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分别进行标号。
在上述各平板中分别划线接种不同的菌种，每个菌种重复接种六个平板。