第六章 核酸序列分析

微卫星DNA（Microsatellite DNA）又称短串联重复或简单重复序列，
微卫星筛选流程筛选
从有关数据库（GenBank, EMBL 等）或文章中查询 构建基因组 筛选SSR位点 使用近缘种的引物
获得引物
PCR扩增
（基于PCR与限制性酶切技术结合的DNA标记） ④AFLP（amplified fragments length polymorphism）标记：扩增
1:3~4)。
少一个-OH
双脱氧核苷三磷酸
互补链合成过程
如果在DNA的合成反应中，除了加入 4种正常的脱氧核
苷三磷酸（dNTP）外，再加入一种少量的2’,3’-ddNTP，那 么多核苷酸链的延伸将与偶然发生但却十分特异的链终止展 开竞争，所以反应产物是一系列的长短不一的核苷酸链。
在 4 组 独 立 的 DNA 合 成 反 应 中 ， 分 别 加 入 4 种 不 同 的
段，测序获得SNP位点信息，适于调查未知SNP位点和连续分
布（1kb以内）的SNP位点信息。 • 直接测序法进行SNP分析
•
PCR-限制性酶切：如果某个SNP位点恰好是限制性酶切位点，
则通过PCR酶切再结合电泳分析不失为一种简单经济的区分方 法，适于单个的SNP位点分析。
PCR-SSCP：

单链构象多态性检测（Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP）是一种基于DNA构象差别来检测
二、DNA序列测定
即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项 重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个 氨基酸的序列测定。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert 等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法 和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到 “直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测 定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质 氨基酸的序列。
（基于PCR的DNA标记：特异引物PCR标记）
③SSR（simple sequence repeats)标记:简单重复序列多态性。
最先是1泛存在于各类真核生物的基因组中。 微卫星DNA是由一段DNA简单重复模块串联组成的长达几十个核苷 酸的重复序列，重复单位为数个核苷酸长度的序列，重复次数从几次到 几十次不等，重复总长度一般小于100个碱基对。目前广泛研究和应用的 微卫星重复单位为2～4个核苷酸。 单一型：ATATATATATATATATATATATAT 复合型：ATATATCACACACACACACAC 间断型：ATATATCA ATATATCA ATATATA
Maxam-Gilbert化学裂解法
化学裂解法是Maxam和Gilbert等人1977年创建的，用来 测定DNA序列。化学法是用化学试剂在A、G、C、T处特定地 裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1）， 经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。 某些试剂能修饰或破坏DNA链上特定核苷酸的碱基进而使 N-糖苷键断裂，暴露出的糖环以β-消除反应，在3’和5’位上断

DNA长度多态性分析
（基于DNA-DNA杂交的DNA标记） ① RFLP标记 (restriction fragment length polymorphism)： DNA某一位点上的变异有可能引起该位点特异性的限制性内切 酶识别位点的改变，包括原有位点的消失或出现新的酶切位点，致 使酶切片段长度随之发生变化。这种变化引起的多态现象即为限制
Maxam & Gilbert DNA化学降解法
杂交法SBH（Sequencing by hybridization）
• 如果一段较短的DNA探针能与较长的DNA片段杂交，并形 成完全的双链结构，我们就推测在靶DNA上存在着相应的 互补序列，这就是DNA杂交测序法的基本原理。如果将一 种12-mer的靶DNA与完全随机合成的8-mer寡核苷酸控针混 合杂交，在总数为48=65536种8-mer的控针群体中，仅有？ 种探针会与靶DNA杂交，形成完全互补的双链分子。
片段长度多态性。通过对基因组DNA酶切片段的选择性扩增来检测 DNA酶切片段长度的多态性。AFLP揭示的DNA多态性是酶切位点和其 后的选择性碱基的变异。AFLP 原理 AFLP技术的优点是该技术结合了RFLP的稳定性和PCR技术 的高效性，又同时克服了RFLP带型少，信息量小以及RAPD标记 对条件比较敏感的缺点。
其他DNA全自动分析仪：
310型全自动遗传分析仪
ABI Prism® 3100遗传分析仪
3700型全自动遗传分析仪
安玛西亚DNA序列分析系统型号： MegaBACE 500/1000/4000
DNA自动测序与手工测序的不同点
1、标记物不同：手工测序采用放射性核素标记，而自动测序采
用4种荧光染料分别标记ddNTP或标记引物
一为疾病的诊断。通过
RFLP技术，并与正常人的 RFLP测定结果比对，能够
确定某种疾病状态下特有的
RFLP特异性疾病标记。 因此，通过特异性疾病 标记的分析，能够对某种疾 病进行分子诊断。
RFLP应用举例：地中海贫血
• 地中海贫血是一种常染色体遗传性溶血性贫血，是世界上最常见和发生率 最高中的一种单基因遗传病。
12-mer的靶DNA序列：
AGCCTAGCTGAA
探运 针用 八 聚 体 靶DNA的互补序列
微型高密度寡核苷酸点阵的制备
DNA测序自动化和大规模测序
• 特点 • 原理同末端终止法
• 标记物为荧光染料
• 激光扫描自动测序 • 结果清晰、准确、分辨率高 • 测序速度快 200bp/h
第一步：加入复制终止剂
裂磷酸二酯键。使戊糖脱落，用于嘌呤环的试剂是硫酸二甲酯，
而联氨可用于肼解嘧啶环。4种核苷酸的特异裂解和鉴别方法 如下：
碱基特异性修饰及裂解
反应体系 G G+A
碱基修饰试剂 碱基修饰反应 主链氢吡啶
断裂点 G G和 A
C+T
C
肼
肼（加盐）

单核苷酸多态性，主要是指基因组水平上由单个核苷酸的变异 所引起的DNA顺序多态性。它是人类可遗传变异中最常见的 一种，占所有已知，多态性的90％以上。估计人类基因组中有 300万个，平均1个SNP/500-1000个碱基。

SNP既可存在于基因顺序内，也可存在一基因以外的非编码顺 序中。存在于编码顺序中的SNP虽然较少，但其在遗传疾病研 究中却具有重要意义。相当一部分SNP直接或间接地与个体间 的表型差异、人类对疾病的易感性和抵抗能力有关，因此，对 SNP的研究越来越受到人们的关注。
• 地中海贫血是由于珠蛋白肽链合成障碍所致，出现一种或几种珠蛋白肽链 数量不足或完全缺乏，从而造成这种珠蛋白链参与的血红蛋白合成量的减 少。其中α珠蛋白链合成受抑者，叫做“α地中海贫血”；β珠蛋白链合成 受抑者，叫做“β地中海贫血”。 • 在α-基因的突变中，以缺失型突变最为常见。α-基因的另一突变即为点突 变，β-基因的突变以点突变为主，亦有碱基的插入和缺失。
点突变的方法。相同长度的单链DNA，如果碱基序列不同，
形成的构象就不同。

DNA片段呈复杂的空间折叠构象，主要是由其内部碱基配
对等分子内相互作用力来维持的，当有一个碱基发生改变
时，会或多或少地影响其空间构象，使构象发生改变。

空间构象有差异的单链DNA分子在聚丙烯酰胺凝胶中受排 阻大小不同，这样就形成了单链构象多态性。
第二步：荧光检测
分析仪器的新发展：
377型遗传分析仪
377 型DNA 全自动测序仪采用经典的聚丙烯酰胺凝胶的电泳方式, 结合美国应用生物系统公司专利的四色荧光标记, 激光检测, 一个泳道检 测的方法, 具有测序结果准确性好, 精度高, 操作简便快速等特点, 已成为 全球应用最多最广泛的全自动DNA 测序仪之一。
（单核苷酸多态性的DNA标记）
⑤SNP（single nucleotide polymorphism）标记:
单核苷酸多态性。不同个体基因组DNA序列同一位置上的 单个核苷酸的差别。其比较的不是DNA的片段长度，而是相同 序列长度里的单个碱基的差别。
SNP检测方法
•
PCR-测序法：最经典的方法，通过PCR扩增包含SNP位点的片
第六章 核酸序列分析
一、核酸多态性分析
尽管在种内或种族内绝大部分的基因组序列是 保守的，但所有基因组中都天然存在有多态性区域，
可以用来鉴别每个个体。
个体遗传物质DNA的多态性 个体呈现出多态现象
DNA多态现象以孟德尔共显性遗传方式传递

长度多态性 位点多态性
长度多态性：数目可变的串联重复序列(variable number of tandem repeat，VNTR)多态性
性片段长度多态性。
对RFLP的检测主要是用Southern杂交的方法进行，即利 用限制酶酶解及凝胶电泳分离不同生物体的DNA分子，然后 用经标记的特异DNA探针与之杂交，通过发射自显影或非同
位素显色技术来揭示DNA的多态性。
电泳 DNA样品限制酶酶解
Southern blot
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RFLP技术重要应用之
ddNTP ，结果将生成 4组核苷酸链，它们将分别（随机）终 止于每一个A，每一个G，每一个C，每一个T的位置上。对 这4组核苷酸链进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，就可读出序列。
Sanger双脱氧测
序方法示意图
http://v.youku.co m/v_show/id_X MjUxOTA2MjA0 .html
• 地贫的产前诊断目前一般采用限制性长度多态性（RFLP）方法进行。
②RAPD（random amplified polymorphic DNA） 标记：