平板菌落计数法操作步骤(精)
平板菌落计数法测定菌落总数的原理
平板菌落计数法测定菌落总数的原理1.准备琼脂培养基：将琼脂溶解在适当的营养液中，调整pH值，加热使其融化，然后冷却到约45-50℃。
2.预培养：将培养物从深层培养基中接种到含有一定营养液的试管中预培养，为后续培养做准备。
3.稀释：将预培养液根据菌落数量的预估结果进行适当稀释，使菌落分散。
4.接种：取适量稀释液，均匀地倒入装有琼脂的培养皿中，使培养基均匀铺满。
5.均匀涂布：将接种液均匀涂布于琼脂表面，避免产生气泡和划痕。
6.培养：将培养皿倒置，放在恒温箱中适当温度下培养一定时间，通常为24-48小时。
7.计数：在培养后的琼脂表面，用裸眼或放大镜观察并计数菌落，然后根据稀释倍数计算出原始菌落的总数。
1.琼脂培养基：通过熔化琼脂和添加适当的营养物，可以提供菌落生长所需的碳源、氮源等营养物质，以及适当的pH值和培养温度，使菌落能够在琼脂表面生长。
3.琼脂的稀释：通过适当的预估或实际试验，将预培养液稀释到合适的程度，使得在琼脂表面上的每个菌落之间有足够的距离，以防止菌落间的交叉叠加。
4.菌落计数：在培养后的琼脂表面，可以用裸眼或放大镜观察，计算出每个培养皿上的菌落数量。
根据稀释倍数，可以推算出原始菌落的总数。
1.简单易操作：操作方便，不需要复杂的设备和技术。
2.适用范围广：可用于测定各种微生物菌落总数，如细菌、真菌等。
3.直观准确：直接观察和计数菌落，结果客观准确。
4.含量测定：可以用于测定菌落的含量，有助于了解微生物的数量变化。
然而，平板菌落计数法也存在一些限制和注意事项：1.培养条件：受到琼脂培养基成分和条件的限制，一些微生物可能无法在琼脂表面生长。
2.杂菌干扰：在一些情况下，培养基表面可能有一些自然存在的杂菌或非细菌生物，这些杂菌可能会干扰菌落计数结果的准确性。
3.受限于稀释倍数：琼脂培养基的稀释倍数对菌落数量的计算有一定影响，过高或过低的稀释倍数可能会导致计数结果的误差。
4.菌落大小：一些微生物菌落较小或较大，可能会对计数结果产生一定的影响，需要注意估算和计数的准确性。
平板菌落计数法的步骤
平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，通过稀释液体样品、平铺在琼脂平板上、培养和计数菌落数量，可以确定原液中微生物的浓度。
这种方法可以应用于食品、环境和医药等领域的微生物数量测定，为微生物研究和质量控制提供了重要的手段。
平板菌落计数法的基本步骤如下：
1、准备无菌的培养基、试管、吸管、平皿、酒精灯等器材，以及待测的样品和适合的稀释液（如无菌水或盐水）。
2、将样品制成一系列的稀释液，通常采用10倍递增的稀释法，即每次取1mL的上一级稀释液加入9mL的稀释液中，充分混匀，得到下一级稀释液。
3、从每个稀释液中分别取出一定量（如0.1mL或1mL）置于灭菌平皿中，与已熔化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，或者涂抹在已凝固的琼脂培养基上，使菌液均匀分布于培养基内。
4、在一定的温度下，培养一定的时间（通常为24至48小时），使菌液中的单个细胞生长繁殖成可见的菌落。
5、从每个平皿中计数菌落数量，选择菌落数在30至300之间的平皿，用计数器或计数板辅助计数，避免重复或遗漏。
6、根据计数结果和稀释倍数，计算原液中的菌落数量和浓度，通常用每毫升或每克的活菌数（CFU/mL或CFU/g）表示。
《平板菌落计数法》
❖ 三．作业： ❖ 计算菌体含量(单位:cfu/mL)。
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三.实验步骤
❖ 3．加样倒平板：
❖ 用不同的灭菌吸管分别吸取10-4、10-5、10-6稀 释液1ml，分别注入3个灭菌培养皿中。分别立 即倾注约15ml已熔化并冷却到45Ċ左右的牛肉膏 蛋白胨培养基，并立即在桌面上作平面旋摇，使
水样与培养基充分混匀（每稀释度做3个）。另 取一空的灭菌培养皿，倾注牛肉膏蛋白胨培养基
15ml，做空白对照。培养基凝固后，倒置于
37℃温箱中培养。
精选课件Βιβλιοθήκη 三.实验步骤❖ 4．计数 ❖ 培养24-48h后，取出培养平板，并按下
列公式进行计算： ❖ 每毫升中菌落形成单位（cfu）=同一稀
释度的平均菌落数x稀释倍数 ❖ 注： 一般选择每个平板上长有30-300个
菌落的稀释度计算每毫升的含菌量较适精宜选课件。
微生物学实验
实验八 微生物检测
执教 单位
刘森林
生命科学学院
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实验目的 ❖ 学习平板菌落计数法。
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实验原理
精选课件
三.实验步骤
❖ 1．编号 ❖ 取无菌平皿9个，分别用记号笔标明10-4、10-5、10-6（稀释度）各
三套。另取6支试管，加入9ml无菌水，依次标明10-2、10-3、10-4、 10-5、10-6。 ❖ 2．稀释 ❖ 水样：用1ml无菌试管吸取1ml样品精确加入加有9ml无菌水的10-1 的试管中，此即为10倍稀释。将10-1试管振荡，使其充分混匀。用 另一吸管吸取10-1菌液1ml，精确加入0.5ml至10-2试管中，此即为 100倍稀释。其余10-3、10-4、10-5、10-6依次类推。 ❖ 固体样品：准确称取10g上午膜样，加入90ml无菌水中，充分混匀 后即为10倍稀释。将10-1试管振荡，使其充分混匀。用另一吸管吸 取10-1稀释液1ml，精确加入0.5ml至10-2试管中，此即为100倍稀 释。其余10-3、10-4、10-5、10-6依次类推。
平板计数法
平板菌落计数法平板菌落计数法，是种统计物品含菌数的有效方法。
方法如下：将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液涂布到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞；统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
目录一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明一、菌落总数介绍：二、检验方法三、说明展开但是，由于待测样品往往不宜完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（cfu ：colony-forming units），而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
[1]编辑本段一、菌落总数介绍：菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。
菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。
按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37℃培养48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。
因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。
菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。
菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。
编辑本段二、检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的10倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出1mL置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养一定时间后（一般为48小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每ml）原始样品中所含细菌菌落总数。
菌落总数检验步骤
菌落总数检验步骤第一法平板菌落计数法6 操作步骤6.1 样品的稀释6.1.1 固体和半固体样品：称取25g 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，5 000r/min~10 000r/min 均质1 min~2 min ，或放人盛有225 mL 稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min~2 min ，制成1：10 的样品匀液。
6.1.2 液体样品：以无菌吸管吸取25 mL 样品置盛有225 mL 磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1 ：10 的样品匀液。
6.1.3 用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1：10 样品匀液1 mL ，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用一支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1：100 的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3 操作程序，制备10 倍系列稀释样品匀液。
每递增稀释一次，换用一次1 mL 无菌吸管或吸头。
6.1.5 根据对样品污染状况的估计，选择2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液）, 在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液加人两个无菌平皿内。
同时分别取1 mL 稀释液加人两个无菌平皿作空白对照。
6.1.6 及时将15 mL~20 mL 冷却至46 ℃的平板计数琼脂培养基（可放置于46 ℃±1 ℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。
6.2 培养6.2.1 琼脂凝固后，将平板翻转，36 ℃±1 ℃培养48h±2h 。
水产品30 ℃±1 ℃培养72h±3h.6.2.2 如果样品中可能含有在琼脂培养基表面弥漫生长的菌落时，可在凝固后的琼脂表面覆盖一薄层琼脂培养基（约4 mL ) ，凝固后翻转平板，按6.2.1 条件进行培养。
08 平板菌落计数法应用
三、器材
酵母菌悬液， 牛肉膏蛋白胨培养基， 1mL无菌吸管 无菌平皿 盛有9 mL无菌水的试管
四、操作步骤
1．编号： 取无菌平皿 8套，在皿底分别标记10-5、10-6 、10-7、10 8各2套。（不得开盖，） 取1只装有99mL无菌水的三角瓶1只，标明10-2。 另取6支盛有9mL无菌水的试管，排列于试管架上，依次 标记10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8。
实验八 平板菌落计数法
一、目的要求 学习平板菌落计数的基本原理和方法。 二、基本原理 平板菌落计数法是根据微生物在固体培养基 上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成 的现象进行的，也就是说一个菌落即代表一个 单细胞。计数时，先将待测样品作一系列稀释， 再取一定量的稀释菌液接种到培养皿中，使其 均匀分布于平皿中的培养基内，经培养后，由 单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目， 即可换算出样品中的含菌数。
灭菌:轮流值守
摆放斜面试管:
土壤及细菌原液稀释:土壤稀释分离 倒平板:每人3个,分离用2个,计数用1个. 接种:平板菌落计数每人一只平板.土壤稀释分离: 每人划2个平板,放线菌和霉菌各一个.
培养:细菌37℃;放线菌,霉菌28℃(分开放置)
观察,分离和计数:平板菌落计数48小时后;放线菌和 霉菌接种3天后开始 形态观察:一周后.
5．计数 培养24小时后，取出培养皿，算出同一稀释度 两个平皿上的菌落平均数，并按下列公式进行计 算： 每毫升中总活菌数=同一稀释度两次重复的菌落 平均数×稀释倍数
四
实验结果
填表
一般选择每个平板上长有30—300个菌落的稀释度计算每毫 升的菌数最为合适。 同一稀释度的两个重复的菌数不能相差很悬殊。 不同稀释度计算出的每毫升菌液中总活菌数也不能相差悬 殊，如相差较大，表示试验不精确。
微生物学 实验三 平板菌落计数法
实验三平板菌落计数一、目的要求学习菌种的平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2～3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低，为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位（colony-forming units,cfu）而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。
平板菌落计数法虽然操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是该计数方法的最大优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验（如活菌制剂），以及食品、饮料和水（包括水源水）等的含菌指数或污染程度的检测。
三、器材1 ．菌种：大肠杆菌菌悬液。
2 ．培养基：LB培养基。
3 ．仪器或其他用具： 1ml 无菌吸管，无菌平皿，盛有 4.5ml 无菌水的试管，试管架，恒温培养箱等。
四、操作步骤1 ．编号取无菌平皿 9 套，分别用记号笔标明 10-4、 10-5、 10-6（稀释度）各 3 套，另取 6 支盛有 4.5ml 无菌水的试管，依次标是 10-1、 10-2、 10-3、 10-4、 10-5、10-6。
2 ．稀释用 1ml 无菌吸管吸取 1ml 已充分混匀的大肠杆菌菌悬液（待测样品），精确地放0.5ml 至 10-1的试管中，此即为 10 倍稀释。
将多余的菌液放回原菌液中。
将 10-1试管置试管振荡器上振荡，使菌液充分混匀。
另取一支 1ml 吸管插入 10-1试管中来回吹吸菌悬液三次，进一步将菌体分散、混匀。
吹吸菌液时不要太猛太快，吸时吸管伸入管底，吹时离开液面，以免将吸管中的过滤棉花浸湿或使试管内液体外溢。
实验十二 平板菌落计数法和光电比浊计数法
三、水产养殖水质净化、水产养殖水环境净化和水 产养殖池底净化处理处恶臭等。 功效：
• 1、快速分解水体中的残饵，粪便，死藻等，维护水质，有效 预防泛塘和鱼虾病害，减少换水量。 • 2、降解形成的小分子有机物及矿物质能促进藻类、原生动物 等的生长，为鱼虾提供活体饵料。 • 3、在水体中形成有益菌优势群种，抑制有害细菌的繁殖，维 持水体中的微生态环境平衡。 • 4、枯草芽孢杆菌本身是安全，有益的微生物，动物食入适量 菌体后，能减少鱼虾病害，提高鱼虾对饵料的消化吸收效率。 • 5、增强鱼虾的消化吸收功能，使其充分吸收利用饲料中营养 成分及天然色素，增强其天然着色度和使用风味，使鱼虾色泽 鲜亮。
二、基本原理——光电比浊计数法
当光线通过微生物菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用 使光线的透过量降低。在一定的范围内，微生物细胞浓度 不透光度成反比，不光密度成正比，而光密度或透光度可 以由光电池精确测出。 用一系列已知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度—— 菌数标准曲线。然后，就可以以样品液所测得的光密度， 从标准曲线中查出对应的菌数。 制作标准曲线时，菌体计数可采用血细胞计数板计数、平 板菌落计数或细胞干重测定等方法。本实验采用平板菌落 计数法。
2、平板菌落计数：
（1）编号：取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套， 另取6支无菌试管，装入4.5mL无菌水，依次标记为10-1、10-2、 10-3、10-4、10-5、10-6； （2）稀释：任选一支上述盛有已测OD值的菌悬液的试管，如1号试 管，精确地取0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释。将10-1的 试管振荡混匀。另换一支吸头插入10-1试管中来回吹吸菌液三次， 进一步将菌体分散、混匀。再用此吸管精确吸取10-1菌液0.5mL至 10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推； （3）取样：用移液器分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各 0.2mL ，对号放入编好号的无菌平皿中； （4）倒平板：尽快向上述盛有丌同稀释菌液的平皿中倒入融化后 冷却至45℃的牛肉膏蛋白胨培养基约20mL，置水平位置迅速旋动 平皿，使培养基不菌液混合均匀； （5）培养：待培养基凝固后，平板倒置于37℃培养箱中培养48h；
平板菌落计数法操作方法
平板菌落计数法操作方法
平板菌落计数法是一种常用的微生物计数方法，可用于定量测定空气、水、食品、药品等样品中的微生物菌落数量。
下面是平板菌落计数法的操作方法：
1. 准备培养基：选择适合待测微生物培养的培养基，如琼脂培养基、营养琼脂等。
按照培养基说明书的方法制备好培养基，并进行无菌处理。
2. 样品处理：将待测样品进行适当的预处理，如对液体样品可进行稀释，对固体样品可进行悬浮、研磨等处理，以保证样品均匀分散。
3. 平板接种：取适量的样品处理液，将其均匀地倒入已经凝固的培养基平板上，并用无菌棉签进行均匀涂抹，使样品和培养基充分接触。
4. 培养条件：将接种好的平板在适当的温度和湿度条件下进行培养，一般为37下培养24-48小时。
5. 统计菌落：培养结束后，观察平板上的菌落形成情况，对于较多菌落的平板，可以选择在菌落较少的区域进行计数。
使用放大镜或更高倍数显微镜对菌落进行统计。
6. 计算菌落数：根据统计的菌落数，可以根据所用的稀释倍数和接种体积计算出样品中的微生物菌落数量。
需要注意的是，平板菌落计数法需要仔细控制培养条件和接种技术，以减少误差。
同时，对于存在过多重叠菌落的情况，可能需要进行进一步的稀释和计数。
微生物的平板菌落计数法
<实验十三微生物的平板菌落计数法>一、实验目的学习微生物的平板计数法。
二、原理概述微生物的稀释平板计数是根据在固体培养基上所形成的一个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成，且肉眼可见的子细胞群体这一生理及培养特征进行的。
也就是说一个菌落即代表一个单细胞。
计数时，首先将待测样品制成均匀的一系列不同稀释液，并尽量使样品中的微生物细胞分散开来，使成单个细胞存在( 否则一个菌落就不只是代表一个菌 ) ，再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。
经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数，一般用于某些成品检定 ( 如食品等 ) 、生物制品检定、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检定。
三、实验器材1 、待测样品、所需各类培养基2 、天平、称样瓶、记号笔、容量瓶、无菌生理盐水、 1ml 和 5ml 无菌移液管、无菌平板、无菌试管四、操作步骤和内容1 、样品稀释液的制备准确称取待测样品 10g 或 10ml ，放入装有 90ml 无菌水并放有小玻璃珠的 250mL 三角瓶中，用手或置摇床上振荡 20min ，使微生物细胞分散，静置约 20-30s ，即成 10 -1 稀释液；再用 1ml 无菌吸管，吸取 10 -1 稀释液 1ml 移入装有 9ml 无菌水的试管中，吹吸 3 次，让菌液混合均匀，即成 10 -2 稀释液；再换一支无菌吸管吸取 10 -2 菌液 1mL 移入装有 9ml 无菌水试管中，即成 10 -3 稀释液；以此类推，一定要每次更换吸管，连续稀释，制成 10 -4 、 10 -5 、 10 -6 、 10 -7 、 10 -8 等一系列稀释度的菌液，供平板计数使用 ( 如图 13 － 1) 。
图 13 － 1 平板计数法中样品的稀释和稀释液的取样用稀释平板计数时，待测菌稀释度的选择应根据样品确定。
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平板菌落计数法
一、目的要求
学习平板菌落计数的基本原理和方法。
二、基本原理
平板菌落计数法是将等测样品经适当稀释后，其中的微生物充分分散为单个细胞，取一定量的稀释液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成的肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2~3或更多个细胞。
因此平板菌落计数的结果往往偏低。
现在常使用菌落形成单位。
该计数法的缺点是操作较繁，结果需要培养一段时间才能取得，而且测定结果易受多种因素的影响，但是这种计数方法最大的优点是可以获得活菌的信息，所以被广泛用于生物制品检验，以及食品、饮料和水等含菌指数或污染度的检测。
三、器材
大肠杆菌悬液，LB琼脂培养基，1mL、5mL无菌吸管，无菌平皿，无菌水，无菌试管，试管架和记号笔等。
四、操作步骤
1、编号
取无菌平皿9套，分别标明为10-4、10-5、10-6各三套，另取6支无菌试管分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。
2、稀释
用1mL无菌吸管吸取1mL已充分混匀的大肠杆菌菌悬液，精确地放0.5mL至10-1的试管中，此即为10倍稀释，将多余的菌液放回原菌液中。
将10-1试管充分振荡、混匀。
另取一支1ml吸管插入10-1试管中来回吹吸菌液三次，进一步将菌体分散、混匀。
动作不要太猛太快，吸时插入，吹时提出，再用此吸管吸取10-1菌液1mL，精确地放0.5mL至10-2试管中，此即为100倍稀释，依次类推，
3、取样
用三支1ml无菌吸定分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌悬液各1mL，对号放入编好号的无菌平皿中，每个平皿放0.2mL
4、倒平板
尽快向上述盛有不同稀释菌液的平皿中倒入融化后冷却至45度的LB培养基约15-20ml，置水平位置迅速旋动平皿，使培养基与菌液混合均匀。
5、培养
倒置于37度培养箱中培养48小时，
6、计数
算出同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算；
每毫升中菌落形成单位（cfu）= 同一稀释度三次重复的平均菌落数×稀释倍数×5
五、实验报告
1、结果
将培养后菌落计数结果填入下表：
2、思考题
(1)为什么溶化后的培养基要冷却至45℃左右才能倒平板？
(2)要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？
(3)同一种菌液用血球计数板和平板菌落计数法同时计数，所得结果是否一样？为什么？
(4)试比较平板菌落计数法和显微镜下直接计数法的优缺点。