蛋白纯化系统技术指标
蛋白的分离纯化详解
常用蛋白质电泳技 术
• 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）
• SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS--PAGE）
• 等电聚焦电泳（ Isoelectric focusing- IEF）
• 双向电泳（ Two Dimensional Electrophoresis ）
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• 原理：蛋白质的净电荷取决于氨基 酸残基所带正、负电荷总和。
• 方法 – 电泳 – 离子交换层析
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溶解度
• 原理：由于蛋白质分子表面亲水 性和疏水性带电基团不同，因此 在溶剂中的溶解度不同。
• 方法： – 盐析法
– 有机溶剂沉淀法 – 等电点沉淀法
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分离纯化流程
原材料的获取
纯化
细胞破碎
研磨 超声 渗透压 酶 ……
蛋白溶解
酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……
粗提
沉淀 相分离 分子筛 ……
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精提
各种色谱 电泳分离 差速离心 ……
保存
浓缩
保存状态 保存条件
保存期限
……
• 分离纯化流程 • 预处理（沉淀、粗分离）-纯化（离子交换）
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4. 蛋白质免疫印迹技 术
( 重点 必须掌握）
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印迹法的基本原理
• 印迹（blotting）是生物大分子物质如核酸或蛋白质通 过不同途径转移到固相载体上的过程。
• 与凝胶相比，固相载体容易和各种探针发生化学或 免疫学反应。
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蛋白液相纯化系统技术参数
蛋白液相纯化系统技术参数.精确的全自动微量
柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气
阀。
2,流速：0. 001-25 ml/min （单泵）。
装柱模式可以双泵模式运行，最高达到50 nil/min：从低流速到50 ml/min的流速的变化只需要通过软件简单设置，不需要泵头的更换。
#3.流速准确度：±1.2%,流速精度：RSD<0. 5%,（条件：0. 25 - 25 ml/min, < 3 MPa, 0.8-2 cP）
*4.使用LED单一紫外冷光源（280nm）检测，无需预热。
*5 ,紫外检测范围：-6至I」+6 AU,线性：±5%,（条件：0-2 AU之间）6.光源和流动池分开设计，避免光源过热对样品的影响。
7.检测范围:0. 01 mS/cm—999. 9 mS/cm,宽广的电导范围,易于做疏水和反相层析。
8.缓冲液选择阀：4个缓冲液入口，内置气泡传感器保护层析柱。
9.圆形组分收集器具有滴感应器，防滴漏功能，可根据固定体积或峰收集进行自动收集。
10.圆形组分收集器可根据体积或峰自动收集，兼容3, 8, 15和50nli的收集管，最多可以同时放置175个3ml收集管,收集范围0. TSOniLo。
蛋白纯化原则和技术介绍
蛋白纯化原则和技术概览无论是蛋白研究还是应用，通常需要将蛋白利用不同的生物系统表达出来，然后进行分离和纯化。
研究实验室通常需要纯化微克或毫克级别的蛋白质，而工业上需要纯化数千克甚至数吨的蛋白质。
因此，蛋白纯化非常重要。
纯化过程中，主要需要考虑宿主污染、样品的可溶性、蛋白结构的完整性和生物活性。
蛋白的纯化可大致分为样品捕获、中度纯化阶段和精细纯化阶段3个阶段。
✓样品捕获：分离、浓缩和稳定化处理；✓中度纯化：去除核酸等其他细胞成分，可使用硫酸铵沉淀法；✓精细纯化：将靶蛋白与其他大小及理化性质接近的蛋白区分开来，常用方法包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析等。
蛋白纯化指导原则1. 明确目标，避免过度纯化或者纯化不够；表1. 对蛋白样本纯度要求的例子。
2、明确样本特性和主要的杂质，选择合适的纯化方法；可以通过检测蛋白稳定性窗口（如pH值、离子强度）和蛋白基础数据（如蛋白大小、等电点pl、疏水性、可溶性等）快速确定纯化技术组合。
3、能够快速检测蛋白的回收率、活性和杂质情况；4、尽量减少步骤，从而避免样本损失过多和活性降低过多；5、尽早除去蛋白酶等对样品有损害的杂质；6、尽量少使用添加剂，否则可能需要额外的步骤去除添加剂。
蛋白纯化方法由于样品和蛋白的性质各异，所含杂质也不尽相同，因此需要采用不同的蛋白纯化策略。
目前主要有六种蛋白纯化方法：凝胶过滤层析、离子交换层析、标签纯化、亲和层析、疏水作用层析、电泳等。
其他方法也可用于蛋白纯化，比如利用蛋白的热稳定性、蛋白酶解稳定性、溶解度等特性纯化蛋白。
1 凝胶过滤层析凝胶过滤层析是一种高效的蛋白分离纯化方法，根据分子大小的差异分离蛋白质混合物。
在蛋白溶液通过含有填充颗粒的凝胶过滤层析柱时，由于不同蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒的能力也因此各不相同，大分子蛋白率先被洗脱出来，分子量越小，洗脱越晚，从而达到蛋白分离和纯化的目的。
一般来说，越细、越长的凝胶过滤层析柱的纯化效果越好。
蛋白质纯化色谱技术
手动（六通阀）进样器
进样位置
废液
样品
流动相
接色谱柱
进样阀
样品
采样位置
废液
流动相
接色谱柱
（ＬＯＡＤ）
（ＩＮＪＥＣＴ）
定量环
层析柱（填料/介质）
分离的关键场所 使用方法不同，先查阅说明书 注意清洗保养 防止气泡进入 样品及缓冲液的预处理 保湿
填料（层析介质）
分离官能团； 基质骨架； 粒径/分辨率；
ÄKTAexplorer
Fast method and process development and scale-up for proteins, peptides and nucleic acids
Fully equipped for development tasks
Options: Autosampler Sample pump Air sensors
04
峰拖尾：样品在柱滤膜上或凝胶床顶部沉淀
05
常见问题分析
四、疏水性相互作用色谱 (Hydrophobic Interaction Chromatography）
ÄKTAFPLC
Options: Valves Sample Pump Air sensors
Reliable, well proven technology High performance purification of proteins
ÄKTA prime
Options: Valves Sample Pump Air sensors
2
K＝ 固定相溶质浓度/流动相溶质浓度
3
分配系数反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。
蛋白质纯化系统 AKTAprime
仪器描述
仪器说明
仪器标签
为实验室规模的蛋白质纯化而设计。和传统的手动操作比较，AKTAprime提供高速，高载量和组份收集的优点。 各式预装柱加上内置的应用模板，AKTAprime只需您按一个 键就可以进行纯化。
主要特点： * 容易使用 - 针对一般纯化的应用编程模板 - 所有层析技术的方法模板
file:///D|/webtopdf/蛋白质纯化系统 AKTAprime蛋白质纯化系统.htm[2010-1-8 22:46:38]
* 随时可用 - 所有必要部件已经整合在单一的系统中 - 精密设计使系统可被轻易移动到任何地方
* 经济和灵活 - 使用高质量的平台零件使开发成本大幅减低 - 可以用於任何纯化步骤中
技术参数： 手动控制，电脑数据采集和处理
AKபைடு நூலகம்Aprime 流速 0.1-50 ml/min 压力 0-2 MPa(292psi)
8通道程控缓冲液切换阀 UV 检测 254,280 nm 电导检测 1 μS/cm - 999.9 mS/cm 压力监控 电动混合 程控进样阀 收集器 - 95管 18 mm 试管自动收集
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蛋白质的高效表达和纯化技术
蛋白质的高效表达和纯化技术蛋白质是细胞中最为基本的分子，不仅构成细胞的基本结构，也参与到细胞的代谢、信号转导等生命活动中。
因此，蛋白质的高效表达和纯化技术是生命科学研究的重要基础。
蛋白质的表达技术主要包括原核和真核表达系统。
原核表达系统包括大肠杆菌和酵母表达系统，这两种表达系统都具有高效的蛋白质表达能力，并且易于操作和大规模生产。
在酵母表达系统中，通常会将目的蛋白质基因插入到酵母表达载体中，然后通过转化酵母细胞实现表达。
大肠杆菌表达系统则是将目的蛋白质基因插入到大肠杆菌表达载体中，然后通过转化大肠杆菌细胞进行表达。
相比于酵母表达系统，大肠杆菌表达系统具有更高的表达速率，但表达的蛋白质常常是未折叠的形态，需要进一步的纯化和折叠过程。
真核表达系统则利用真核细胞本身的细胞器完成蛋白质的表达和折叠，这类表达系统可以用于表达大多数复杂的蛋白质。
例如，哺乳动物细胞表达系统（如CHO细胞和HEK293细胞）是利用哺乳动物细胞自身的蛋白合成机制进行表达的，这种表达系统通常会得到高质量的蛋白质，但生产成本相对较高。
对于高效的蛋白质表达来说，关键是基因的优化和载体的选择。
在基因的优化方面，通常会进行基因的序列优化、信号肽的选取、启动子的选择等操作，以提高蛋白质的表达量和纯度。
而载体的选择则需要根据具体的表达需求进行选择，例如对于大肠杆菌表达系统来说，常用的载体有pET系列载体和pBAD系列载体；对于酵母表达系统来说，常用的载体有pYES2和pGAPZ系列载体；对于哺乳动物细胞表达系统来说，常用的载体有pCDNA3.1和pEF系列载体。
在蛋白质的纯化方面，常用的方法有离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤等。
离子交换层析是利用离子交换树脂对带有带电的蛋白质进行分离，在这个过程中，可以通过改变洗脱缓冲液的pH或离子浓度来调节分离效果。
亲和层析则是通过利用蛋白质与其特异性配体之间的亲和性实现分离，例如亲和层析树脂中的金属离子会与带有多个组氨酸残基的蛋白质结合形成配位键，从而实现分离。
akta fplc技术参数
AKTA FPLC 技术参数简介AKTA FPLC（Fast Protein Liquid Chromatography）是一种高效的蛋白质液相层析技术，常用于生物分离纯化领域。
它结合了液相层析和色谱技术，能够快速、高效地分离和纯化复杂的生物样品。
本文将详细介绍AKTA FPLC的技术参数，包括仪器规格、操作参数以及应用范围等内容，以帮助读者更好地了解该技术并合理选择使用。
仪器规格AKTA FPLC系统由多个核心组件组成，包括色谱柱、泵、检测器、自动采样器和控制软件等。
以下是一些常见的AKTA FPLC系统规格：1.色谱柱：通常为不锈钢或玻璃制成，内径范围从1 mm到30 mm不等。
2.泵：提供流体输送功能，通常有单泵或双泵可选。
3.检测器：用于检测和监测样品组分的变化，包括紫外-可见（UV-Vis）检测器和荧光检测器等。
4.自动采样器：可选组件，用于自动注入和采样样品。
5.控制软件：提供仪器操作和数据处理功能，通常具有友好的用户界面。
操作参数AKTA FPLC系统的操作参数对于成功进行蛋白质分离和纯化非常重要。
以下是一些常见的操作参数：1.流速：可以根据需要调整，通常在0.1 mL/min到100 mL/min之间。
2.柱温：控制色谱柱的温度，通常在4°C到80°C之间。
3.柱压：衡量流体通过柱子时产生的压力，可根据实验需求进行调整。
4.洗脱梯度：通过改变洗脱缓冲液的成分和浓度来实现目标分离效果。
应用范围AKTA FPLC技术广泛应用于许多生物领域，尤其是蛋白质纯化。
以下是一些常见的应用范围：1.蛋白质纯化：AKTA FPLC系统可以高效地纯化复杂混合物中的目标蛋白质。
通过选择合适的色谱柱、优化洗脱梯度和检测器设置，可以实现高纯度和高产量的蛋白质纯化。
2.抗体纯化：AKTA FPLC系统可用于抗体的分离和纯化。
通过选择具有亲和力的色谱柱，如蛋白A或蛋白G，可以高效地富集目标抗体。
蛋白质浓缩与纯化技术
★ ★★★ 需要有机溶剂 中，有损失生
物活性的风险
宁馨阁
提示： 1、 通过组和各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一
个步骤的产物的洗脱条件应适宜于下一个步骤的起始条件。 2、 硫酸铵沉淀是常用的样品澄清和浓缩方法，所以 HIC 是捕获阶段的理想方法。 3、 GF 很适宜在由浓缩效应的方法（IEX、 HIC、 AC）后使用，凝胶过滤对上样体积有限
宁馨阁
前者进行反应时，配体（类似底物）是固相存在；后者进行反应时，底物呈液相存在。实质 上亲和层析是把具有识别能力的配体 L（对酶的配体可以是类似底物、抑制剂或辅基等）以 共价键的方式固化到含有活化基团的基质 M（如活化琼脂糖等）上，制成亲和吸附剂 M－L， 或者叫做固相载体。而固化后的配体仍保持束缚特异物质的能力。因此，当把围相载体装人 小层析柱（几毫升到几十毫升床体积）后，让欲分离的样品液通过该柱。这时样品中对配体 有亲和力的物质 S 就可借助静电引力、范德瓦尔力，以及结构互补效应等作用吸附到固相 载体上，而无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出来，并形成了第一个层析峰。 然后，恰当地改变起始缓冲 液的 PH 值、或增加离子强度、或加人抑③剂等因子，即可把 物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第 M 个层析峰（见图 6－2）。显然，通过这一操 作程序就可把有效成分与杂质满意地分离开。如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体 具有亲和力（其大小有差异）时，采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。用过 的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
宁馨阁
二．重组蛋白纯化的基本策略
来源： 生物谷 >> 实 验 >> 蛋白实验 >> 蛋白纯化 >>
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技术标部分
仪器名称：蛋白纯化系统
数量：1套原装进口设备
用途：适用于实验室从分析、小规模制备，到中试规模的工艺摸索和制备，可通过凝胶过滤、离子交换、亲和层析、羟基磷灰石、疏水层析等层析谱技术，进行蛋白质、肽类、多糖、核酸等生物大分子和中草药与天然产物活性成分的分离、纯化和制备。
技术指标：
1.原装进口产品
2. 系统泵
*全自动柱塞泵，双泵四泵头，每个泵头都有独立除气阀
*单泵流速：0.001-10 ml/min
最大流速：20 ml/min
流速准确度：±2%，流速精度：RSD＜0.5%
梯度精度: ±＜0.8%，流速范围：0. 25-10 ml/min
具备恒压调速功能
3. 紫外检测器
*检测范围：0 - 3AU
*线性：±2%
光源和流动池分开设计，避免光源过热对样品的影响
4. 电导检测
*检测范围：0.01 mS/cm－999 mS/cm
电导精确度：±0.01 mS/cm，实时自动检测
5. 温度检测
*温度范围：0 - 99 C
温度准确度：±1.5°C
6. 阀门
自动进样阀：1个，自动切换上样、进样和冲洗三个状态
出口阀组件：1个
自动柱位选择阀：1个，无需改变管路连接即可实现旁路及正反向洗脱功能
7. 组分收集器
收集方式：可根据体积、峰或时间自动收集
收集数目：≥100个
收集范围：0.1ml-50ml
具有滴感应器，防滴漏功能
流路：PEEK惰性材料（以保持蛋白活性）耐受有机溶剂
8. 软件
流路实时在现，实时监控和控制
内置层析柱和凝胶信息
具有自动积分、一键积分功能，操作简单，可打印结果报告
9. 配件
上样环：500um，1ml，5ml各一个
预装柱，包含His标签亲和介质等
PH计
10. 配套电脑参数
4核处理器、内存8 GB，独立显卡4G显存、硬盘1 TB，可刻录光驱，24寸的高清显示器
11. 技术支持
技术人员和甲方人员一起设计教学实验，并定期参与相关实验课程。